Biochimica delle trasformazioni alimentari

Biochimica delle trasformazioni alimentari

Dosaggio delle proteine

Azoto totale (azoto organico o azoto ridotto)

La determinazione dell’azoto totale quantifica l’azoto presente nelle molecole organiche (non l’azoto presente a livello molecolare in atmosfera N₂), quindi non valuta solo l’azoto presente negli aminoacidi che costituiscono le proteine ma anche altre forme di azoto eventualmente presenti nel campione: acidi nucleici; ioni ammonio e urea. Ogni aminoacido contiene al suo interno almeno un atomo di azoto.

Metodo Kjeldahl

Il campione è digerito nel tubo di Kjeldahl a caldo in presenza di acido solforico (acidi forti) concentrato e dei catalizzatori (solfato di rame) (sali minerali). L'azoto ridotto (tutto l'azoto presente) diventa una specie chimica unica: il solfato di ammonio (mineralizzazione). Si inserisce il composto in un palloncino con della soda, e il solfato di ammonio si trasforma in ammoniaca, che evapora e si forma la CO₂. I vapori sono raccolti in una beuta contenente un acido, nel quale l'ammoniaca tramite retrotitolazione reagisce con parte dell'acido. Si valuta infine quanto acido è rimasto e per differenza si determina l'ammoniaca. Si risale poi alla quantità di azoto ridotto presente nel campione. Il metodo Kjeldahl richiede tanto campione, almeno 1 grammo.

Vantaggi del metodo Kjeldahl

• Riproducibilità elevata;
• Precisione;
• Adatto a tutte le matrici, infatti è il metodo standard di riferimento nella pratica industriale e dal punto di vista legale.

Svantaggi del metodo Kjeldahl

• Misurazione di tutte le forme di azoto ridotto -ovvero totale- (aminoacidico, urea, acidi nucleici, etc.), quindi non vi è selettività;
• La esametilentetrammina è un prodotto che si forma facendo reagire la formaldeide e l’ammoniaca. È la base di una famiglia di esplosivi (T4) ed essa si decompone rilasciando formaldeide e viene usata come antibatterico.
• Esempio: questo metodo Kjeldahl è stato usato per valutare la presenza di proteine in un latte che sembrava molto ricco di questa molecola, ma si è scoperto che questa veniva valutata come molecola proteica quindi questo è il primo inconveniente.
• Applicazione di fattori di conversione a ciascun tipo di proteina in base alla diversa composizione amminoacidica. Ad esempio le proteine vegetali sono ricche in aminoacidi con molto azoto (glutammina, asparagina), che a parità di peso permettono di stoccare molta più proteina che acqua poiché sono molto meno polari in quanto non posseggono una carica negativa. Il fattore di conversione per le proteine vegetali (cereali) è 5,7, mentre per le proteine animali (latte, carne) è 6,25;
• Le proteine dove il fattore di conversione è minore, contengono maggiore azoto. Ad esempio le proteine dei cereali sono povere di lisina e questo dipende dagli aminoacidi, perché alcuni sono più propensi a legare l’acqua di altri (asparagina e glutammina e le forme ammidiche sono aspartato e glutammato). Il glutammato essendo ionizzato lega di più l’acqua rispetto alla glutammina. Il fatto di non legare l’acqua, consente di intaccare la massima quantità di proteine in un ambiente e questo è un vantaggio per il seme ad esempio. Nello stesso peso (glutammina e glutammato) si ha 2 volte la quantità di azoto e questo è fondamentale per un seme che non può rifornirsi come nel caso del latte ma deve farlo da solo.
• Lunghezza, laboriosità, impossibilità di automazione;
• Utilizzo di elevate temperature e di composti chimici aggressivi.

Metodo Dumas

Il metodo Dumas sfrutta la difficoltà di formazione degli ossidi di azoto (NO_X). Si utilizza un campione che viene ossidato in presenza di ossigeno ed elio ad una T elevata (circa 900°C) tale da rimuovere gli idrogeni, ma non abbastanza elevata da formare gli ossidi di azoto. Quindi l'azoto amminico diventa N₂, molecola stabilissima. Poi si formano anche acqua e anidride carbonica, facilmente rimovibili tramite colonne contenenti composti alcalini per la CO₂ e sali che si idratano per l'acqua.

La miscela di gas (elio, ossigeno, azoto, CO₂ e acqua) viene fatta passare attraverso una serie di trappole in grado di bloccare la CO₂, aggiungendo idrossido di calcio che forma il carbonato di calcio, combinandosi con la CO₂. Poi si fa passare attraverso una trappola d’acqua, ovvero si può aggiungere sodio solfato anidro o solfato di calcio (gesso) per eliminare l’acqua. Resta solo l'azoto N₂, che fluisce attraverso una colonna cromatografica dotata di un detector a conduttività termica (TCD): il segnale del detector è convertito in contenuto di azoto usando uno standard di EDTA (=9,59% N). La conduttività è elevata nel caso dell’elio e bassa nell’azoto. L'area sottostante il picco che risulta nel grafico indica la quantità di azoto. Analogamente al metodo Kjeldahl è necessario l’utilizzo di fattori di conversione per trasformare la quantità di azoto nel campione in un valore di contenuto proteico, sempre in ragione della diversa composizione amminoacidica di ciascuna proteina.

Vantaggi del metodo Dumas

• Celerità, in 4 minuti l’analisi è terminata;
• Possibilità di campionamento automatico;
• Semplicità di utilizzo;
• Non sono richiesti catalizzatori o acidi forti.

Svantaggi del metodo Dumas

• Costo elevato;
• Misurazione di tutte le forme di azoto ridotto -ovvero totale- (aminoacidico, urea, acidi nucleici, etc.);
• Applicazione di fattori di conversione alle diverse proteine, in ragione della diversa composizione amminoacidica;
• Basse quantità di campione impiegate (mg: 1-10), il che in ambito forense potrebbe essere un vantaggio ma nel settore alimentare identifica il rischio di una scarsa rappresentatività del campione, soprattutto se questo è un materiale eterogeneo. (Esempio: 10mg di chicchi di grano, dovranno essere rotti e quindi si può avere una bassa rappresentatività perché dipende dalla parte che viene presa, in quanto nel germe vi sono più proteine).

Proprietà spettroscopiche (UV/NIR)

Le proteine sono in grado di assorbire energia luminosa, poiché tutti i legami chimici sono sensibili alla somministrazione di energia. Siccome la quantità di luce assorbita dipende dalla quantità di sostanza assorbente presente, questa caratteristica si può utilizzare per misurare la quantità di una certa specie.

Le alterazioni che modificano la geometria del legame in seguito all’assorbimento di una certa lunghezza d’onda λ riguardanti l’ambito della trattazione sono:

• Stretching del legame, allontanamento degli atomi formanti la molecola lungo l’asse del legame;
• Bending, modificazione degli angoli di legame.

Interessano la lunghezza d'onda dell'ultravioletto UV e del vicino infrarosso NIR.

Il metodo spettroscopico NIR

Le analisi nel NIR possono essere condotte in:

• Trasmittanza, in cui la luce attraversa un corpo, e alcune lunghezze d'onda sono assorbite mentre altre sono trasmesse (passano attraverso); fase liquida;
• Riflettanza, analisi della lunghezza d'onda che viene riflessa.

Questo permette di lavorare su materiali solidi, geliformi, multifasici, al loro stato naturale. Le modalità di conduzione dell'analisi sono due:

• Tutte le varie lunghezze d'onda colpiscono insieme il campione, poi quanto viene trasmesso è separato nelle sue componenti che sono mandate su una serie di fotodiodi. Confrontando poi le componenti della lunghezza d’onda che hanno attraversato il campione con le componenti totali della lunghezza d’onda si valuta quali componenti sono state assorbite e quanto lo sono state;
• Si separa la luce totale nelle sue componenti, e ogni componente singolarmente è mandata sul campione. Poi si valuta ogni componente quanto è riflesso.

Il NIR opera a lunghezza d'onda λ compresa tra 800-2500 nm (12.500-4.000 pulsazioni per cm). Si nota lo spettro dell'infrarosso di un alimento (è stata rimossa l'acqua). In relazione ai legami c'è un certo tipo di assorbimento. Nel caso delle proteine interessa il legame peptidico -N-C-C-N-C-C, nel caso dei lipidi il legame estere C-O-O-R, che non assorbono alla stessa lunghezza d'onda. Nei tracciati in ascissa non c’è la lunghezza d’onda, ma il suo reciproco, ovvero il numero d’onda e la regione in cui assorbe il legame peptidico ad esempio è tra 4500 e 4700nm.

Valutando quindi il diverso assorbimento di diversi legami chimici a diverse lunghezze d'onda si è in grado di effettuare l'analisi simultanea dei componenti individuali di una miscela complessa. Si è in grado di determinare simultaneamente il contenuto di proteine, lipidi, esteri, carboidrati e acqua, guardando i legami peptidici, esteri, acetalici ecc. Per cogliere le differenze del contenuto di proteine o della distribuzione dei legami peptidici, bisogna fare una trasformazione matematica degli spettri chiamata trasformata di Fourier. Questa consente di massimizzare l’informazione che ci serve, eliminando gli elementi non necessari. Si ottengono quindi delle curve di risposta di assorbimento della radiazione che ci interessa precise e lineari in un ambito di concentrazione ampio. Grossolanamente si determina la composizione centesimale del materiale, considerando anche l'acqua, che assorbe in più regioni dello spettro.

Vantaggi del metodo NIR

• Nessuna preparazione del campione, nessuno scarto;
• Non sono richieste particolari abilità all’operatore;
• Estrema velocità dell’analisi (1 minuto circa);
• Analisi simultanea di “multiple components”;
• Analisi di campioni solidi, liquidi e semi-solidi.

Gli svantaggi del metodo NIR

• Limiti significativi in termini di precisione e accuratezza (5% di scostamento, che può essere ridotto concentrando le analisi su di una matrice specifica);
• Necessità di uno strumento diverso per ogni materiale (ad esempio nel latte si usa il milkoscan, negli olii si utilizza uno strumento che funziona in trasmittanza, mentre per i solidi vi è il problema dalla variazione dell’assorbimento in funzione dell’angolo; ovvero in una matrice carnea, essendo il fascio di luce molto piccolo, se questo colpisce una vena di grasso darebbe una composizione falsata, quindi il campione deve essere fatto ruotare per avere più letture e assicurare una certa validità del risultato);
• Quantità di campione richiesta.

Il metodo spettroscopico UV

Le tipologie di legami chimici che assorbono energia luminosa sono:

• Legame peptidico C-O-N-H, assorbe la radiazione UV, in una regione dello spettro prossima ai 220 nm, classificata come lontano ultravioletto (FAR-UV); dovuto alle caratteristiche di doppio legame;
• Sistema di doppietti elettronici presenti in componenti aromatiche delle proteine, che assorbono tra 260-300 nm (vicino ultravioletto).

Vantaggi del metodo spettroscopico UV

• Sensibilità elevatissima.

Svantaggi del metodo spettroscopico UV

• Solubilità del campione (è un’analisi applicabile solo a campioni in soluzione e non tutti gli aminoacidi sono solubili);
• Risposta dipendente dalla composizione della proteina;
• Sovrapposizione degli spettri di assorbimento nell’UV tra proteine e acidi nucleici (unico interferente oltre alle sostanze colorate). La purezza del campione viene valutata tramite il rapporto tra le assorbanze a 280 nm/260 nm.

Riduzione e/o complessazione dei metalli

Metodo Biureto

La reazione del Biureto consiste nella complessazione di uno ione rameico Cu⁺⁺ da parte di gruppi in grado di formare un legame peptidico. La soluzione di solfato di rame, azzurrina, diventa di color porpora in seguito alla reazione che porta alla formazione di un complesso con λ = 550.

Vantaggi del metodo Biureto

• Semplicità;
• Universalità.

Svantaggi del metodo Biureto

• Poco sensibile;
• Molte interferenze (composti riducenti come glucosio, quindi zuccheri, lipidi, detergenti, ma anche composti contenenti doppi legami come i polifenoli). Lo ione Cu²⁺ può infatti essere complessato da qualsiasi componente che presenta gruppi -CH₂NH₂, -CONH₂, -CSNH₂. Il Cu²⁺ non è colorato; Se c’è il glucosio, il rame si riduce e non si vede la proteina.
• Questo sistema richiede la presenza di una particolare geometria e quindi quasi solo le proteine danno luogo alla formazione di questo complesso e quindi di quel colore.

Metodo Folin e Lowry

Si esegue la complessazione del Biureto che rende il rame più facile da ridurre, seguita dalla riduzione con il reattivo di Folin-Ciocalteu (sale complesso con atomi di molibdeno, acido fosforico e tungsteno; la riduzione del molibdato porta ad un colore blu), che cambia di colore in presenza di rame nella forma monovalente, che amplifica la risposta in termini di colore. Si forma un composto di colore blu-violetto, con λ = 750.

Vantaggi del metodo Folin e Lowry

• Sensibilità elevata. L’intensità di colore è molto elevata a concentrazione di proteine che sono nell’ordine di g/L.
• Viene usato per la misura del potere antiossidante (fenoli e polifenoli).

Svantaggi del metodo Folin e Lowry

• Molto sensibile a composti che interferiscono con l’analisi (polifenoli, altri agenti riducenti).
• Molto delicato.

Metodo dell’acido bicinconinico (BCA)

Nel BCA il rame ridotto reagisce con un chelante disegnato apposta per incorporare il rame Cu¹⁺; il vantaggio è che la coordinazione del BCA è talmente forte che la maggior parte dei componenti degli alimenti non influiscono sull’acido bicinconinico. Nonostante questo i fenoli, tra l’altro molto abbondanti nei vegetali, riescono comunque a ridurre BCA. Si hanno minori interferenze. Dopo la riduzione del Cu²⁺, due molecole di BCA chelano gli ioni Cu⁺ con la conseguente formazione di un composto di color porpora intenso con λ = 560.

Svantaggi del metodo BCA

Lo svantaggio è che per avere una reazione legata solo alla presenza di proteine bisogna lavorare a temperature elevate.

Dye binding

Una proteina presenta regioni idrofobiche, che restano tali anche se la proteina è denaturata. Sia proteine che zuccheri sono riducenti, ma gli zuccheri non sono idrofobici. Si è quindi ideato un colorante in grado di aderire idrofobicamente alla superficie della proteina. Il metodo del dye binding si basa sulla variazione dello spettro di assorbimento di un colorante in seguito alla sua interazione con una proteina tramite legami idrofobici.

Dye binding assay: saggio di Bradford

Quando il colorante di Coomassie è libero in soluzione è verde, se si lega cambia colore e diventa blu. La variabilità dell'assorbimento di lunghezza d'onda in seguito a legame con un composto è detto shift-ipercromico. Ovvero se c'è qualcosa che lega il colorante, esso cambia colore (effetto shift) e assorbe di più (effetto ipercromico). Non c'è una reazione chimica vera e propria, ma un semplice legame tra proteina e colorante. Misurando l’intensità del colore blu, si ha un’idea di quanta proteina è presente nel sistema. I coloranti hanno dei coefficienti di estinzione nell’assorbimento della luce molto elevati che porta ad una sensibilità estrema.

Vantaggi del dye binding assay

• Facile applicabilità;
• Sensibilità;
• Automazione possibile;
• Miniaturizzabile;
• Poco variabile al variare delle proteine.

Svantaggi del dye binding assay

• Linearità limitata, se la concentrazione proteica diventa elevata questo parametro diminuisce;
• Condizioni di analisi specifiche.

Derivatizzazione

Si basa su reazioni dei gruppi (ammino gruppo) sui singoli aminoacidi. Tutte le proteine hanno estremità amminoterminali e carbossiterminali. I composti impiegabili tramite derivatizzazione sono:

• Ninidrina, che reagisce con qualunque ammina primaria (anche l'ammoniaca), formando un addotto pieno di doppi legami coniugati, che sono sempre colorati (nel caso in questione viola-purpureo). È un reattivo ad alta sensibilità. Ogni volta che si taglia la proteina si genera un gruppo amminico, quindi valuto se c'è stata azione degradativa proteolitica sulle proteine;
• Fluorescamina, che reagisce con gruppi amminici e genera un composto fluorescente (fluoroforo). I metodi di misura della fluorescenza sono sempre più sensibili rispetto a quelli di misura dell'assorbanza;
• Orto-pftalaldeide che in presenza di un gruppo amminico e un tiolo forma un composto fluorescente. È un metodo molto usato nella rilevazione delle ammine. Ci sono metodi più sensibili in grado di vedere piccogrammi (10^-12 di proteine) basati sulla fluorescenza.

Esempio dal punto di vista pratico: se ci sono due campioni di formaggio e bisogna sapere qual è quello di 6 mesi e quello di 18 mesi, cosa bisogna fare? Durante la conservazione avvengono eventi lipolitici e propiolitici; se ho una proteina, ho un gruppo N-terminale, se si effettua un taglio propiolitico, si avranno due gruppi N-terminali e così via; si applica quindi la procedura sopra citata, determinando la fluorescenza e il campione giovane avrà una fluorescenza bassa, mentre quello vecchio più alta.

Accorgimenti operativi

Sono davvero proteine?

Per rispondere a questa domanda, è necessario:

• Separare da altri componenti solubili, in grado di reagire aspecificamente con i composti utilizzati nei vari metodi colorimetrici illustrati nella lezione precedente.
• Separare proteine da peptidi ed altri composti azotati di piccole dimensioni. La metodologia più semplice e pratica per questo ti