Biochimica delle trasformazioni alimentari

Biochimica delle Trasformazioni Alimentari

A cura di Matteo Corradi

a.a. 2018/2019 1

Biochimica delle Trasformazioni Alimentari Matteo Corradi

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Sommario

1. Dosaggio delle proteine ........................................................................................................................................ 12

1.1 Azoto totale (azoto organico o azoto ridotto) ........................................................................................... 12

1.1.1 Metodo Kjeldahl ....................................................................................................................................... 12

1.1.2 Metodo Dumas ......................................................................................................................................... 12

1.2 Proprietà spettroscopiche (UV/NIR) ........................................................................................................ 13

1.2.1 Il metodo spettroscopico NIR ................................................................................................................. 13

1.2.2 Il metodo spettroscopico UV .................................................................................................................. 14

1.3 Riduzione e/o complessazione dei metalli ............................................................................................... 14

1.3.1 Metodo Biureto ......................................................................................................................................... 14

1.3.2 Metodo Folin e Lowry ............................................................................................................................. 15

1.3.3 Metodo dell’acido bicinconinico (BCA) ................................................................................................ 15

1.4 Dye binding..................................................................................................................................................... 15

1.4.1 Dye binding assay: saggio di Bradford ................................................................................................. 15

1.5 Derivatizzazione ........................................................................................................................................... 16

1.6 Riassunto dei metodi analizzati ................................................................................................................. 16

1.7 Esempi di domande ..................................................................................................................................... 16

1.8 Tabella riassuntiva i vantaggi e gli svantaggi delle sopraelencate tecniche ........................................ 17

2. Discriminazione dell’azoto proteico: distinzione delle proteine dagli altri componenti, determinazione del

loro stato di aggregazione, quantificazione ed altre applicazioni ........................................................................... 19

2.1 Precipitazione con acidi caotropi: determinazione dell’azoto proteico, valutazione della digeribilità

proteica e valutazione della proteolisi .................................................................................................................... 19

2.1.1 Agenti caotropi: principio di funzionamento ...................................................................................... 19

2.1.2 Gli agenti caotropi e il loro utilizzo ....................................................................................................... 19

2.1.3 Applicazioni della precipitazione con acidi caotropi .......................................................................... 20

2.2 Studi di solubilità differenziale: correlazione tra la presenza di proteine e il loro stato di

aggregazione/associazione ...................................................................................................................................... 20

2.2.1 Solubilità e classificazione di Osborne .................................................................................................. 20

2.2.2 Studi di solubilità differenziale: comprensione dello stato di associazione delle proteine in un

alimento ................................................................................................................................................................... 21

2.2.3 Applicazione degli studi di solubilità differenziale: determinazione delle interazioni prevalenti in

un impasto .............................................................................................................................................................. 22

2.3 SDS-PAGE e SEC/GPC: determinazione delle dimensioni di una proteina ....................................... 22

2.3.1 SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulphate - PolyAcrylamide Gel Electrophoresis): separazione in

condizioni denaturanti .......................................................................................................................................... 22

2.3.2 Size Exclusion Chromatography (SEC) o Gel Permeation Chromatography (GPC) ...................... 24

2.4 Tabella riassuntiva le tecniche oggetto di trattazione e i relativi impieghi .......................................... 25

2.5 Esempi di domande ..................................................................................................................................... 25

3. Interazione tra proteine e fase stazionaria: la cromatografia ........................................................................... 26

3.1 Cromatografia a scambio ionico: separazione basata sulla carica della proteina ................................ 26

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3.1.1 Introduzione e esempi di applicazioni .................................................................................................. 26

3.1.2 Il metodo ................................................................................................................................................... 26

3.1.2.3 Tabella riassuntiva gli scambiatori sopra citati ............................................................................... 27

3.1.3 Il funzionamento del sistema ................................................................................................................. 27

3.1.4 Separazione di sieroproteine e quantificazione di LF mediante cromatografia a scambio ionico

(riassunto prima esperienza di laboratorio) ....................................................................................................... 28

3.2 Interazioni basate sulla polarità ................................................................................................................. 29

3.2.1 Cromatografia di interazione idrofobica (HIC, Hydrophobic Interaction Chromatography) ........... 29

3.2.2 Cromatografia a fase inversa (RPC, Reverse Phase Chromatography) ............................................ 30

3.3 Separazioni elettroforetiche in migrazione in campo elettrico basate sulla carica .............................. 31

3.3.1 IsoElectric Focusing (IEF) o isoelettrofocalizzazione .......................................................................... 31

3.4 Cromatografia di affinità per interazioni sito-specifiche ........................................................................ 31

3.5 Cromatografia di affinità con anticorpi ..................................................................................................... 32

3.6 Tabella riassuntiva le tecniche oggetto di trattazione e i relativi impieghi .......................................... 33

3.7 Esempi di domande ..................................................................................................................................... 33

4. L’approccio proteomico ........................................................................................................................................ 34

4.1 IsoElectric Focusing (IEF) o isoelettrofocalizzazione: determinazione dell’impiego migliore di una

materia prima ............................................................................................................................................................. 34

4.2 Elettroforesi bidimensionale (IEF+SDS-PAGE): separazione e determinazione quantitativa delle

proteine ....................................................................................................................................................................... 34

4.3 Identificazione delle proteine ..................................................................................................................... 35

4.4 Spettrometria di massa: determinazione della sequenza amminoacidica ............................................ 35

4.4.1 Preparazione del campione: metodi ed applicazioni .......................................................................... 36

4.4.2 Ionizzazione .............................................................................................................................................. 36

4.4.3 Separazione degli ioni ............................................................................................................................. 38

4.5 Spettrometria di massa tandem: MALDI/ESI-Q-TOF ............................................................................ 38

4.6 Esempi di domande ..................................................................................................................................... 38

5. Immunochimica: riconoscimento molecolare, quantificazione e attività biologica ...................................... 39

5.1 Anticorpi: struttura e funzionamento ........................................................................................................ 39

5.1.1 Ottenimento degli anticorpi ................................................................................................................... 39

5.2 Il dosaggio immunochimico ....................................................................................................................... 40

5.2.1 Dot-blot: valutazione qualitativa ........................................................................................................... 40

5.2.2 Western blot: valutazione qualitativa ................................................................................................... 41

5.2.3 Metodi ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay): valutazione quantitativa ..................... 41

5.3 Accoppiamento del dosaggio immunochimico alla cromatografia: metodo dipstick (stick test)........ 42

5.4 Esempi di domande ..................................................................................................................................... 43

6. Attività enzimatica ................................................................................................................................................. 43

6.1 Il funzionamento degli enzimi ................................................................................................................... 43

6.2 Principi di misura dell’attività enzimatica ................................................................................................ 43

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6.3 Misura continua dell’attività enzimatica................................................................................................... 44

6.3.1 Misurazione continua dell’attività enzimatica proteasica con substrato sintetico cromogenico .. 44

6.3.2 Misurazione continua dell’attività proteasica tramite valutazione della variazione di pH .......... 45

6.3.3 Misurazione continua dell’attività enzimatica analizzando il consumo di ossigeno ..................... 46

6.3.4 Misurazione continua dell’attività enzimatica con accoppiamento di reazioni enzimatiche ........ 46

6.4 Misura discontinua dell’attività enzimatica ............................................................................................. 47

6.4.1 Misurazione discontinua dell’attività enzimatica mediante aggiunta di composti colorati a

polimeri ................................................................................................................................................................... 47

6.4.2 Misurazione discontinua dell’attività enzimatica tramite analisi della proteina rimasta intatta . 47

6.5 Dosaggio di specifici componenti nell’alimento ...................................................................................... 47

6.5.1 Dosaggio di specifici componenti nell’alimento (zuccheri) tramite reazioni accoppiate ............... 47

6.6 Dosaggio dell’attività enzimatica residua: impiego di enzimi come marcatori di processo.............. 48

6.6.1 Misurazione della stabilità termica di un enzima: costante di velocità, tempo di dimezzamento ed

equazione di Arrhenius......................................................................................................................................... 48

6.7 Esempi di domande ..................................................................................................................................... 49

7. Modificazioni sulla struttura primaria ............................................................................................................... 50

7.1 Modificazione della sequenza da eventi idrolitici (azione di proteasi) ................................................ 50

7.2 Modificazioni indotte da processi nella struttura di singoli aminoacidi .............................................. 50

7.2.1 Modificazioni chimiche ........................................................................................................................... 50

7.2.2 Formazione di legami covalenti inter- e intra-proteina ...................................................................... 51

7.3 Impiego delle proteasi nelle produzioni alimentari ................................................................................ 53

7.4 Impiego delle proteasi nel settore non-food ............................................................................................. 53

7.5 Esempi di domande ..................................................................................................................................... 54

8. Modificazioni da processo su strutture di ordine superiore ............................................................................ 54

8.1 Agenti alteranti le strutture di ordine superiore in una proteina e loro applicazioni ........................ 54

8.2 Quantificazione degli intermedi strutturali .............................................................................................. 56

8.2.1 Fluorescenza Intrinseca: esposizione di residui aminoacidi aromatici al solvente ......................... 56

8.2.2 Probes fluorescenti ................................................................................................................................... 57

8.2.3 Esposizione di gruppi reattivi ................................................................................................................ 58

8.2.4 Proteolisi controllata ................................................................................................................................ 59

8.2.5 Spettroscopia UV-NIR ............................................................................................................................. 59

8.2.6 Dicroismo circolare: misura di regolarità strutturale .......................................................................... 59

8.2.7 Risonanza Magnetica Nucleare (NMR) a due dimensioni ................................................................. 60

8.2.8 NMR imaging ........................................................................................................................................... 60

8.2.9 Calorimetria Differenziale a Scansione (DSC) ..................................................................................... 60

8.3 Esempi di domande ..................................................................................................................................... 60

9. Amido: caratteristiche e processi ......................................................................................................................... 60

9.1 Composizione e struttura dell’amido ........................................................................................................ 60

9.1.1 Struttura basilare dell’amido .................................................................................................................. 60

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9.1.2 Struttura di ordine superiore dell’amido .............................................................................................. 61

9.1.3 Stabilizzazione e destabilizzazione della struttura dell’amido: gelazione (o gelatinizzazione) e

retrogradazione ...................................................................................................................................................... 62

9.1.4 Il caso del pane ......................................................................................................................................... 62

9.1.5 Il caso del panettone ................................................................................................................................ 62

9.2 L’amido come materia prima...................................................................................................................... 63

9.2.1 Idrolisi enzimatica dell’amido ................................................................................................................ 63

9.3 Gli enzimi ...................................................................................................................................................... 65

9.3.1 α-amilasi .................................................................................................................................................... 65

9.3.2 α-amilasi saccarificante ........................................................................................................................... 65

9.3.3 β-amilasi .................................................................................................................................................... 65

9.3.4 Pullulanasi e glucoamilasi ...................................................................................................................... 65

9.4 Impieghi dei prodotti sopra descritti .................................................................