Biochimica clinica

GRANDEZZE E UNITÀ DI MISURA

Convenzione Internazionale per la standardizzazione delle grandezze e delle unità di misura:

Biochimica clinica Sistema SI = Sistema Internazionale di Unità

Grandezze e unità di misura Parametro Tradizionale Internazionale

Sodio mg/dL mM

La concentrazione è la quantità di sostanza in un determinato volume, Potassio mg/dL mM

da più diluito a più concentrato. I risultati delle analisi di laboratorio Cloro mg/dL mM

sono spesso espressi con unità di misura diversa e le unità di Calcio mg/dL mM

concentrazione usate possono essere differenti tra laboratori. Le Magnesio mg/dL mM

µg/dL µM

quattro principali unità di misura sono: molarità (M, mM, nM)-unità

M, Ferro µg/dL µM

Rame

di misura internazionale; percentuale (%); quantità di massa (g/L, mg/ Urea mg/dL mM

mL, mg/dL); parti per milione (ppm), per miliardo (ppb) e per trilione Creatina mg/dL mM

(ppt) usati soprattutto in tossicologia. Nel SI la concentrazione è µM

Creatinina mg/dL MOLE

espressa per mol/m³ (M), l’urea mM, Cu proteine in g/dL

M; Glucisio mg/dL mM

tradizionale o g/L internazionale. Intervalli di riferimenti in numeri Lattato mg/dL mM

Una mole di una sostanza pesa la sua massa molecolare espressa in grammi (g = P

µM

Bilirubina mg/dL

variano tantissimo nelle diverse misure, es il cortisone in unità µg/dL

Glucosio (PM = 180 Da) 1 mole = 180 g 2 moli = (180x2)

T4 mM

internazionale ha concentrazione 36-81nM nel cavallo, mentre in unità µg/dL µM

Cortisolo

Cortisolo (PM = 362 Da) 1 mole = 362 g 1,5 moli = (362x1

classiche 1,30-2,93M. Bilirubina (PM = 585 Da) 1 mole = 585 g (~ ½ Kg)

Una mole di sostanza contiene 6,02x10²³ particelle (atomi, ioni, molecole, unità di formula) di quella

sostanza, è una quantità di molecole. Il peso della mole dipende dal peso della singola unità (peso

Insulina (PM = 5800 Da) 1 mole = 5800 g (~ 5 kg)

molecolare della sostanza), es 1 mole di glucosio pesa 180 g/mol, 3 moli di glucosio 3x180=540g/mol. Dato

Emoglobina (PM = 65000 Da) 1 mole = 65000 g (65 kg)

che composti diversi hanno pesi molecolari diversi, a parità di numero di particelle hanno massa diversa

(NB: se so il peso molecolare della sostanza-Da, so quanto pesa 1 mole). Una mole di sostanza pesa la sua

Il numero di moli di una certa quantità di una sostanza equivale al suo peso in gram

MOLE x moli).

massa molecolare espressa in grammi (g=PM diviso il peso molecolare (moli = g / PM)

Una mole di una sostanza pesa la sua massa molecolare espressa in grammi (g = PM x moli) 180 g di Glucosio (PM=180) 180 g /180 1 mole

Glucosio (PM = 180 Da) 1 mole = 180 g 2 moli = (180x2) = 360 g 360 g di Glucosio 360 g /180 2 moli

Cortisolo (PM = 362 Da) 1 mole = 362 g 1,5 moli = (362x1,5)=543 g 500 g di Glucosio 500 g /180 2,7 moli

Bilirubina (PM = 585 Da) 1 mole = 585 g (~ ½ Kg) 362 g di Cortisolo (PM=362) 362 g / 362 1 mole

Insulina (PM = 5800 Da) 1 mole = 5800 g (~ 5 kg) 724 g di Cortisolo 724 g / 362 2 moli

Emoglobina (PM = 65000 Da) 1 mole = 65000 g (65 kg) 1,5 Kg di Cortisolo 1500 g / 362 4,14 moli

ALCUNI MULTIPLI E SOTTOMULTIPLI DECIMALI (PREFISSI)

Multipli e sottomultipli decimali

Il numero di moli di una certa quantità di una sostanza equivale al suo peso in grammi

diviso il peso molecolare (moli = g / PM) 12

tera T 10 1 000 000 000 000

180 g di Glucosio (PM=180) 180 g /180 1 mole 9

giga G 10 1 000 000 000

360 g di Glucosio 360 g /180 2 moli 6

mega M 10 1 000 000

500 g di Glucosio 500 g /180 2,7 moli 3

kilo k 10 1 000

362 g di Cortisolo (PM=362) 362 g / 362 1 mole 2

etto h 10 100

724 g di Cortisolo 724 g / 362 2 moli 1

deca da 10 10

1,5 Kg di Cortisolo 1500 g / 362 4,14 moli -1

deci d 10 0,1

-2

centi c 10 0,01

-3

milli m 10 0,001

-6

micro µ 10 0,000 001

-9

nano n 10 0,000 000 001

-12

pico p 10 0,000 000 000 001

-15

fento f 10 0,000 000 000 000 001

-18

atto a 10 0,000 000 000 000 000 001 M=n moli/1l

La molarità è l’espressione di concentrazione (quantità di sostanza in un determinato volume):

soluzione, mM=mg/L/

es se voglio fare una soluzione di glucosio 1M devo mettere 180g in 1l di soluzione.

PM, la mM è in mmoli/L.

Esercizio: -valore misurato 3mM intervallo di riferimento 40-60 mg/dL, peso molecolare glucosio

⇾mg/dL?,

180 Da. 3mM=3mmoli/L [3mmoli/Lx180mg= 540mg]/L=54 mg/dL (NB:da L a dL se L sotto devo togliere

uno 0).

-valore misurato 2,5 mg/ml soglia anaerobica 4mM=mmol/L, peso molecolare lattato 90Da. 2,5mg/

⇾mM?,

ml/90= 0,027mmoli/ml x 1000=27mmoli/L. CONCENTRAZIONE IN PERCENTUALE (%) 100 mL

Parti del soluto per 100 parti del solvente: % 1000 mL

1 mL

La percentuale (%) indica la parte su 100; peso/peso grammi/100g, peso/ 1 dL 1 L

1 g 100 g 1000 g

Grammi /100 g

volume grammi/100mL (o 1 dL g/dL). 1mL=1g, 100mL=100g 1dL=1hg

⇾ 1 hg 1Kg

Grammi / 100 ml (dL)

1000mL=1000g 1L=1kg. Esercizi: -soluzione fisiologica 0,9% NaCl=0,9g NaCl

NE IN PARTI PER MILIONE (ppm) E PARTI PER MILIARDO(ppb)

in 100mL, 0,9g:100mL=x:1L x=0,009g

-preparare 1 L di soluzione al 3% glucosio: 3g:100mL=x:1000mL x=30g

ntrazioni usate con soluti presenti in tracce e per miscele di

glucosio

ngimi medicati, ecc..).

-preparare 2,5L di soluzione 0,9% NaCl: 0,9g:100mL=x:2500mL x=22,5g NaCl.

ALCUNI MULTIPLI E SOTTOMULTIPLI DECIMALI (PREFISSI)

I ppm sono 10⁻⁶, ppb 10⁻⁹; ppm= mg/L (Kg)= (g)= g/t; ppb= (Kg)=

g/mL g/L

2

cento 1/10

ng/mL (g)= mg/ton. Sono molto utilizzati in tossicologia.

6

milione 1/10

9 12

miliardo ( bilion ) 1/10 tera T 10 1 000 000 000 000

Soluzione fisiologica: 0.9% NaCl 0.9 g NaCl in 100 ml

6

12 ppm: 10 9

trilione 1/10 ppb: 10 9

giga G 10 1 000 000 000

Soluzione 5% di glucosio 5.0 g Glucosio in 100 ml

6

mega M 10 1 000 000

Pesi - volumi Pesi - volumi Conc grassi nel latte intero: 4 % 4.0 g grassi in 100 ml

3

kilo k 10 1 000

ton - ton - Preparare 1 L di soluzione al 3 % di glucosio 30 g di glucosio

(3 g : 100 mL = x g : 1000 mL)

2

etto h 10 100

Preparare 2.5 L di sol. fisilogica (0.9% NaCl) 22.5 g di NaCl

(0.9 g : 100 mL = x g : 2500 mL)

Kg - Kg -

L L 1

deca da 10 10

µg

= g / t

/ mL (g) = -1

deci d 10 0,1

g - g -

mL mL -2

centi c 10 0,01

= ng / mL (g) = mg / t mg - mg -

µL µL -3

milli m 10 0,001

-6

micro µ 10 0,000 001

pg / mL (g) = µg / t µg - µg -

nL nL -9

nano n 10 0,000 000 001

ng - ng -

pL pL -12

pico p 10 0,000 000 000 001

-15

fento f 10 0,000 000 000 000 001

pg - pg -

fL fL -18

atto a 10 0,000 000 000 000 000 001

Esercizio: -8ppm= 8g/mL; 0,3ppm= 300ng/mL; 2ppm= 2mg/Kg; 7ppb= 7ng/mL; 0,2ppb= 200g/t.

-Tetracicline nel latte 0,5ppb (limite di legge); se in un campione di latte la concentrazione di tetracicline è

0,04g/mL, viene superato il limite? 0,04g/mL=0,04ppm=40ppb (non può essere utilizzato).

La presenza di enzimi nel sangue può indicare che un tessuto è danneggiato. La quantità degli enzimi si

esprime con l’intensità (velocità) della reazione catalizzata, la velocità degli enzimi è direttamente

proporzionale alla velocità della reazione da essi catalizzata. Ci sono due sistemi per vedere quanto va

veloce la reazione: -sistema tradizionale⇾ quantità di enzima in grado di convertire 1mole di substrato in

prodotto in 1 minuto (mol/min);

-SI⇾ katal (kat), quantità di enzima che converte 1 mole di substrato in prodotto in 1 secondo (moli/sec),

normalmente si usano i sottomultipli.

Esercizio: -preparare 10mL di una soluzione di un antibiotico a concentrazione 1mg/mL avendo a

disposizione una soluzione iniziale madre con concentrazione 25mg/mL. 1mg/mL x 10mL= 10mg 25mg/

mL:1mL=10mg: x mL x=10/25=0,4mL antibiotico, 10-0,4=9,6mL fisiologica

V1 x C1=V2 x C2

oppure uso V1=(10,1)/25=0,4mL

Metodi di analisi biochimiche in laboratorio

Lo sviluppo del colore è dovuto al diverso comportamento delle onde elettromagnetiche nei confronti della

soluzione considerata.

I metodi di analisi biochimiche in laboratorio possono essere diretti o indiretti: -analisi indiretta⇾ rilevano e

quantificano analiti dopo reazioni o dopo separazione degli altri componenti del campione; le reazioni

possono essere chimiche, enzimatiche o immunochimiche, le separazioni si classificano in elettroforesi e

cromatografia.

-analisi diretta⇾ si considera l’analita, quindi si rilevano e quantificano gli analiti di interesse biochimico

clinico senza una separazione o una reazione chimica/biochimica; si diversificano metodi elettrochimici, es

calcolo pH, e la fotometria atomica.

La differenza principale è che nel caso dell’analisi diretta si vede subito l’analita, mentre in quella indiretta

sono necessarie delle reazioni (spesso più di una); in entrambi i casi comunque alla fine si vanno a vedere le

onde elettromagnetiche (sinonimo di energia radiante), misurate attraverso il luminometro, metodi

fotometrici (es analisi urine-indiretta), immunochimici con reattivi marcati, metodi non specifici di

colorazione degli acidi nucleici (analisi del DNA-onde elettromagnetiche fluorescenti alla luce UV). NB:

applicazione delle onde elettromagnetiche in tutti i tipi di analisi di laboratorio.

L’onda elettromagnetica è una radiazione le cui caratteristiche più importanti da considerare in laboratorio

sono: -lunghezza d’onda distanza tra due picchi (fra un punto in un ciclo e lo stesso nel ciclo

⇾

successivo), a seconda della lunghezza d’onda si hanno diversi colori. Ci sono delle specifiche lunghezze

d’onda che la retina riesce a convertire in impulso nervoso (spettro visibile), in particolare vanno da 350 a

ENERGIA RADIANTE

800nm, ognuno con diverso colore. In laboratorio biochimico si usano principalmente le misurazioni visibili

Lunghezza d'onda (l). Distanza fra un punto in un ciclo e il punto corrispondente nel ciclo

e gli UV (200-300nm, usati per vedere il DNA). Altri tipi di lunghezze d’onda comprendono raggi X, ,

successivo. Lo spettro elettromagnetico è costituito dall'insieme delle onde e può essere

infrarossi. l

diviso in regioni caratteristiche a seconda delle

Wavelength (l) METODI BASATI SULL'ENERGIA RADIANTE

Le informazioni sull'analita o di un suo prodotto di reazione sono ottenute misurando radiazioni

-intensità⇾ energia che passa attraverso un’area unitaria nell’unità di tempo; legata alla quantità della

Intensità (I). Energia che passa attraverso un'area unitaria nell'unità di tempo e si misura in

elettromagnetiche

sostanza presente-quante onde ci sono, colore più o meno intenso. Si misura in watt/m² ed è proporzionale

2

watt/m . E proporzionale al quadrato dell'ampiezza.

al quadrato dell’ampiezza. In sostanza l’intensità è la quantità di onde elettromagnetiche (dipende da

L'intensità di un fascio di onde elettromagnetiche può anche essere considerata come il

quantità e spessore). numero di fotoni che attraversa una sezione unitaria di un campione nell'unità di tempo:

intensità luminosa e flusso luminoso (Lumen, Lux, Candela)

Misurando la lunghezza d’onda delle radiazioni è possibile fare una analisi qualitativa; con l’intensità si fa

Trasmesse/ Assorbite 1) Fotometria e Spettrofotometria di assorbimento

una analisi quantitativa. Intensity (I)

Dopo la reazione nella provetta le onde elettromagnetiche possono essere:

-assorbite o trasmesse⇾ la metodica è fotometria e spettrofotometria di

Rifratte/Difratte 1) Turbidimetria, Nefelometria

assorbimento; 2) Rifrattometria

-rifratte o difratte⇾ onde deviate, cambia la rifrazione, metodi turbidimetria, Refracted

nefelometria o rifrattometria;

-riflesse⇾ spettroscopia di riflettanza;

Riflesse 1) Spettroscopia di riflettanza

-prodotte⇾ fluorimetria, luminometria, spettroscopia di emissione atomica, non

si considera il colore già presente, ma quello che viene prodotto.

Radiazioni assorbite: l’assorbanza misura le onde elettromagnetiche assorbite dalla sostanza, intensità delle

onde elettromagnetiche trattenute dalla cuvetta; gli strumenti utilizzati per misurarla sono colorimetro

(misura le onde visibili) e spettrofotometro (misura le onde visibili e non), c’è una sorgente di energia, un

Prodotte 1) Fluorimetria

selettore di lunghezza d’onda e un rilevatore di onde elettromagnetiche. Per la misurazione dei raggi UV

2) Luminometria

bisogna tenere conto che il vetro ferma questi raggi, quindi le provette devono essere di quarzo.

3) Spettroscopia di emissione atomica

Una specifica onda elettromagnetica viene fermata da una certa sostanza in base alla sua struttura chimica;

ogni sostanza ha uno specifico spettro di assorbimento, cioè un’onda elettromagnetica colpisce una

sostanza e si ferma in essa solo se la sua lunghezza d’onda è in grado di andare a interferire con la

costituzione elettronica della sostanza, l’energia è uguale a quella che fa saltare un elettrone da un livello

inferiore a uno superiore. Un protone o un elettrone ha una sola lunghezza d’onda che viene assorbita, ma

METODI BASATI SULLAMISURA DI RADIAZIONI ASSORBITE

una molecola più complessa assorbe diverse lunghezze d’onda in relazione alla sua composizione e visto

SPETTRO DI ASSORBIMENTO

che ogni molecola è diversa, anche le onde elettromagnetiche assorbite sono diverse. Le molecole in realtà

non hanno la capacità di assorbire le onde elettromagnetiche, ma hanno spettri di assorbimento diversi. Lo

Assorbanza vs lunghezze d'onda danno una curva di assorbimento o spettro di

spettro di assorbimento è un grafico caratteristico di ogni sostanza fotoassorbente (es bilirubina ha uno

assorbimento caratteristico di ogni sostanza fotoassorbente

spettro che assorbe tra 400-500nm) che rappresenta quanto viene assorbito, quindi le onde

elettromagnetiche trattenute, rispetto alla lunghezza d’onda; gli atomi hanno spettri a righe-assorbono a

Atomi Spettri a righe

valori specifici, le molecole hanno spettri continui, le differenze tra gli spettri di molecole dipendono dalla

loro composizione (es colore carne deriva dallo stato chimico delle molecole di mioglobina). Negli spettri a

Molecole Spettri continui

righe a seconda della geometria dell’atomo viene prodotta una linea di assorbimento (estremamente

atomo-specifica), usata per identificare la composizione chimica dei mezzi che la luce può attraversare, es

Ca 442,7nm.

L’assorbanza (ABS) è una trasformazione matematica della trasmittanza (T). La trasmittanza è il rapporto tra

l’intensità delle onde elettromagnetiche trasmesse e quelle che sono passate, intensità a una specifica

lunghezza d’onda, T=I/I₀, normalmente viene messa in % (T%=Tx100), è priva di unità di misura e può

avere valori tra 0 e 1 (in % da 0 a 100⇾ 0% non è passato niente, 100% è passato tutto). L’assorbanza di

ABS= log(1/T)=

una soluzione è il logaritmo decimale del reciproco della trasmittanza log(100/T%)= 2-

log(T%), ha valori che possono andare da 0 a 2. Se ho 0% di onde assorbite, T% 100, ABS è 0; se 99% I

assorbita, T% 1, ABS è 2. Esercizio: T=1% ABS=log(100/1)=2, T%=0,1 ABS=log(100/0,1)=3.

DALLA LETTURA STRUMENTALE ALLA CONCENTRAZIONE DELLANALITA

(T%)

Trasmittanza

La trasmittanza (T) all’aumentare della concentrazione diminuisce (inversamente

proporzionale), la funzione della concentrazione è esponenziale, quindi T

diminuisce in modo iperbolico. L’assorbanza all’aumentare della concentrazione

L utilizzo dell assorbanza

permette facilmente di

aumenta, la funzione della concentrazione è una sigmoide con una regione Concentrazione

evidenziare dove la curva dose

lineare, quindi il vantaggio è che vedo dove al variare della concentrazione

risposta perde di

proporzionalità: range di

l’assorbanza aumenta o diminuisce (molto meglio usare ABS che T) e trovo il

linearità del dosaggio. Assorbanza

range di linearità del dosaggio (nel range valore varia in modo lineare).

Trasmittanza e assorbanza non dipendono soltanto dalla concentrazione

dell’analita, ma anche da intensità della luce incidente, lunghezza d’onda della

luce incidente, spessore attraversato, natura chimica della sostanza assorbente,

concentrazione del soluto. Concentrazione

Onde rifratte: la rifrattometria si basa sull’indice di rifrazione, cioè la variazione subita dalla radiazione

luminosa quando attraversa un mezzo più o meno trasparente. In veterinaria questo metodo viene utilizzato

per valutare indirettamente la presenza di proteine e il peso specifico delle urine (maggiore rifrattarietà

indica maggiore presenza di proteine e peso specifico). Lo strumento usato è il rifrattometro che usa le

onde elettromagnetiche, misura l’angolo di rifrazione in un liquido, può essere dotato di una sorgente

luminosa e di un sensore che verifica l’angolo deviato dell’onda. L’angolo di rifrazione è maggiore

all’aumentare della concentrazione delle sostante presenti, dà solo un’indicazione generale sulla presenza

di esse, non dice quali sono e quante.

Altri metodi di tipo indiretto per misurare le onde rifratte sono torbidimetria e nefelometria, che misurano il

risultato di reazioni chimiche, biochimiche e immunochimiche che producono precipitati in soluzione non

trasparenti alle onde elettromagnetiche, in particolare si formano delle particelle insolubili che producono un

insieme di fenomeni di onde elettromagnetiche (assorbimento, riflessione e diffrazione). È come se si

usasse uno spettrometro che, al posto di misurare le onde elettromagnetiche as