Biochimica delle trasformazioni alimentari

Quantificazione proteine

Metodi di determinazione delle proteine

Determinazione dell'azoto totale

Si trasforma attraverso una reazione l’azoto in un composto misurabile.

• Metodo di Kjeldahl: Si decompone l’azoto a ione ammonio e poi si procede alla distillazione dove l’ammoniaca prodotta dalla reazione tra lo ione ammonio e una base forte viene condensata in ammoniaca gassosa e fatta fluire in una soluzione contenente acido forte. Dopodiché avviene la titolazione dove alla specie viene aggiunto l’acido solforico e si decompone la sostanza in solfato d’ammonio. La soluzione ottenuta viene resa alcalina con aggiunta di NaOH che trasforma lo ione ammonio in ammoniaca.

Gli aspetti positivi sono l’ampia utilizzazione e quindi va a rappresentare uno standard, è applicabile ad ogni materiale, è preciso e riproducibile. Di contro, tale metodo determina tutto l’azoto, e non solo quello derivante da proteine (ammoniaca, urea, acidi nucleici). Infatti, ogni tipo di proteina richiede un diverso fattore di conversione (proteine per carne, latte, cereali, legumi, ecc), data la diversa composizione amminoacidica. Il metodo inoltre è laborioso, lungo e non automatizzabile, richiede composti chimici aggressivi, utilizzati a temperature elevate.

La esametilentetrammina, ottenuta dalla condensazione di formaldeide e ammoniaca, è un antibatterico rinvenuto in campioni di latte di provenienza cinese, che risultava avere una quantità proteica molto elevata.

• Metodo di Dumas: Il campione viene ossidato con ossigeno ad alta temperatura (900°C) in presenza di He come gas carrier, portando al rilascio di CO₂, H₂O e N₂. Opportune colonne di assorbimento rimuovono CO₂ e H₂O dalla miscela di gas. Il rimanente N₂ passa attraverso ad una colonna cromatografica, dotata di un detector a conduttività termica, il segnale del detector è convertito.

I vantaggi di tale metodo sono la rapidità (meno di 40 minuti), non richiede catalizzatori o acidi forti, è facile da utilizzare e si presta ad essere automatizzato. Di contro il costo di investimento è elevato, tale metodo non misura direttamente le proteine ma ogni forma di azoto ridotto, il fatto che sia sufficiente una campione ridotto può creare problemi di rappresentatività per quanto riguarda composti eterogenei.

Metodi legati alla spettroscopia (UV/NIR)

• NIR (vicino infrarosso): Si è notato che se si colpisce un campione della zona del NIR si ottiene un determinato spettro, che è la somma di una serie di vibrazioni che vengono prodotte dai vari gruppi chimici presenti all’interno del campione (C-O, N-H, O-H). Si comparano poi gli spettri ottenuti con gli spettri standard e si verifica la quantità in cui sono presenti all’interno dell’alimento.

I pro di questo metodo sono che non si necessita di nessuna preparazione del campione (si inserisce l’alimento direttamente nel macchinario), non si ha nessuno scarto, non sono richieste particolari abilità dell’operatore, l’analisi è molto veloce (1 minuto), si può effettuare un’analisi simultanea di “multiple-components” e si ha la possibilità di analizzare campioni variabili. I limiti significativi sono in termini di precisione e accuratezza; infatti, viene utilizzato per verifiche rapide come, ad esempio, nell’accettazione delle materie prime, serve uno strumento differente per ogni materiale (le rette di calibrazione cambiano in base al materiale utilizzato) e la quantità di campione richiesta è consistente.

• UV: Metodo basato sulla misurazione dell’assorbanza nello spettro dell’UV, si basa sul fatto che alcuni amminoacidi (soprattutto aromatici come triptofano) hanno un picco di assorbimento a 280 nm. Questo metodo distingue le proteine da altri composti. La concentrazione si deriva poi dall’estinzione molare tabulata, che dipende dal contenuto della tale proteina in amminoacidi visibili con spettro UV. Il massimo a 220 nm dipende dal legame peptidico. Per quanto riguarda gli acidi nucleici hanno un picco a 260 nm per via dei sistemi aromatici nelle basi azotate.

I vantaggi sono che è un metodo molto rapido, molto sensibile (valutazioni con proteine equivalenti o proteine triptofano equivalenti). I limiti sono che bisogna tener conto dei componenti che assorbono a 280 nm, ma il principale limite è che si necessita di un campione limpido e solubile, poiché in caso contrario il macchinario leggerebbe la torbidità.

Riduzione o complessazione con metalli (da Cu²⁺ a Cu¹⁺)

Sfruttano la proprietà delle proteine di complessare i metalli e creare successivamente dei composti colorati, che vengono quantificati: quindi, maggiore è la colorazione, maggiore è la quota di proteine presenti.

• Biureto: Metodo semplice che si basa sul fatto che in presenza dello ione rame (Cu²⁺), il biureto crea complessi con le proteine. Tanto maggiore è l’assorbanza (550 nm) e quindi la colorazione, tanto maggiori saranno le proteine. Sono però presenti delle problematiche come interferenze con zuccheri, lipidi, detergenti e composti riducenti, non creando più la colorazione, inoltre il metodo è poco sensibile.

• Folin e Lowry: Come il metodo del biureto ma più sensibile, funziona con lo stesso principio ma il complesso che si forma viene ridotto da un reattivo (Folin-Ciocalteu) che è costituito da fosfomolibdotungstato in soluzione acida, formando una colorazione diversa che si legge a 750 nm. I vantaggi rispetto al biureto sono che con tale reattivo si aumenta la sensibilità, ma ha le stesse problematiche di interferenza e il reattivo risulta instabile.

• BCA: Anche questo metodo è simile ai precedenti, ma per la riduzione del rame si utilizza un reattivo differente, ovvero un acido (acido biciconinico). La proteina forma un complesso con il Cu¹⁺ dopodiché il rame viene ridotto a Cu²⁺ che si andrà a legare all’acido biciconinico (complesso colorato). Il vantaggio è che tale metodo è sensibile come il Lowry, ma i reattivi sono più stabili, i problemi risultano essere però uguali ai metodi precedenti.

Dye binding

Il Coomassie Brillant Blue è un colorante che quando si associa con una proteina passa da una colorazione grigio-marrone, ad una colorazione blu. Tali metodi si basano quindi sullo shift ipercromico, ovvero una variazione nello spettro di assorbimento di un colorante, quindi una variazione di colore (picco a circa 600 nm). Tra il colorante e la proteina sono presenti delle interazioni deboli come legami idrofobici e interazioni elettrostatiche.

• Confronti con BCA: In concentrazioni minori il Bradford è molto più sensibile del BCA, ma ad una certa concentrazione la crescita di assorbanza raggiunge il plateau, quindi dopo il limite il metodo BCA è più sensibile, poiché ha una maggiore linearità, al contrario del metodo precedente che ha una crescita esponenziale ma poi una crescita molto limitata.

Derivatizzazione

Si sfrutta la capacità di proteine di legare (legame covalente) con altri composti (reattivi) e creare delle colorazioni. I composti reattivi si vanno a legare al gruppo amminico, viene quindi sfruttato largamente anche sugli amminoacidi, formando poi composti colorati o fluorescenti.

Interferenze tra metodi e composti

Se nel campione sono contenuti detergenti, il metodo Bradford risulta essere inefficiente poiché, data la presenza di interazioni elettrostatiche e idrofobiche, possono crearsi dei legami tra il reattivo e tali detergenti. Nel caso in cui siano presenti agenti riducenti, è invece il metodo BCA a essere inefficiente, poiché tali agenti riducenti andrebbero a ridurre il rame non rendendolo più riducibile dalla proteina.

Accorgimenti operativi

Tali accorgimenti operativi sono necessari poiché le analisi su matrice alimentare andrebbero a rilevare dei componenti non proteici essendo tali matrici complesse. Quindi nella matrice alimentare sono presenti dei componenti che non dovrebbero essere rilevati dall'analisi poiché potrebbero andare a compromettere il risultato. Per effettuare quindi un'analisi precisa bisogna agire come di seguito:

• Separare proteine da altri componenti (solubili), in grado di reagire aspecificamente con i composti utilizzati nei vari metodi colorimetrici.
• Separare proteine da peptidi ed altri composti azotati di piccole dimensioni.

Il metodo più semplice e pratico è ricorrere alla precipitazione con acidi caotropi come sulfosalicilico, tricloroacetico e perclorico. Tali acidi sono tutti forti, hanno funzioni elettron-attrattrici quindi facilitano il distacco del protone. Producono anioni poco solvatati che sono in grado di penetrare all’interno della struttura delle proteine, distruggendo le interazioni ioniche, consentendo l’esposizione di superfici idrofobiche al solvente (denaturazione delle proteine). Le superfici idrofobiche esposte tendono ad interagire tra di loro, formando aggregati, troppo grossi per restare solubili, ottenendo una facile separazione delle proteine da ciò che non è proteina.

Anioni e cationi sono ordinati in base alla loro affinità per l’acqua chiamata “serie di Hofmeister”: gli acidi caotropi hanno tutti anioni lipofili. La precipitazione con tali acidi è molto funzionale:

• Con proteine ricche in amminoacidi idrofobici.
• A concentrazioni proteiche ragionevolmente elevate (> 0.05 g/L).
• In assenza di detergenti e altre sostanze come l’urea, che possono rompere i legami idrofobici e dissociare gli aggregati proteici formati.

L’acido sulfosalicilico è utilizzato per de-proteinizzare campioni destinati alle indagini cliniche (campioni biologici), mentre gli acidi tricloroacetico e perclorico sono utilizzati per le analisi alimentari. La motivazione di tale distinzione è l’affinità che hanno le due differenti tipologie di proteine, ovvero quelle che si trovano nei fluidi biologici e quelle in matrice alimentare, ai differenti acidi. La formazione di aggregati insolubili dipende dalle superfici idrofobiche esposte, tale precipitazione consente la rimozione selettiva di peptidi e delle proteine più grosse tra quelle in soluzione. Le proteine che restano in soluzione sono in funzione inversa della concentrazione dell’agente precipitante.

NB: Le proteine pesano effettivamente più di 5000 Da, quindi per la precipitazione di proteine si utilizzano concentrazioni di TCA del 20%.

Applicazioni alimentari della precipitazione con acidi

Può essere utilizzata per distinguere l’azoto non proteico da azoto proteico, come ad esempio in caso di:

• Finte proteine: Si utilizza ad esempio sugli estratti di lievito, che hanno una buona quota di azoto non proteico (acidi nucleici). Si inizia con un dosaggio dell’azoto, quindi si effettua la precipitazione e si effettua nuovamente la determinazione dell’azoto totale, andando a rapportare la quota prima e dopo la precipitazione (migliora la sensibilità del Kjeldahl).

• Eventi di maturazione proteolitica: Durante la maturazione di un formaggio o di un prosciutto avvengono delle proteolisi a carico delle proteine andando a liberare piccoli peptidi. Allo stesso modo si effettua la valutazione prima e dopo la precipitazione per valutare quanto azoto non proteico è presente nel prodotto rispetto alla quota effettiva proteica totale. Nei formaggi stagionati, andando avanti con le tempistiche di maturazione, e in differenti condizioni ambientali, la quantità di peptidi e quindi azoto non proteico cresce.

• Suscettibilità alle proteasi (digeribilità in vitro): Studio della sensibilità alle proteasi digestive di un determinato alimento. In questo caso si crea una sospensione sminuzzata dell’alimento, si tratta con la proteasi, che viene lasciata agire. L’aggiunta di acidi arresta l’attività proteolitica e porta alla precipitazione di tutte le proteine, comprese le proteasi. Si misura poi la quantità di NPN nella parte solubile. Un esempio è il trattamento di albumi ad alte pressioni in presenza di sale e zucchero, notando che in presenza di zucchero si ha la produzione di peptidi in maniera consistente rispetto al trattamento di albumi senza aggiunte: ciò significa che trattando gli albumi ad alta pressione e con zucchero essi risultano digeribili, al contrario con la sola applicazione di pressione ma non aggiunte il prodotto non viene attaccato efficacemente dagli enzimi digestivi.

Qualità delle proteine

Dimensioni e stato di aggregazione

Le proteine vengono classificate in base alla solubilità in differenti mezzi:

• Albumine: Solubili in acqua (Ovoalbumina, lattoalbumina).
• Globuline: Solubili in soluzioni saline (Proteine da leguminose).
• Prolammine: Solubili in soluzioni alcoliche (gliadine); sono presenti anche le glutenine solubili in soluzioni acide o basiche deboli (Gliadine e glutenine).
• Scleroproteine: Insolubili (Peli, unghie).

Le albumine sono solubili in ambiente acquoso in assenza di sali in quanto non danno luogo alla formazione di aggregati. Come per tutte le proteine, la loro solubilità è minima al punto isoelettrico. In queste condizioni, la proteina è priva di carica netta (il che non significa che la proteina non abbia gruppi elettrostatici ma che la somma delle cariche degli stessi sia pari a zero cambia la struttura nativa) e non viene meno la repulsione elettrostatica. Le cariche residue sulla superficie della molecola possono portare alla formazione di legami elettrostatici tra proteine diverse e quindi a formare aggregati insolubili.

Le globuline in ambiente acquoso formano aggregati stabilizzati da interazioni elettrostatiche. L'aggiunta di sali indebolisce queste interazioni, a causa del legame degli ioni del sale aggiunto alle cariche presenti sulla proteina, e aumenta la solubilità della proteina (salting in). Tuttavia, per tutte le proteine, un aumento della concentrazione di sale porta alla rimozione dell'acqua di solvatazione che circonda le cariche della proteina, che si possono avvicinare di molto e tornare a interagire, formando di nuovo aggregati insolubili (salting out).

Le prolammine e le gluteline sono insolubili in ambiente acquoso perché formano aggregati stabilizzati da interazioni idrofobiche e, in alcuni casi, anche elettrostatiche. L'aggiunta di alcool a percentuali superiori al 40-60% indebolisce le interazioni idrofobiche, a causa della diminuita polarità del solvente e della distruzione della struttura dell'acqua (non c'è più acqua organizzata che schiaccia entropicamente le zone idrofobiche delle proteine le une contro le altre), e consente di solubilizzare queste proteine. In alcuni casi, si possono solubilizzare prolammine in acido acetico diluito o in basi diluite: a questi valori estremi di pH non ci sono più alcune delle cariche presenti sulla proteina (quelle positive ad alto pH, quelle negative a basso pH), aumentandone la solubilità.

Le scleroproteine presenti in natura sono di solito proteine fibrose in cui i singoli filamenti (i singoli polipeptidi) sono connessi da legami covalenti. L'unico modo per portarle in soluzione è rompere i legami covalenti (oppure la loro struttura primaria, con l'uso di proteasi). Tuttavia, in molti alimenti si formano strutture polimeriche insolubili stabilizzate da legami disolfuro (formati tramite reazioni di disulfide exchange e da interazioni idrofobiche). L'uovo sodo, il formaggio, la ricotta, la pasta e il pane sono comuni esempi della formazione di network proteici insolubili in seguito ad interventi tecnologici.

Studi di solubilità differenziale

Informazioni strutturali sulla natura inter-proteina presenti in un network proteico, stabilizzato da interazioni idrofobiche, S-S e ioniche, possono essere ricavate da studi di solubilità in presenza di componenti a crescente capacità dissociante. Visualizzando un network proteico generico si possono vedere le interazioni:

• Interazioni idrofobiche: Identificate come rettangolari.
• Legami disolfuro: Identificati come quadrati.
• Interazioni ioniche: Identificate come rotonde.

Tramite solubilità differenziale si può andare a quantificare le tipologie di legami:

• Creando un tampone salino, e quindi in presenza di sali non denaturanti, si va ad agire sulle interazioni ioniche.
• Al tampone salino si aggiunge un detergente (SDS, caotropo, urea), che agisce sulle interazioni idrofobiche.
• Si aggiunge poi alla miscela un riducente (DTT/2ME), che va a rompere i ponti disolfuro, ottenendo alla fine la solubilizzazione di tutte le proteine.

Esempio pasta

La figura sotto contiene dei dati relativi a differenti tipi di pasta ottenuti con grani diversi, arricchiti con elementi non proteici bioattivi, in questo caso polifenoli. Si è andato a studiare il comportamento in cottura e quindi il network proteico, andando ad applicare la solubilità differenziale tramite un tampone, urea e DTT. Si è visto che la presenza di un composto di polifenoli permette una maggiore stabilità idrofobica. Per quanto riguarda la stabilità data dai legami disolfuro, il risultato è peggiorato rispetto al riferimento, avendo un reticolo più lasso, per quanto riguarda la semola arricchita. Per quanto riguarda il frumento arricchito, i ponti disolfuro e quindi la stabilità della struttura risultano comunque minori rispetto al riferimento con la semola, ma allo stesso modo risultano maggiori rispetto alla semola arricchita, ottenendo una struttura più compatta e una migliore tenuta in cottura.

La figura qui a fianco riporta uno studio di solubilità differenziale su pasta ottenuta da semole molto simili, ma essiccata a diverse temperature: media (A), bassa (B) e alta (C). Dal grafico si può vedere la quantità di proteine solubilizzate con i diversi metodi, ovvero il tampone salino, l'urea, l’urea e DTT. Nel caso di A e C, le proteine solubilizzate con interazioni elettrostatiche sono...