Biochimica delle trasformazioni alimentari

Sommario
1. Dosaggio delle proteine 12
1.1 Azoto totale (azoto organico o azoto ridotto) 12
1.1.1 Metodo Kjeldahl 12
1.1.2 Metodo Dumas 12
1.2 Proprietà spettroscopiche (UV/NIR) 13
1.2.1 Il metodo spettroscopico NIR 13
1.2.2 Il metodo spettroscopico UV 14
1.3 Riduzione e/o complessazione dei metalli 14
1.3.1 Metodo Biureto 14
1.3.2 Metodo Folin e Lowry 15
1.3.3 Metodo dell’acido bicinconinico (BCA) 15
1.4 Dye binding 15
1.4.1 Dye binding assay: saggio di Bradford 15
1.5 Derivatizzazione 16
1.6 Riassunto dei metodi analizzati 16
1.7 Esempi di domande 16
1.8 Tabella riassuntiva i vantaggi e gli svantaggi delle sopraelencate tecniche 17
2. Discriminazione dell’azoto proteico: distinzione delle proteine dagli altri componenti, determinazione del loro stato di aggregazione, quantificazione ed altre applicazioni 19
2.1 Precipitazione con acidi caotropi: determinazione dell’azoto proteico, valutazione della digeribilità proteica e valutazione della proteolisi 19
2.1.1 Agenti caotropi: principio di funzionamento 19
2.1.2 Gli agenti caotropi e il loro utilizzo 19
2.1.3 Applicazioni della precipitazione con acidi caotropi 20
2.2 Studi di solubilità differenziale: correlazione tra la presenza di proteine e il loro stato di aggregazione/associazione 20
2.2.1 Solubilità e classificazione di Osborne 20
2.2.2 Studi di solubilità differenziale: comprensione dello stato di associazione delle proteine in un alimento 21
2.2.3 Applicazione degli studi di solubilità differenziale: determinazione delle interazioni prevalenti in un impasto 22
2.3 SDS-PAGE e SEC/GPC: determinazione delle dimensioni di una proteina 22
2.3.1 SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulphate - PolyAcrylamide Gel Electrophoresis): separazione in condizioni denaturanti 22
2.3.2 Size Exclusion Chromatography (SEC) o Gel Permeation Chromatography (GPC) 24
2.4 Tabella riassuntiva le tecniche oggetto di trattazione e i relativi impieghi 25
2.5 Esempi di domande 25
3. Interazione tra proteine e fase stazionaria: la cromatografia 26
3.1 Cromatografia a scambio ionico: separazione basata sulla carica della proteina 26
3.1.1 Introduzione e esempi di applicazioni 26
3.1.2 Il metodo 26
3.1.2.3 Tabella riassuntiva gli scambiatori sopra citati 27
3.1.3 Il funzionamento del sistema 27
3.1.4 Separazione di sieroproteine e quantificazione di LF mediante cromatografia a scambio ionico (riassunto prima esperienza di laboratorio) 28
3.2 Interazioni basate sulla polarità 29
3.2.1 Cromatografia di interazione idrofobica (HIC, Hydrophobic Interaction Chromatography) 29
3.2.2 Cromatografia a fase inversa (RPC, Reverse Phase Chromatography) 30
3.3 Separazioni elettroforetiche in migrazione in campo elettrico basate sulla carica 31
3.3.1 IsoElectric Focusing (IEF) o isoelettrofocalizzazione 31
3.4 Cromatografia di affinità per interazioni sito-specifiche 31
3.5 Cromatografia di affinità con anticorpi 32
3.6 Tabella riassuntiva le tecniche oggetto di trattazione e i relativi impieghi 33
3.7 Esempi di domande 33
4. L’approccio proteomico 34
4.1 IsoElectric Focusing (IEF) o isoelettrofocalizzazione: determinazione dell’impiego migliore di una materia prima 34
4.2 Elettroforesi bidimensionale (IEF+SDS-PAGE): separazione e determinazione quantitativa delle proteine 34
4.3 Identificazione delle proteine 35
4.4 Spettrometria di massa: determinazione della sequenza amminoacidica 35
4.4.1 Preparazione del campione: metodi ed applicazioni 36
4.4.2 Ionizzazione 36
4.4.3 Separazione degli ioni 38
4.5 Spettrometria di massa tandem: MALDI/ESI-Q-TOF 38
4.6 Esempi di domande 38
5. Immunochimica: riconoscimento molecolare, quantificazione e attività biologica 39
5.1 Anticorpi: struttura e funzionamento 39
5.1.1 Ottenimento degli anticorpi 39
5.2 Il dosaggio immunochimico 40
5.2.1 Dot-blot: valutazione qualitativa 40
5.2.2 Western blot: valutazione qualitativa 41
5.2.3 Metodi ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay): valutazione quantitativa 41
5.3 Accoppiamento del dosaggio immunochimico alla cromatografia: metodo dipstick (stick test) 42
5.4 Esempi di domande 43
6. Attività enzimatica 43
6.1 Il funzionamento degli enzimi 43
6.2 Principi di misura dell’attività enzimatica 43
6.3 Misura continua dell’attività enzimatica 44
6.3.1 Misurazione continua dell’attività enzimatica proteasica con substrato sintetico cromogenico 44
6.3.2 Misurazione continua dell’attività proteasica tramite valutazione della variazione di pH 45
6.3.3 Misurazione continua dell’attività enzimatica analizzando il consumo di ossigeno 46
6.3.4 Misurazione continua dell’attività enzimatica con accoppiamento di reazioni enzimatiche 46
6.4 Misura discontinua dell’attività enzimatica 47
6.4.1 Misurazione discontinua dell’attività enzimatica mediante aggiunta di composti colorati a polimeri 47
6.4.2 Misurazione discontinua dell’attività enzimatica tramite analisi della proteina rimasta intatta 47
6.5 Dosaggio di specifici componenti nell’alimento 47
6.5.1 Dosaggio di specifici componenti nell’alimento (zuccheri) tramite reazioni accoppiate 47
6.6 Dosaggio dell’attività enzimatica residua: impiego di enzimi come marcatori di processo 48
6.6.1 Misurazione della stabilità termica di un enzima: costante di velocità, tempo di dimezzamento ed equazione di Arrhenius 48
6.7 Esempi di domande 49
7. Modificazioni sulla struttura primaria 50
7.1 Modificazione della sequenza da eventi idrolitici (azione di proteasi) 50
7.2 Modificazioni indotte da processi nella struttura di singoli aminoacidi 50
7.2.1 Modificazioni chimiche 50
7.2.2 Formazione di legami covalenti inter- e intra-proteina 51
7.3 Impiego delle proteasi nelle produzioni alimentari 53
7.4 Impiego delle proteasi nel settore non-food 53
7.5 Esempi di domande 54
8. Modificazioni da processo su strutture di ordine superiore 54
8.1 Agenti alteranti le strutture di ordine superiore in una proteina e loro applicazioni 54
8.2 Quantificazione degli intermedi strutturali 56
8.2.1 Fluorescenza Intrinseca: esposizione di residui aminoacidi aromatici al solvente 56
8.2.2 Probes fluorescenti 57
8.2.3 Esposizione di gruppi reattivi 58
8.2.4 Proteolisi controllata 59
8.2.5 Spettroscopia UV-NIR 59
8.2.6 Dicroismo circolare: misura di regolarità strutturale 59
8.2.7 Risonanza Magnetica Nucleare (NMR) a due dimensioni 60
8.2.8 NMR imaging 60
8.2.9 Calorimetria Differenziale a Scansione (DSC) 60
8.3 Esempi di domande 60
9. Amido: caratteristiche e processi 60
9.1 Composizione e struttura dell’amido 60
9.1.1 Struttura basilare dell’amido 60
9.1.2 Struttura di ordine superiore dell’amido 61
9.1.3 Stabilizzazione e destabilizzazione della struttura dell’amido: gelazione (o gelatinizzazione) e retrogradazione 62
9.1.4 Il caso del pane 62
9.1.5 Il caso del panettone 62
9.2 L’amido come materia prima 63
9.2.1 Idrolisi enzimatica dell’amido 63
9.3 Gli enzimi 65
9.3.1 α-amilasi 65
9.3.2 α-amilasi saccarificante 65
9.3.3 β-amilasi 65
9.3.4 Pullulanasi e glucoamilasi 65
9.4 Impieghi dei prodotti sopra descritti 65
9.4.1 Impiego delle destrine 66
9.4.2 Sciroppi di glucosio 66
9.5 Esempi di domande 67
10. Di- e trisaccaridi ed altri polisaccaridi importanti 67
10.1 Lattosio 67
10.2 Raffinosio 67
10.3 Galattosidi iatrogenici 67
10.4 Cellulose ed emicellulose 67
10.4.1 Cellulosa, emicellulosa e relative modificazioni 67
10.5 Altri polisaccaridi di rilievo 69
10.5.1 β-glucani 69
10.5.2 Frutto-oligo saccaridi (FOS) 69
10.5.3 Destrani 69
10.6 Le gomme alimentari: struttura, funzione e modificazioni 69
10.6.1 Impieghi delle gomme 70
10.6.2 Polisaccaridi derivanti dalla carruba e guar 70
10.6.3 Pectina 70
10.6.4 Carragenani 71
10.6.5 Agar-agar 71
10.6.6 Alginato di sodio 71
10.6.7 Gomma xantano 71
10.7 Esempi di domande 72
11. Lipidi, grassi e generi alimentari relazionati 72
11.1 Trigliceridi 72
11.2 Trasformazioni influenzanti le proprietà fisiche e chimiche dei lipidi 72
11.3 Valore nutrizionale degli acidi grassi 73
11.4 Mono- e digliceridi 74
11.4.1 Funzione emulsionante di mono- e digliceridi 74
11.4.2 Modalità di ottenimento di mono- e digliceridi 74
11.5 Fosfolipidi 74
11.5.1 Micelle normali 75
11.5.2 Micelle inverse 75
11.5.3 Membrane e liposomi: il rilascio controllato nei sistemi alimentari 76
11.6 Sistemi multifasici 76
11.7 Interventi biotecnologici 76
11.7.1 Applicazioni di lipasi ed esterasi 77
11.8 Esempi di domande 77
12. Micronutrienti: parte prima 78
12.1 Idrogeno (protone) 78
12.1.1 Il pH nel nostro organismo 78
12.1.2 Acidificazione del lume gastrico 79
12.1.3 Alcalinizzazione del bolo alimentare 79
12.1.4 Il pH e i sistemi tampone 79
12.1.4.1 La carne: struttura e frollatura 79
12.2 Metalli alcalini: litio, sodio e potassio (Li, Na, K) 80
12.2.1 La trasmissione degli impulsi nervosi 80
12.2.2 L’equilibrio sodio-potassio 81
12.3 Metalli alcalino-terrosi: Mg, Ca 81
12.3.1 Calcio 81
12.3.2 Magnesio 82
12.4 Esempi di domande 83
13. Micronutrienti: parte seconda 83
13.1 Cromo 83
13.2 Manganese 83
13.3 Ferro 83
13.4 Cobalto 84
13.5 Nickel, rame e zinco 84
13.5.1 Nickel 84
13.5.2 Rame 85
13.5.3 Zinco 85
13.6 Vanadio (V), Molibdeno (Mo) e Tungsteno (W) 86
13.7 Metalli tiofili: Zinco, Cadmio, Mercurio, Piombo 87
13.7.1 Arsenico 87
13.7.2 Bismuto 87
13.7.3 Alluminio 87
13.7.4 I prodotti di solubilità dei solfuri e idrossidi metallici 87
13.8 Zolfo e Selenio 88
13.8.1 Zolfo 88
13.8.2 Selenio 88
13.9 Alogeni: Fluoro, Cloro, Bromo, Iodio 89
13.9.1 Fluoro 89
13.9.2 Cloro 89
13.9.3 Bromo 89
13.9.4 Iodio 89
13.10 Esempi di domande 89
14. Il Ferro 89
14.1 Strutture contenenti il ferro 89
14.2 Tossicità da Fe: la Reazione di Fenton 89
14.3 Tossicità da Fe: il microbiota 90
14.4 L’assunzione e l’assorbimento del ferro 90
14.4.1 L’assorbimento del Fe (ridotto, Fe2+) e la difficoltà di supplementazione 90
14.5 Regolazione ormonale dell’assorbimento del ferro: l’epcidina 91
14.6 Proteine coinvolte nel metabolismo del ferro 91
14.6.1 Lattoferrina 91
14.6.2 Transferrina e ingresso del Fe nella cellula 91
14.7 Il ferro a livello cellulare 92
14.8 Omeostasi del ferro a livello cellulare 93
14.9 Esempi di domande 93
15. Xenobiotici 94
15.1 Strategie di eliminazione degli xenobiotici e loro conseguenze 94
15.2.1 Il caso del metanolo 94
15.3 Meccanismi enzimatici di eliminazione 95
15.4 Reazioni catalizzate dai citocromi P450 95
15.5 Tipologie di citocromo P450 96
15.6 Esempi di composti alimentari che interagiscono con il citocromo P450 96
15.7 Fase 2 96
15.7.1 Modalità di trasformazione in derivati idrosolubili 97
15.7.2 Alcuni esempi 97
15.8 Esempi di domande 97
16. Il controllo genico: ovvero il ruolo dei componenti degli alimenti nei processi di controllo cellulare 97
16.1 Nutrigenomica: Trascrittomica, Proteomica, Metabolomica 97
16.2 Gli effetti del nutriente 98
16.2.1 Il caso degli acidi grassi 98
16.3 Modalità e tappe di controllo dell’espressione genica negli eucarioti 99
16.3.1 Accessibilità del DNA da trascrivere correlata all’organizzazione del materiale genetico: l’enzima acetilante, l’enzima deacetilante e l’intervento degli acidi grassi 99
16.3.2 Disponibilità del DNA da trascrivere: Zinc fingers e Leucine zipper 100
16.3.3 Velocità di trascrizione: regolazione tramite interazioni con il complesso di trascrizione 101
16.3.4 Velocità di trascrizione: controllo ormonale dell’espressione genica per meccanismo diretto tramite attivazione di specifiche funzioni “enhancer” legate all’interazione tra DNA e proteine 101
16.3.5 Velocità di trascrizione: controllo ormonale dell’espressione genica tramite meccanismo indiretto mediato da CBP 102
16.3.6 Trasporto dell’mRNA dal nucleo al citoplasma 102
16.4 Esempi di domande 103
17. Il controllo dell’attività enzimatica 103
17.1 Quantità di enzima presente 103
17.1.1 Controllo genico 103
17.1.2 Espressione della proteina in forma attiva 103
17.1.3 Bilancio tra produzione e folding/degradazione: la demolizione controllata di proteine tramite ubiquitina e proteasoma 106
17.2 Controllo cinetico di tipo allosterico non covalente 108
17.3 Controllo allosterico tramite modificazione covalente (non proteolitica) 108
17.3.1 Fosforilazione di ossidrili alcolici e fenolici 108
17.3.2 Adenilazione 109
17.3.3 Acilazione 109
17.4 Esempi di domande 110
18. Controllo ormonale del metabolismo e sue modalità 110
18.1 Sistemi che producono dentro la cellula cAMP/cGMP in risposta al transito extra-cellulare di molecole ormonali 110
18.1.1 Il caso della chinasi nella glicogenolisi 111
18.1.2 La simultaneità delle regolazioni 111
18.2 Cascate chinasiche e fosfatasiche 111
18.3 Ca2+ e/o fosfatidil-inositolo 112
18.4 Lo spegnimento delle risposte 112
18.5 Risposta intracellulare al contatto tra cellule del sistema immunitario ed un allergene 113
18.6 Esempi di domande 113
19. Ossido di azoto 113
19.1 NOS costitutiva nel sistema nervoso e sua attivazione da Ca2+ 114
19.2 NOS inducibile nel sistema immunitario 114
19.3 NOS costitutiva presente nel tessuto endoteliale 114
20. Tossine alimentari 115
20.1 Tossine alimentari non proteiche da organismi marini: catena alimentare e trasmissione in essa 115
20.2 Tossine alimentari di natura proteica 115
20.2.1 La tossina botulinica 116
20.2.2 Ribosome-Inactivating Toxins (RIP): ricina e tossina Shiga 116
20.2.3 Tossine responsabili dell’alterazione della funzionalità dei sistemi di trasporto 116
21. Molecole “virtuose” negli alimenti: una fama meritata? Le antocianine come “case study” 117
21.1 Effetto anti-ossidante e anti-radicalico 117
21.2 Effetto anti-infiammatorio e anti-aterosclerotico 117
21.3 Attività anti-diabetica e anti-obesità 117
21.4 Effetto ACE-inibitore 118
21.5 Effetto anti-invecchiamento e miglioramento della vista 118
21.6 Esempi di domande capitoli 19, 20 e 21 118