Biochimica degli alimenti della nutrizione e delle malattie metaboliche

BIOCHIMICA DEGLI ALIMENTI, DELLA NUTRIZIONE E DELLE

MALATTIE METABOLICHE – PARTE I

P :

ROTEIN QUALITY AN ELUSIVE CONCEPT

Un ruolo nella definizione della qualità di un alimento è svolto anche dalle proteine. La qualità proteica

dell’alimento dipende innanzitutto dalla safety, che può essere determinata da diversi aspetti:

- La presenza di allergeni, che possono essere dannosi per alcune persone: ad esempio la lipid transfer

protein presente nella frutta.

La presenza di glutine (gda 0, gda2, gda4, gda9, γ-gliadina……) dannosa per soggetti celiaci.

-

- Attività anti-nutrizionali di determinate proteine: si tratta di agenti sequestranti e inibitori delle

proteasi e di idrolasi in generale (l’effetto è che se l’alimento è ricco di questi inibitori gli enzimi

vengono bloccati e l’alimento non verrà digerito e metabolizzato completamente). L’avidina presente

nell’uovo, ad esempio, è una proteina che lega fortemente due molecole di biotina (legami non

covalenti ma molto forti). Per fare in modo che non si verifichi questo legame si può denaturare la

proteina cambiandone la struttura, ad esempio con il trattamento di cottura, o “rompendola” attraverso

le proteasi. Tutti gli inibitori sono proteine che agiscono su degli enzimi, il primo conosciuto è stato

l’inibitore della tripsina. Si tratta di proteine molto grosse che legano attraverso legami non covalenti

l’enzima viene associato nella zona del sito catalitico e nella zona

con interazioni proteina-proteina:

di riconoscimento del substrato (NB: non sempre le due parti coincidono). Un altro esempio sono i

legumi, i quali sono molto ricchi di inibitori delle proteasi e per fare in modo che non agiscano è

necessaria la cottura. L’ovoalbumina, ha una struttura molto simile a quella dell’antitripsina e

inoltre,

svolge una funzione analoga di inibitore sull’enzima tripsina.

- Coinvolgimento in malattie metaboliche (come la fenilchetonuria): la fenilalanina-ossidasi necessaria

al metabolismo della fenilalanina non è presente e l’accumulo di questo aminoacido può provocare

conseguenze molto gravi, fino alla morte. La fenilalanina deriva dagli alimenti e anche dall’aspartame,

un estere metilato della fenilalanina.

Un altro aspetto importante nella definizione della qualità proteica di un alimento è l’aspetto nutrizionale:

amminoacidica dell’alimento

- Composizione in termini di aminoacidi essenziali e non essenziali.

- Digeribilità e biodisponibilità: possono essere dipendenti dalla sequenza, dal processo tecnologico e

dalla matrice. L’aminoacido che si trova all’interno di una struttura deve poter essere liberato

dall’enzima proteolitico. Bisogna tenere però conto che anche la proteasi più forte non può agire in

siti dove non è in grado di arrivare. Se il sito si trova all’interno di una struttura molto compatta non

è automatico che questa riesca a liberarlo e a renderlo accessibile: questo ruolo è del processo

tecnologico a cui viene sottoposta la proteina (o dalla struttura della stessa). Le caseine sono proteine

poco strutturate, sono infatti pensate per alimentare individui ed esseri viventi che non hanno estese

capacità digestive, come i neonati. Il processo a cui la proteina viene sottoposta può rendere più o

meno accessibile un aminoacido: una proteina denaturata rende l’aminoacido più accessibile alle

proteasi, ma questo vale solo per le proteine isolate, infatti negli alimenti ci sono anche altri nutrienti,

come carboidrati e grassi, che creano nuove interazioni modificando gli aminoacidi che non vengono

più riconosciuti dalle proteasi o formando degli aggregati che li rendono inaccessibili.

Nella trasformazione un ruolo importante nella definizione della qualità proteica è rappresentato dal

del trattamento tecnologico ha influenze sulla sequenza amminoacidica,

processo tecnologico: l’effetto

la quale viene modificata covalentemente (e cioè dal punto di vista dei legami covalenti). Ciò significa

che il gruppo R tipico di ogni aminoacido viene modificato, ma possono essere modificate anche la

struttura e il bilancio idrofobicità-idrofilicità (che non si basa solo sulla conta degli aminoacidi idrofili e

idrofobici, ma sulla struttura della proteina, la quale può esporre zone più idrofobiche o idrofile),

importante perché va a modificare la capacità di interagire con i solventi come l’acqua, la solubilità delle

proteine stesse in un alimento (precipitati nel latte), la capacità di stabilizzare emulsioni, gel e schiume

(in cui c’è una fase idrofobica unita dalle proteine ad una fase idrofobica). 1

Esempio: la struttura del collagene

Il collagene è una proteina strutturale e ha una funzione ben precisa a seconda del tipo di tessuto in cui si

trova; essa è la principale proteina del tessuto connettivo a cui conferisce solidità. Le sue proprietà

meccaniche dipendono dalla sua struttura quaternaria: catene polipeptidiche individuali che si uniscono

in una tripla elica e tra diverse triple eliche nelle miofibrille. Il collagene ha una struttura ripetitiva formata

Quest’ultima è

da colina-glicina-idrossiprolina. un aminoacido, derivata dalla prolina, tipico solo del

collagene. La stabilizzazione della tripla elica da soli legami idrogeno inter-catena rende la struttura

fragile. Se il tessuto che contiene collagene deve sopportare sforzi meccanici di una certa intensità, occorre

irrobustire la struttura formando legami covalenti trasversali (cross-link). Questi legami si trovano sia tra

le catene polipeptidiche individuali della tripla elica e tra diverse triple eliche nelle microfibrille. I legami

covalenti sono basati sull’ossidazione dei residui R di lisina, i quali avvengono in presenza di acido

ascorbico come cofattore. Il numero dei legami covalenti delle triple eliche cresce con il peso e con

l’aumento dell’età (es. manzo è meno tenero del vitello).

Capacità delle proteine di assorbire acqua

La struttura tridimensionale della proteina è la struttura più stabile che essa assume a seconda

dell’ambiente in cui si trova. Tolte le proteine di membrana, tutte le proteine generalmente si trovano in

acquoso: tende,

un ambiente acquoso. La struttura nativa delle proteine, dunque, è adatta all’ambiente

a esporre i residui idrofili e a “nascondere” quelli idrofobici. Se i residui idrofili sono esposti,

infatti, si

formano dei legami idrogeno con l’acqua che crea una sfera di idratazione attorno: questo fa in modo che

all’interno dell’alimento l’acqua venga trattenuta. Se la proteina non riesce a trattenere l’acqua, la carne

ad esempio risulta molto dura. Le sieroproteine hanno una grande capacità di trattenere l’acqua. L’acido

glutammico ha un gruppo COOH in più rispetto alla glutammina e, dunque, ha una maggior capacità di

trattenere l’acqua. La proteina può, a seconda delle esigenze, fare in modo di trattenere maggiore o minore

L’organizzazione strutturale delle proteine è importante per le caratteristiche

quantità di acqua.

dell’alimento. Buona parte dei trattamenti tecnologici sugli alimenti vanno a modificare la componente

strutturale della proteine. Le proteine sono normalmente in un ambiente acquoso per cui espongono i

l’esposizione

residui idrofili, mentre meno esposti al solvente sono le regioni idrofobiche (minimizzata

dei residui idrofobi all’ambiente). Ciò da all’alimento la caratteristica di legare l’acqua. La struttura

proteica è fondamentale per determinare la solubilità e la capacità di formare gel ed emulsioni.

Le proteine in base alle loro caratteristiche hanno la capacità di formare dei gel proteici, ovvero delle

organizzazioni strutturali regolari. Una rete proteica è caratterizzata da fori regolari. La rete è in grado di

trattenere qualcosa al suo interno, a seconda delle dimensioni: generalmente acqua e possibilmente una

componente lipidica, micronutrienti legati a proteine o ad altri componenti. La gelatina è un gel formato

da collagene: rete proteica del collagene + acqua. Si tratta di un gel reversibile perché scaldandolo la

struttura del gel si perde e si passa allo stato liquido. Anche il formaggio è un gel: caseine che hanno

interazioni idrofobiche e idrofile mediate dal calcio.

Proteina Alimento Legame coinvolto

Collagene Gelatina Legami idrogeno

++

Caseina Formaggio Ponti ionici (Ca )

Ovoalbumina Uovo cotto Idrofobici e bisolfato

Glutenine/gliadine Pane/pasta Idrofobici e bisolfato

++

Miosina/actina Carne Ponti ionici (Ca )

Agenti che modificano le strutture proteiche:

• Agenti fisici: temperatura, stress meccanico, alte pressioni, radiazioni ad alta energia;

• Agenti chimici: pH, sale, agenti chelanti, composti red-ox, solventi a base di acqua e alcol,

solventi, interferenze olio/acqua.

Generalmente nell’alimento avvengono sia modificazioni chimiche che modificazioni fisiche. 2

L’effetto del pH

Il pH cambia lo stato di ionizzazione degli aminoacidi e, dunque, ne modifica la carica, la solubilità, la

solvatazione, l’abilità di interagire con ioni, l’abilità di interagire con cofattori organici o inorganici.

- La carica viene modificata quando aggiungendo il limone alla carne, questa cambia il colore o

quanto il latte si trasforma in yoghurt. + - -

Il pH agisce sui residui degli amminoacidici carichi (arginina , aspartato , glutammato ). Variazioni della

carica dei residuo amminoacidici fanno sì che questi possano legare in modo diverso microelementi (es.

a pH=3 il calcio non è in grado di legarsi alle proteine)

L’effetto del sale

A bassa molarità l’aggiunta di sale “scherma” le cariche sulla superficie delle proteine e influenza gli

aggregati che si formano per interazione ionica. A bassa molarità favorisce la solubilizzazione proteica.

Ad alta molarità:

Il sale aggiunto compete con i gruppi carichi sulle proteine per l’acqua libera;

- Effetto “salting out” quando è rimosso il guscio proteico di solvatazione;

-

- La solvatazione del sale aggiunto sequestra acqua necessaria per la crescita di microrganismi e

processi enzimatici;

Precipita “trascinando” le proteine;

- Riduce la solubilità favorendo l’aggregazione

- delle proteine.

La quantità di sale necessaria per conservare un prodotto alimentare dipende da come esso vi penetra,

ossia da come viene trattenuto dalle proteine, e questo dipende dal pH.

L’effetto degli agenti chelanti

Agenti chelanti usati comunemente nella tecnologia alimentare sono: polifosfati, citrato o acido citrico,

lattato o acido lattico, EDTA. Essi modificano i micronutrienti presenti nell’alimento e competono con le

catene laterali degli aminoacidi nell’interazione con cofattori metallici o con metalli che stabilizzano

regioni strutturali individuali o interazioni multiproteiche.

destrutturano l’aggregazione delle caseine che dunque riescono ad

I polifosfati, chelando il calcio,

assorbire più acqua, ma in questo modo rendono il calcio non più biodisponibile. Enzimi metallo-

dipendenti come proteasi e ossidasi vengono inattivati e reazioni chimiche metallo-dipendenti, come la

reazione di Fenton, sono sensibilmente rallentate.

Agenti ossidanti e riducenti

Tali sostanze riducono o ossidano i residui degli aminoacidi. In particolare, in tecnologia alimentare

vengono ossidati i gruppi SH della cisteina a formare ponti disolfuro affinché tali residui non siano ossidati

dall’ossigeno con formazione di sostanze secondarie dannose → R-S-S-R.

R-SH + R-SH È possibile

→ R

anche la reazione (scambio disolfuro): R -S-S-R + R -SH -S-S-R + R -SH

1 2 3 1 3 2

Metodi per studiare la struttura e la conformazione delle proteine in una matrice alimentare:

• sull’intero

Metodi spettroscopici: hanno il vantaggio di poter essere eseguiti alimento senza che

sia necessario isolarne le proteine.

o Misurazione della capacità di alcuni residui amminoacidici, soprattutto idrofobici, di

emettere uno spettro di fluorescenza quando stimolati con certe lunghezze d’onde. Lo

spettro (intensità ed energia) emesso dipende dalla struttura della proteina, ossia dalla

presenza e dalla disposizione dei sopraddetti residui. Si impiega soprattutto il triptofano

in quanto idrofobico e presente 1-2v per proteina. 3

o Spettrofotometro a luce polarizzata: se il composto è chirale, la luce polarizzata viene

ruotata di un angolo dipendente dal potere ottico dei diversi aminoacidi e dalla struttura

della proteina. Misurando l’angolo di cui viene ruotata si può determinare le struttura della

proteina.

o Marcatori di fluorescenza (probes): sono molecole che in soluzione non risultano

fluorescenti, ma lo diventano quado legati ad una regione proteica. Vi sono probes con

diverso ingombro, i più grandi si legano se le regioni idrofobiche delle proteine sono molto

esposte. Esistono anche probes spettroscopici in grado di assorbire la luce se legati a

specifici residui amminoacidici.

Queste tecniche possono essere impiegate per esempio per studiare come la sostituzione del 20% del

abbia effetti sulla stabilizzazione delle proteine. La β-lattoglobulina

saccarosio in un dolce è

particolarmente stabile poiché lega una serie di acidi grassi del latte. Per questo motivo essa non è

più agevole l’operazione è

facilmente idrolizzabile al fine di produrre un latte anallergico. Per rendere

necessario privare il latte di parte degli acidi grassi. La modifica della struttura ha rilevanza anche nella

digeribilità delle proteine. Infine, alcune proteine (es. sieroproteine) hanno cavità idrofobiche in cui

“infilarsi”

possono composti idrofobici come polifenoli, aromi, ecc. Tali informazioni sono state dedotte

dall’utilizzo delle tecniche sopradescritte.

E FFETTI DELLA TEMPERATURA

Il calore non è quasi mai in grado di rompere il legame peptidico, tuttavia le proteasi che eseguono tale

operazione sono più efficienti ad elevata temperatura. Il calore può rompere il legame idrogeno il quale

ha un ruolo nello stabilizzare il reticolo acquoso attorno alla proteine. Questo va ad influenzare la struttura

tridimensionale, generalmente si traduce nell’esposizione di regioni idrofobiche (instabilità). La

temperatura agisce anche in modo ridotto sul pKa dei residui amminoacidi. I gruppi R di alcuni aminoacidi

in dipendenza della temperatura e pH possono dare reazioni:

• β-eliminazione: residui di cisteina e serina a dare deidroalanina. La deidroalanina è molto reattiva

e da come principale prodotto la lisinoalanina. Questa composto che si ritrova negli alimenti è

stabile e non è presente in natura. Il fenomeno determina una riduzione del valore aminoacidico

dell’alimento (riduzione di cisteina, serina, Nell’organismo la lisinoalanina

lisina e tripsina).

alimenta metabolismi secondari (cancerogeno?), ma può essere metabolizzata dal microbiota a

dare composti meno tossici.

• Glicazione aspecifica con formazione di composti di Maillard: modificazioni covalenti che

formano composti non fisiologici.

• Formazione di furosina attraverso modificazioni dei residui di lisina. Il quantitativo di furosina

presente nel latte è discriminante per distinguere quello sterilizzato da quello pastorizzato. Viene

valutato anche nei formaggi e nella pasta secca (essiccamento a bassa e ad alta temperatura).

• Formazione di acrilamide in seguito a cottura: il composto si forma durante la deaminazione

dell’asparagina in acido aspartico. Può essere presente in prodotti da forno e amidi fritti; per

impedirne la formazione il prodotto può essere pretrattato per deaminare in condizioni controllate

l’asparagina in acido aspartico.

Una proteina presenta una sola struttura nativa, ma può assumere numerose strutture denaturate diverse

in quanto sono tanti i trattamenti che possono alterare tale struttura. Le modificazioni strutturali possono

essere reversibili, ossia perdurare per la sola durata del trattamento, o irreversibili, ossia mantenersi anche

una volta che il trattamento è cessato. Nel 99% dei casi le proteine vengono modificata durante il

trattamento termico e poi riassume la struttura nativa al termine di questo. Per osservare le modifiche

strutturali si possono utilizzare le tecniche precedentemente illustrate (vedi metodi per studiare la

struttura e la conformazione delle proteine). Infatti, la struttura nativa e le diverse strutture denaturate

β-lattoglobulina

hanno tutte uno spettro di fluorescenza differente. Per esempio, la nativa ha due residui

di triptofano, uno un po’ esposto, altro completamente nascosto. Questa struttura ha uno spettro di

fluorescenza caratteristico (uguale per la proteina in soluzione acquosa e nel siero se non per una modifica

4

di intensità determinata dall’effetto schermo di altri componenti). β-lattoglobulina in un’emulsione di

La

latte ed olio presenta uno spettro differente (diversa intensità e spostamento del massimo), quindi si

deduce che la struttura della proteina in emulsione è diversa da quella in soluzione. Lo spettro è ancora

diversa se la proteina viene sottoposta all’azione della tripsina, se sottoposta ad un trattamento termico o

se si impiega un agente denaturante. Questo è molto rilevante, ad esempio un trattamento può rendere un

allergene non più allergizzante).

Allo stesso scopo possono essere utilizzati i marcatori di fluorescenza (probes) i quali indicano la presenza

l’esposizione delle

di residui idrofobici superficiali. Le modificazioni strutturali (trattamenti) aumentano

regioni idrofobiche. I residui idrofobi esposti conferiscono la tendenza delle proteine a polimerizzare e

diven