Biochimica delle trasformazioni alimentari

Metodi di quantificazione delle proteine

Alla base di tutte le conoscenze scientifiche si trovano:

• Capacità di misurare in modo corretto
• Evitare errori grossolani nell’interpretazione dei dati
• Effettuare la misurazione con la maggiore precisione possibile

Esistono diversi metodi di quantificazione delle proteine presenti in un sistema biologico che in ordine di sensibilità crescente sono i seguenti:

1. Azoto totale (azoto ridotto)
2. Proprietà spettroscopiche (UV/NIR)
3. Riduzione e/o complessazione di metalli
4. Dye binding
5. Derivatizzazione

Azoto totale -amminiche

L'azoto presente nelle funzioni  o degli aa non è l’unico presente nell’alimento: infatti, esistono altre forme di azoto misurabile, come gli acidi nucleici, lo ione ammonio ed eventuali aggiunte truffaldine di materiale azotato (Non Protein Nitrogen, NPN).

Metodo Kjeldahl

Il metodo più diffuso per la determinazione dell’azoto totale è il metodo di Kjeldahl, in cui le sostanze azotate vengono ossidate dall’acido solforico concentrato, in presenza di un catalizzatore: si forma solfato d’ammonio, dal quale in presenza di soda si libera ammoniaca che viene poi distillata e titolata.

Il metodo prevede quindi le seguenti reazioni in successione:

1. Mineralizzazione: il campione (almeno 1 g) viene digerito a caldo in presenza di acido solforico concentrato e cristalli di rame (catalizzatori), in modo che tutto l’azoto ridotto presente nel campione diventi solfato d’ammonio: campione azotato + H₂SO₄ → (NH₄)₂SO₄ + CO₂ + SO₂
2. Distillazione: in presenza di soda, dal solfato d’ammonio si forma idrossido di ammonio che è distillabile: (NH₄)₂SO₄ + 2NaOH → 2NH₄OH + Na₂SO₄
3. Blocco: i vapori di ammoniaca vengono quindi raccolti in una beuta contenente un acido che blocca l’azoto formando con esso un sale: 2NH₄OH + H₂SO₄ → (NH₄)₂SO₄ + 2H₂O
4. Titolazione: il sale d’ammonio viene titolato con HCl per fare in modo che si riformi l’acido usato nella fase di blocco: (NH₄)₂SO₄ + 2HCl → 2NH₄Cl + H₂SO₄

Il metodo Kjeldahl rappresenta attualmente lo standard di riferimento nella pratica industriale e dal punto di vista legale; può essere applicato a qualunque materiale azotato (insensibilità alla matrice) ed è preciso e altamente riproducibile. Tuttavia, non misura esclusivamente l’azoto proteico (NP) ma qualunque forma di azoto ridotto – ammoniaca, urea, acidi nucleici – e ciascun tipo di proteina richiede un diverso fattore di conversione, in ragione della diversa composizione amminoacidica. Per esempio, le proteine vegetali sono particolarmente ricche di GLN e ASN che a parità di peso contengono il doppio della quantità di azoto, ragion per cui il fattore di conversione dei campioni vegetali è 5.7, mentre nel caso dei campioni animali, le cui proteine contengono meno GLN e ASN, il coefficiente di conversione è maggiore (6.25).

Infine, il Kjeldahl è laborioso, lungo da eseguire e non automatizzabile e richiede l’uso di composti chimici aggressivi (acido solforico e soda) a temperature elevate.

Metodo Dumas

Questo metodo prevede l’ossidazione del campione di materiale biologico con O₂ ad elevatissima temperatura (circa 900°C) in presenza di un gas carrier (He), in modo che siano rilasciati CO₂, acqua e azoto. La temperatura impostata è tale da riuscire a strappare tutti gli atomi di idrogeno ma non formare ossidi di azoto.

Con opportune colonne ad assorbimento, la CO₂ e l’acqua sono rimosse dalla miscela di gas, mentre l’azoto rimanente viene immesso in una colonna cromatografica in presenza di He, dotata di un detector a conduttività termica (TCD): l’area del segnale viene convertita in contenuto di azoto mediante uno standard di EDTA (9.59% N).

Come il Kjeldahl, anche il metodo Dumas richiede l’uso di opportuni fattori di conversione per trasformare la quantità di azoto presente nel campione in un contenuto proteico.

I principali vantaggi di questo metodo sono la rapidità (meno di 4 min), la mancanza di catalizzatori e acidi forti, la possibilità di automatizzazione e la facilità di impiego. Tuttavia, essendo basato sulla combustione, ha gli stessi limiti del Kjeldahl (non permette di distinguere NP da NPN e richiede fattori di conversione diversi a seconda della tipologia di proteina) e richiede piccole quantità di campione (1-2 mg) che potrebbero non garantire la rappresentatività di un materiale eterogeneo.

Proprietà spettroscopiche

Tutti i composti chimici sono in grado di assorbire energia luminosa, grazie alla sensibilità dei legami chimici alla somministrazione di energia che può indurre diversi tipi di alterazione, di cui quelli interessanti per il dosaggio delle proteine sono:

• Stretching del legame: l’energia assorbita dal legame porta ad un allontanamento dei due atomi
• Bending: modificazione della geometria del legame in funzione della luce assorbita

Gli ambiti spettrali interessanti sono l’UV e il vicino infrarosso (NIR).

Metodologie FT-NIR

Nell’ambito della quantificazione delle proteine nei prodotti alimentari, le misure nel NIR sono interessanti per il loro aspetto pratico: infatti possono essere condotte sia in trasmittanza sia in riflettanza e consentono di lavorare su materiali solidi, geliformi e multifasici, senza la necessità di ricorrere ad alcuna preparazione del campione.

In particolare, la trasmittanza di un corpo è la sua capacità di assorbire la luce a determinate lunghezze d’onda e di lasciarsi attraversare da altre. Il colore di un corpo invece è la radiazione riflessa: il corpo viene colpito da raggi di diverse lunghezze d’onda e quella che non viene assorbita bensì riflessa ne determina il colore (un corpo appare di un certo colore perché ha la riflettanza selettiva in quel colore).

Esistono due modalità con cui condurre queste analisi:

1. Il campione viene investito da luce a diverse lunghezze d’onda al fine di separare il raggio luminoso che emerge dal campione nelle sue diverse componenti per inviarle su una schiera di rilevatori (sequenza di fotodiodi), ognuno dei quali fornisce una risposta: confrontando le risposte con quelle ottenute in assenza del campione, si può capire quanto le diverse lunghezze d’onda siano state assorbite dal materiale analizzato.
2. La luce viene separata nelle sue diverse componenti – mediante l’interferometro di Michelson – al fine di inviarle una alla volta sul campione con un certo angolo e misurarne la quota riflessa.

Le NIR hanno lunghezze d’onda comprese tra 800 e 2500 nm e frequenza compresa tra 12500 e 4000 cm^-1 (E=h*f e f=1/λ); si trovano oltre lo spettro del VIS e sono per esempio quelle responsabili della sensazione di calore. Oltre alle NIR, esistono le MIR (medio infrarosso) e le FIR (lontano infrarosso), oltre le quali si trovano le MW.

Un materiale biologico contiene diversi legami chimici che assorbono la luce a diverse lunghezze d’onda come:

• Legami peptidici, derivanti dalla condensazione tra il gruppo carbossilico (-COOH) di un aa e il gruppo amminico (-NH₂) di un altro aa, tale per cui uno degli idrogeni legati all’azoto si separa e si unisce all’-OH del carbonio a formare una molecola di acqua, consentendo al carbonio e all’azoto di formare il legame peptidico
• Legami esteri dei lipidi

La capacità dei vari legami chimici di assorbire radiazioni a diverse lunghezze d’onda consente l’analisi simultanea dei singoli componenti di una miscela complessa, al fine di ottenere la composizione centesimale del campione (compresa la quantità di acqua) con un’unica misurazione. Per esempio, per quantificare le singole componenti di un gelato (acqua, zucchero, lipidi, proteine) si misura l’assorbimento nel NIR (o riflettanza) a specifiche lunghezze d’onda.

Le metodologie FT-NIR sono quindi basate sull’assorbimento di radiazioni nel NIR a lunghezze d’onda caratteristiche di specifici legami e in particolare di gruppi quali C-H, N-H o O-H. Sono rapide (30-60 s), sicure, non distruttive e non impiegano reagenti chimici, solventi o gas; non richiedono alcuna preparazione del campione e non producono alcuno scarto; non sono richieste particolari abilità all’operatore e sono adatte a campioni solidi, liquidi e semi-liquidi. Tuttavia, presentano limiti significativi in termini di precisione e accuratezza (<5%) e, nonostante la versatilità, lo strumento deve essere adattato alla forma fisica del campione.

Infine, nei campioni solidi l’assorbimento cambia in funzione dell’angolo di incidenza: infatti in alcuni casi lo strumento deve ruotare durante l’analisi, in quanto essendo il fascio di luce molto sottile (1 mm) potrebbe non cogliere le diverse superfici del campione (venature di grasso della carne o superficie irregolare della farina).

Spettroscopia UV

Nella proteina, i sistemi sensibili alla radiazione UV sono due:

1. Legami peptidici
2. Sistema di doppietti elettronici degli aa aromatici

I legami peptidici assorbono la radiazione UV in una regione dello spettro attorno ai 220 nm che viene classificata come lontano UV. In particolare, in tale regione i legami peptidici hanno un’assorbanza estremamente elevata che rende la spettroscopia UV il metodo più sensibile in assoluto per quantificare le proteine in soluzione (in trasmittanza).

Il sistema di doppietti elettronici presenti nelle componenti aromatiche delle proteine assorbe invece nella regione del vicino UV (260-300 nm con picco di assorbimento a 280 nm). Tuttavia, se da un lato il metodo è estremamente sensibile, dall’altro il campione deve essere necessariamente presente in soluzione (deve essere solubile) e la risposta dipende dalla composizione della proteina ed è sensibile alla presenza di interferenti. Inoltre, tra gli spettri di assorbimento nell’UV delle proteine e degli anelli eterociclici degli acidi nucleici si osserva una discreta sovrapposizione: se le proteine presentano il picco di assorbanza a 280 nm, gli acidi nucleici a 260 nm.

Riduzione e/o complessazione di metalli

Vengono effettuate principalmente in laboratorio.

Reazione di Biureto

La reazione di Biureto consiste nella complessazione di uno ione rameico (Cu²⁺) da parte di gruppi chimici che formano un legame peptidico. In particolare, una soluzione azzurra di solfato di rame diventa color porpora (assorbe a 550 nm) quando il rame è stato complessato.

Tuttavia, la reazione è sensibile alla presenza di altri componenti nell’alimento, come zuccheri, detergenti, lipidi e composti riducenti. Quindi, dato che le proteine riducono i metalli, si induce la complessazione di Biureto in modo che il rame possa essere ridotto con il reattivo di Folin-Ciocalteau che cambia colore in presenza di ioni rameosi (Cu⁺). Però anche questo sistema è molto sensibile alla presenza di altri riducenti, come Glu e polifenoli (il reattivo di Folin viene usato per misurare la capacità antiossidanti dei polifenoli).

Per rendere il metodo meno delicato, si fa reagire il rame ridotto non con il reattivo di Folin bensì con un chelante appositamente disegnato (acido bicinconinico, BCA) che si colora quando incorpora il rame (I) e che non risente di componenti lipidiche e detergenti.

Dye-binding assays

Queste tecniche si basano sullo shift ipercromico, ovvero una variazione nello spettro di assorbimento di un colorante, in seguito alla sua interazione con una proteina mediante legami idrofobici. Le proteine presentano delle regioni idrofobiche che rimangono tali anche in caso di denaturazione ed esistono dei coloranti in grado di legarsi a tali regioni, come il colorante di Coomassie: quando è libero in soluzione è verde, mentre se si lega a una regione idrofobica cambia colore e aumenta l’intensità della propria colorazione (shift ipercromico). In questo caso non avviene una vera e propria reazione chimica, ma semplicemente le molecole idrofobiche del colorante aderiscono alle proteine. Nonostante la reazione debba avvenire in acido fosforico diluito e MetOH (la molecola di colorante non è molto solubile), il metodo è semplice, automatizzabile e miniaturizzabile (200 µL). Tuttavia, la linearità del metodo è piuttosto limitata: infatti in presenza di una quantità eccessiva di proteina il metodo non risponde più.

Derivatizzazione

Il sistema si basa sulla reattività dei gruppi dei singoli aa nei confronti di reattivi estremamente sensibili e specifici. Per esempio, la ninidrina reagisce con qualunque ammina primaria (compresa NH₃) a formare un addotto ricco di C=C coniugati che sono sempre colorati. Tagliando una proteina intatta con una proteasi, ad ogni taglio si genera un nuovo gruppo amminico: quindi questo sistema consente di capire se la proteina è intatta, misurando quanti gruppi amminici sono presenti nell’unità di massa (ad ogni taglio, la quantità di azoto totale è la medesima mentre i gruppi amminici esposti aumentano). Un sistema efficace è basato sul fatto che una dialdeide aromatica e un ammino-gruppo in presenza di un tiolo formano un composto fluorescente (misurare la presenza di una luce è molto più semplice che non l’intensità).

Accorgimenti operativi

I dosaggi basati sull’azoto totale non consentono di distinguere NP da NPN, come urea, sali e acidi nucleici. Nella pratica, si separano le proteine dagli altri componenti solubili e da peptidi e componenti azotati di piccole dimensioni, mediante la precipitazione con acidi caotropi:

• Acido sulfosalicilico (analisi cliniche)
• Acido tricloroacetico (TCA) per analisi alimentari
• Acido perclorico (forma più ossidata possibile del cloro, HClO₄)

La metodologia si basa sul fatto che trattando una soluzione/sospensione di proteine con determinati composti le proteine si insolubilizzano, mentre altri materiali azotati (acidi nucleici, urea e sali d’ammonio) non si insolubilizzano. Essendo poco solvate, le specie caotropo sono in grado di disordinare la struttura dell’acqua e penetrare nella struttura proteica, indebolendo le interazioni tra i residui carichi positivamente e quelli carichi negativamente (ionic pairs) del core idrofobico della proteina. Se un agente caotropo disordina la struttura della proteina, un agente cosmotropo la stabilizza. In particolare, una specie estremamente carica (fosfato e solfato) rientra nei cosmotropi, perché le numerose cariche distribuite su una massa così grande creano un’enorme sfera di solvatazione intorno allo ione che non riesce quindi a destabilizzare le proteine (vale sia per anioni sia per cationi); gli ioni caotropi invece, avendo piccole cariche (+/-1) ed essendo poco solvati, riescono a penetrare la struttura proteica. Maggiore è la dimensione dello ione, minore è la quantità di acqua di solvatazione, ragion per cui lo ioduro riesce a penetrare meglio del bromuro (è più grande ma ha meno acqua di solvatazione): infatti, in presenza di acqua la massa dello ione non è data solo dalla massa riportata sulla tabella degli elementi ma dalla somma di quest’ultima con quella dell’acqua di solvatazione.

Se in soluzione e in presenza di uno ione caotropo le frazioni non proteiche rimangono disciolte, quelle proteiche precipitano, fenomeno che consente anche di separare peptidi e proteine di diversa taglia. Inoltre, l’efficacia di questi agenti precipitanti è legata alla loro concentrazione, ovvero maggiore è la concentrazione maggiore sarà la quantità di proteine precipitate (è adatta a proteine idrofobiche e acide piuttosto che con proteine basiche): quindi, aumentando la concentrazione di TCA nella soluzione di proteine si riescono a far precipitare peptidi via via più piccoli. Per esempio, se con una concentrazione di TCA del 5% si riescono a far precipitare proteine da 15mila Da, con il 20% di TCA si raggiungono anche proteine da 20mila Da: si tratta quindi di un rudimentale sistema per distinguere le proteine in base al loro PM.

Generalmente, la metodologia richiede 50 mg/L di proteine e l’assenza di agenti interferenti come i detergenti che precipiterebbero. Gli agenti caotropi possono essere usati per alcune determinazioni nel settore dei materiali alimentari:

• Capire se l’azoto totale determinato sia NP o NPN
• Simulare una digestione proteica mediante pepsina e chimotripsina: per capire se dalla digestione si formano dei peptidi, si aggiunge TCA, si centrifuga e ciò che resta in soluzione dovrebbero essere i peptidi, la cui presenza può essere determinata misurandone l’assorbanza nell’UV. Se digeribile, il campione contiene dei peptidi che sopravvivono al trattamento con TCA, mentre in quello non digeribile saranno assenti (tutte le proteine sono precipitate dal TCA). Questo è il metodo ufficiale UE per misurare la digeribilità delle proteine.
• Valutare gli eventi proteolitici nel formaggio stagionato: 36 mesi sono avvenuti degli eventi proteolitici che vengono individuati in presenza di TCA: se c’è stata proteolisi, si troveranno dei peptidi in soluzione (NPN). L’analisi del formaggio viene effettuata con una concentrazione di TCA pari al 15%.

Metodi di separazione delle proteine stato di aggregazione

Nei materiali alimentari, molte proteine sono presenti sotto forma di aggregati o di associazioni (carne, pane, pasta), dove si trovano intrecciate tra loro mediante legami covalenti e non covalenti. Nel dettaglio, un aggregato proteico è stabilizzato da legami S-S (interazioni più forti che interessano le proteine), interazioni idrofobiche e regioni in cui non vi sono legami particolari.