biochimica clinica

LEZIONE 1

Che cos’è la medicina di Laboratorio

La Medicina di Laboratorio è una disciplina che ricerca dati relativi alla natura e all’entità delle

alterazioni di struttura e funzione, su campioni ottenuti dal paziente e sul paziente stesso, per

elaborarli in informazioni. È compito della Medicina di Laboratorio individuare, mettere a punto e

valutare criticamente il significato clinico di analisi chimiche da eseguirsi su materiali biologici

prelevati da pazienti allo scopo di:

• Riconoscere le malattie (diagnosi)

• Controllarne l’evoluzione

• Prevederne i possibili esiti (prognosi)

• Valutare l’efficacia dei trattamenti terapeutici

Come si svolge una diagnosi

• Anamnesi: storia clinica del paziente

• Esame clinico

• Indagini strumentali: per esempio eco, radiografie, tac, risonanze

• Indagini di laboratorio

Tipologie di laboratori

• Laboratori di routine

Biochimica clinica (dosaggi di molecole semplici, es. glicemia)

• Ematologia e coagulazione

• Biologia molecolare clinica

• Microbiologia

• Virologia

• Immunologia

• Dosaggi ormonali

• Immunotrasfusione

•

• Laboratori di urgenza: h24

funzionano sia per i pazienti ricoverati che non

• Points of care: analisi effettuate nel

non sono dei laboratori ma sono che possono essere

luogo in cui si trova il paziente tipo in casa, a letto in reparto, in ambulatorio. Per esempio

possono essere utilizzati dipstick per le analisi delle urine, dispositivi palmari come i glucometri,

o analizzatori molecolari sofisticati come quelli per la rilevazione di malattie infettive

Ruolo e interfaccia tra il laboratorio e la clinica All’interno del referto - che poi verrà

portato al medico che emetterà una

diagnosi - si trovano tra parentesi i

valori di riferimento della

popolazione normale e accanto ad

essi i valori misurati al paziente. La

presenza di un * accanto a un valore

sta a indicare che siamo in presenza

di un parametro alterato.

Uso razionale dei test di laboratorio 30-50%.

Il grado di inappropriatezza dei test di laboratorio oscilla tra Ci deve essere sempre una

ragione alla base della richiesta di indagini di laboratorio per un paziente in quanto se il test

richiesto non fornisce informazioni rilevanti il suo impiego è irragionevole. Perciò, prima di

richiedere un test occorre conoscere:

• la fisiologia dell’analita: struttura, sorgente, distribuzione nel corpo, modalità di escrezione,

emivita, variazioni fisiologiche etc.

• i meccanismi patologici che possono produrre variazioni della concentrazione dell’analita

• appropriati intervalli di riferimento

• eventuali interferenze in vivo e in vitro

→

Esempio se ci troviamo di fronte a un paziente malato di diabete 1, sarà inutile prescrivere

l’insulinemia (quantità di insulina presente nel sangue) in quanto quel paziente si inietta l’insulina.

Piuttosto di dovrà prescrivere l’esame che misura il peptide C, il quale fa parte della proinsulina e

viene prodotto quindi in quantità equimolari ad essa. Quindi la misura del peptide C è indicata per

valutare la capacità di produzione di insulina da parte delle cellule beta del pancreas.

→ del miocardio

Esempio nel caso dell’infarto vengono rilasciate in circolo due proteine, ovvero la

mioglobina e la troponina. Il problema è che il rilascio di queste avviene in tempi diversi, cioè il

livello della mioglobina sale dopo circa 1h dall’infarto, quello della troponina aumenta solo dopo

3h. Per cui, a seconda del tempo che è intercorso tra infarto e arrivo in ps si dovrà conoscere

questo meccanismo fisiologico in modo da prescrivere l’esame più opportuno tra i due.

A che scopo si chiedono test di laboratorio?

• screening →

Per finalità di in assenza di segni o sintomi: es. screening neonatali; screening in

gravidanza per il diabete (la placenta produce un ormone che compete con l’insulina e quindi

aumenta la glicemia, tanto che poco prima del parto quanto la placenta funziona meno il

diabete sparisce); screening per la spina bifida; screening nell’adulto

• fase diagnostica →

Nella conferma o esclusione di un sospetto clinico:

per istituire un trattamento immediato (esami d’urgenza)

• prima di attuare un trattamento generale

•

• monitorare:

Per

il decorso della malattia

• il livello dei farmaci

•

• finalità medico-legali

Per

• ricerca

Per (consenso specifico del paziente)

Tipi di campioni biologici

• Sangue venoso (il più utilizzato), arterioso (per emogasanalisi) o capillare (glicemia)

• Urine → raccolta delle urine:

Campione di più semplice raccolta

• Recipiente pulito ed in alcuni casi sterile

• Esame completo delle urine: campione della prima minzione mattutina

• Rapido invio al laboratorio

• Modalità di raccolta e conservazione: mattutina, 24h

• Precauzioni

• Modalità di raccolta per indagini microbiche

•

• Feci

• Liquidi biologici: liquido cefalo-rachidiano, liquido seminale, liquido pleurico, etc.

• Liquido amniotico, villi coriali (indagini prenatali)

Sangue

Le analisi più diffuse sono su:

• Sangue intero: elementi corpuscolati

è costituito da (globuli e

e plasma

piastrine) ed è di colore rosso scuro. Viene prelevato in una

vacutainer) anti-coagulante

provetta (spesso si usano provette chiamate contenente un in gel.

Il sangue intero si può usare, ad esempio, per l’esame emocromocitometrico (per contare le

cellule del sangue).

• Plasma: sangue privo degli elementi corpuscolati

il plasma è la e si ottiene dopo aver messo il

anti-coagulante

sangue in una provetta con un e averlo sottoposto a centrifugazione. Dopo la

sedimentazione si ottiene la separazione tra la parte corpuscolata (intorno al 45%) e la parte

liquida (normalmente circa il 55%), cioè il plasma di colore giallognolo.

• Siero: plasma privo dei fattori di coagulazione,

il siero è dato dal e infatti in questo caso nella

non anti-coagulante.

provetta c’è In questo caso la sedimentazione avviene grazie al

processo coagulativo al termine del quale dal fibrinogeno si formerà la fibrina che porterà sul

fondo della provetta sulla la parte cellulare ematica (globuli rossi, bianchi e piastrine). Anche il

siero come il plasma ha un colore giallognolo.

Quindi nel plasma trovo il fibrinogeno, nel siero non trovo fibrinogeno perché c’è stata

coagulazione.

provette tappi di colori differenti,

Le hanno a ognuno corrisponde un tipo di campione. Per

esempio nella provetta col tappo rosso non ci sono anti-coagulanti e quindi servirà per ottenere

riempita tutta

un siero, in tutte le altri ci sono anti-coagulanti diversi. La provetta va perché

l’anticoagulante che c’è è tarato per quel volume lì preciso.

Metodo di prelievo

• Bisogna eseguire il prelievo di sangue venoso evitando un’eccessiva stasi venosa che può

indurre fenomeni di emoconcentrazione

• Molti errori effettuati durante la raccolta e la preparazione del campione possono portare ad

emolisi: il 60% dei campioni non vengono processati a causa di questo errore. Si ha emolisi

quando la membrana cellulare dei globuli rossi viene distrutta con conseguente passaggio delle

componenti intracellulari, emoglobina compresa, nel siero o nel plasma (cellula in soluzione

ipertonica e ipotonica). Per evitare emolisi è importante far defluire il sangue nella provetta

spontaneamente e delicatamente.

Grandezze e unita di misura in biochimica clinica

La concentrazione di un analita può essere espressa come:

• Concentrazione di massa: massa dell’analita (g, mg, ng, pg) contenuta in un determinato

volume (L, dL, mL) del materiale esaminato

• Concentrazione di sostanza: concentrazione dell’analita espressa come molarità cioè in mol/

L. La concentrazione di sostanze ioniche (ad es. Na+,K+) è spesso espressa in equivalenti/litro

(Eq/L) dove 1 Eq = 1 mol/n. di carica. Le concentrazioni di sostanze aeriformi sono spesso

sostituite dalle rispettive pressioni parziali (ad es. pO2 pCO2)

• Concentrazione di attività: si usa per sostanze caratterizzate da una attività biochimica (ad

esempio enzimi) e corrisponde all’attività dell’analita, misurata in opportune Unità (U), presente

in un determinato volume del materiale esaminato (U/L, U/mL)

Nelle determinazioni urinarie si fa talora riferimento alla quantità (o all’attività) dell’analita

contenuta nelle urine di 24h.

Tipologie di esami biochimico clinici

• Analisi singole: analisi che, anche se effettuate contemporaneamente sullo stesso campione,

non sono correlate tra loro. Ciascuna fornisce una risposta ad un quesito specifico (es. glicemia

+ colesterolemia + creatininemia (valutazione funzionalità renale) costituiscono un insieme di

analisi singole)

• Raggruppamenti analitici: analisi tra loro correlate, i cui risultati, valutati nel loro insieme,

concorrono a fornire una risposta abbastanza esauriente a certe problematiche cliniche. Ad

spesso sete, urino tanto, dimagrisco molto”

esempio “ho classici sintomi diagnostici del

glicemia, glicosuria, emoglobina glicata

diabete; il medico prescrive: cioè tre test che

concorrono a dar conferma di una malattia. Alla fine dei tre esami, si è in grado di rispondere al

quesito diagnostico “diabete si - diabete no”.

• Prove dinamiche: le prove dinamiche consistono in analisi singole o gruppi di analisi eseguite

più volte nel tempo, oltre che in condizioni basali anche dopo una opportuna stimolazione, così

da valutare la risposta a tale stimolazione. Solitamente sono esami di secondo livello. Esempio

→ un soggetto sano ha un valore della glicemia <110mg/dL, mentre il soggetto malato ha un

valore ≥126 mg/dL. Se un soggetto ha un valore di glicemia lontano dai pasti ≥110mg/dL

(valore di riferimento) ma <126 mg/dL, è necessario approfondire con un test di secondo livello,

tramite una prova dinamica, curva da carico per il glucosio: prelievo basale al soggetto

(glicemia basale) cioè il soggetto deve assumere glucosio sciolto in acqua al 50% (circa 75gr di

glucosio) e dopo 2h si rifà la glicemia. Se ≥ 200 mg/dL = diabete. Quindi nella prova dinamica,

in caso di diagnosi di diabete, riusciamo a capire come l’organismo reagisce ad un carico di

glucosio.

LEZIONE 2

Raggruppamenti analitici

• Profilo biochimico: aspetti biochimico-

gruppi di analisi volti ad esplorare particolari

metabolici. Ad esempio le indagini emogasanalitiche (pO2, pCO2, pH, HCO3-) per valutare la

funzionalità respiratoria e l’equilibrio acido-base (acidificazione del plasma dovuta al diabete*)

• Profilo d’organo: gruppi di analisi che valutano marcatori specifici per mettere in evidenza

lesioni o disfunzioni

eventuali di un organo. Ad esempio i profili epatici possono comprendere

indagini atte a rivelare sofferenza epatocellulare, indagini indicative di colestasi, indagini che

esplorano particolari funzioni dell'epatocita (funzione proteosintetica, escretrice, ecc.). Nel

soggetto in cui il clinico sospetta epatopatia (sospetta disfunzione epatica) si valutano diversi

marcatori epatici per le diverse funzioni del fegato:

transaminasi: valutazione danneggiamento fegato

• fosfatasi alcalina: valutazione della stasi della bile

• bilirubina

• proteine plasmatiche (il fegato produce circa la metà delle proteine plasmatiche)

•

• Protocolli diagnostici: gruppi di esami atti a rispondere a un determinato quesito diagnostico

*chetoacidosi diabetica: quando si ha un deficit assoluto di insulina, il glucosio non riesce ad

entrare nelle cellule e queste si adattano ad utilizzare prevalentemente acidi grassi; il metabolismo

degli acidi grassi, in assenza di adeguate quantità intracellulari di glucosio, volge verso la sintesi

di sostanze chiamate chetoni o corpi chetonici. L'accumulo di corpi chetonici nel sangue,

l'iperglicemia e il deficit di insulina, determinano quindi i sintomi caratteristici e le complicanze

della chetoacidosi diabetica, che in situazioni estreme può rivelarsi addirittura fatale.

Controllo di qualità in biochimica clinica

Esistono dei requisiti che ogni laboratorio deve soddisfare per poter essere considerato un

controllo

laboratorio attendibile. Esiste un centro regionale (Careggi per la Toscana) deputato al

di qualità dei laboratori; questo centro invia ai laboratori (pubblici e privati) dei campioni con dei

parametri a titolo fisso che devono essere analizzati e se i risultati, che ogni laboratorio riscontra,

si discostano troppo dai valori veri il laboratorio non viene accreditato. Nella sua utilizzazione

corrente il termine “controllo di qualità” si riferisce alla fase analitica propriamente detta. Per la

verità la produzione di risultati attendibili dipende anche dalle fasi pre- e post-analitica. Il controllo

di qualità in biochimica clinica serve a garantire l’attendibilità dei risultati forniti dal laboratorio e

assicurare procedimenti

va a comprendere un insieme di interventi atti ad che i utilizzati

possiedano seguenti requisiti:

in misura adeguata i

Sensibilità limite di

piccole quantità

capacità di dosare quantificata dal

rivelazione,

dell’analita in esame cioè la quantità minima

di analita che può essere osservata

con sufficiente grado di sicurezza

Specificità esclusivamente

capacità di dosare non quantificabile

sostanza in esame

la

Precisione indici di

capacità di fornire risultati quantificata da

dispersione

(si distinguono la ripetibilità e la concordanti tra loro se derivano da (deviazione standard,

riproducibilità) analisi effettuate sullo stesso coefficiente di variazione)

campione

Accuratezza grado di

capacità di fornire valori il più vicino quantificata dal

inaccuratezza o BIAS,

possibile al valore “reale che in

formula è: (valore trovato - valore

vero) / (valore vero) x 100

Traguardi analitici →i livelli di sensibilità, specificità, precisione e accuratezza che dovrebbero

essere raggiunti. Per la precisione e l’accuratezza i traguardi analitici sono rappresentati dai

analitica) non

livelli di imprecisione (CV e di inaccuratezza (BIAS) che dovrebbero essere

variabilità

superati. Tali livelli non sono uguali per tutti gli analiti, ma dipendono dalla loro

biologica. →

Sensibilità e specificità caratteristiche intrinseche al procedimento analitico, quindi dipendono

dal metodo e dagli strumenti usati in laboratorio. Possono influenzare il grado di precisione e

accuratezza. →

Accuratezza e precisione parametri che dipendono anche dall’efficienza del laboratorio, cioè

dagli errori che possono essere commessi nel corso delle analisi di laboratorio. Per questo motivo

controlli preliminari continuativi.

questi due requisiti necessitano di e

Tipi di errori

• sistematici:

Errori errori che si ripetono ogni volta che si fa un certo tipo di analisi (es. errori

dovuti a reattivi scaduti o difetti di taratura della vetreria). Influenzano l’accuratezza.

• grossolani:

Errori sono errori macroscopici umani che talvolta possono capitare (es. viene

sbagliato l’anticoagulante oppure un’etichetta sulla provetta).

• accidentali (o casuali):

Errori sono inevitabili, quindi possono essere ridotti ma mai eliminati

completamente (es. sistemi termostatici non a punto, assenza di corrente elettrica). Influenzano

la precisione e infatti è in conseguenza di questi errori che una serie di determinazioni effettuate

sullo stesso campione non fornisce mai risultati identici.

Variabilità dei dati biochimico clinici

La variabilità dei dati biochimico-clinici può dipendere da diversi fattori: variazioni in vivo della

grandezza misurata sul campione del paziente, alterazioni alle quali può andare incontro il

materiale biologico nel periodo che intercorre tra prelievo e analisi, procedimento analitico

utilizzato (in particolare dalla sua precisione e accuratezza). La variabilità complessiva dei dati di

laboratorio è la risultante quindi di tre componenti:

• biologica

Variabilità (fattori genetici, stile di vita, lavoro, fattori ambientali, assunzione di

farmaci…). Anche considerando soggetti omogenei per tutte queste condizioni, resta sempre

una variabilità di ordine biologico che può essere distinta in intra- e inter-individuale (è a queste

due forme di variabilità biologica che si fa riferimento nella definizione dei traguardi analitici per

la precisione e l’accuratezza)

• pre-analitica

Variabilità

• analitica

Variabilità

Termini di confronto dei dati biochimico clinici

L’uso clinico dei valori riscontrati in un individuo deriva dal confronto con altri valori

• Valori di riferimento

• Valori decisionali: valori soglia

sono dei che non fanno capo ad una popolazione di riferimento

ma sono valori scelti in laboratorio in base all’esperienza clinica. Quindi il medico dovrebbe

sempre far riferimento ai valori decisionali e non di riferimento. Bisogna osservare anche i valori

precedentemente analizzati nello stesso individuo per controllare la patologia.

• Valori precedentemente osservati nello stesso individuo: permettono di analizzare il decorso

della malattia e la rispondenza ai trattamenti farmaceutici.

• Valori clinici

VALORI DI RIFERIMENTO (normali) intervallo di riferimento.

Sono generalmente