Biochimica cellulare

Biochimica cellulare

Ciclo cellulare

La divisione degli organismi eucariotici è molto più complicata di quella dei batteri. Nei batteri l’organizzazione cellulare è priva di nucleo, non c’è compartimentalizzazione e anche la divisione cellulare prosegue in maniera abbastanza semplice. Nelle cellule eucariotiche, invece, tutto questo è molto più complicato per la presenza di organelli cellulari che cooperano e sono coordinati tra di loro.

Importanza della divisione cellulare

Quanto è importante la divisione cellulare? Moltissimo, in tantissimi momenti, in tutta la vita di un organismo, sia esso unicellulare che pluricellulare. In particolare, per esempio, pensiamo alla fertilizzazione di un uovo: la nascita di un nuovo individuo dipende dalla divisione cellulare e i due zigoti che si incontrano devono essere competenti, nel senso che devono potersi incontrare in un momento in cui si trovano nella stessa fase del ciclo cellulare. Questo è anche abbastanza intuitivo perché, se noi facciamo una fertilizzazione di una cellula che si trova nella fase S divisione cellulare con l’altra che si trova nella fase G, troveremo materiale genetico sfalsato, mentre uno si sta duplicando l’altro invece è già duplicato perché esce dalla mitosi. Quindi ci deve essere un controllo specifico finché la fusione avvenga nel momento in cui tutte quelle cellule sono nella stessa fase del ciclo ed in particolare in G₁.

È importante anche nella crescita, perché senza la divisione cellulare non si crescerebbe, ma non si potrebbero riparare anche dei danni. Quindi, ad esempio, la ferita che ci procuriamo sulla pelle; la pelle è fatta di fibroblasti, i fibroblasti normalmente sono bloccati nel loro ciclo cellulare, però, quando c’è una ferita, il flusso sanguigno porta fattori di crescita che sono dei nutrienti per far sì che le cellule capiscano che devono mettersi in moto e ridividersi, proliferare, per saldare il danno. Quindi questi sono degli esempi in cui una divisione cellulare è importante.

Compattazione del DNA

Parliamo velocemente dell’importanza della materia del genetico sotto forma di DNA, che sono visibili durante il ciclo cellulare, esclusivamente in metafase. In questa slide vediamo i livelli di organizzazione e di compattazione del DNA, e questo serve da ricordare nelle varie fasi della mitosi per sapere in quale stato vediamo il materiale genetico in funzione delle fasi del ciclo cellulare. Quindi quando ci troviamo genericamente in interfase la cromatina è eterodispersa e quindi è una massa fatta di sequenze di DNA, a mano a mano che invece si compatta, il DNA si superavvolge su se stesso intorno ad ottamero di istoni, istoni che sono 8 in totale, ma sono due coppie da quattro di H2A, H2B, H3 e H4, e poi molto importante è l’istone H1 che è l’istone di collegamento tra un nucleosoma e l’altro.

La porzione di DNA che si trova tra un nucleosoma e l’altro è di circa 200 basi e l’istone H1 si inserisce a questo livello. C’è poi tutto un metabolismo dietro sulla presenza delle modifiche post-traduzionali degli istoni. Sta emergendo negli ultimi anni che estremamente importanti, non sono solo le modifiche delle varie proteine che regolano il ciclo cellulare, ma anche le modifiche degli istoni, soprattutto gli istoni H3 e H4, che si trovano all’interno del nucleosoma. Le modifiche di cui stiamo parlando sono acetilazione e metilazione.

Con acetilazione e metilazione noi andiamo a regolare l’espressione genica. In linea di massima le acetilazioni sono attivatorie e le metilazioni sono inibitorie, diciamo in linea di massima perché poi dipende da quale residuo specifico dei vari istoni. Il codice epigenetico è un codice che sta al di sopra del codice delle quattro basi, perché il codice delle quattro basi dalla sequenza di DNA, dalla sequenza di DNA ovviamente noi abbiamo per complementarietà la sequenza del trascritto, dalla sequenza del trascritto abbiamo le proteine, quindi quella è la prima base del codice genetico, ma le modifiche istoniche sono quelle che ci dicono se un gene è espresso oppure no, quindi se noi andiamo da una forma di cromatina compatta ad una forma invece espansa, e quelle sono maggiormente a carico di acetilazione e metilazione degli istoni H3 e H4, in particolare di lisine che si trovano in determinate posizioni di sequenza.

A noi interessa l’istone H1, perché vedremo che l’istone H1 è uno dei bersagli del complesso ciclina-CDK. Il superavvolgimento del nucleosoma fa l’elica, poi il livello di condensazione è maggiore, in cui abbiamo dei cromosomi che sono visibili nella metafase mitotica, ed è nella metafase mitotica che noi li osserviamo tutti, nella piastra equatoriale si può fare quello che si chiama il cariotipo. Per quello che ci riguarda in questo percorso del ciclo cellulare, andiamo da una forma eterodispersa nell’interfase alla forma compattata durante la mitosi, e ci sono ovviamente tutte le fasi intermedie. In questo slide vediamo come si presentano i cromosomi, nella forma non condensata, quindi in (a) un reticolo e in (b) la forma condensata.

La gran parte del tempo noi la spendiamo in interfase, quindi noi abbiamo che nel 95% del tempo la cellula si trova G₁, S e G₂ e solo una piccola parte è dedicata alla mitosi vera e propria. Più tardi vedremo come facciamo a stabilire quanto tempo dura ogni singola fase, però scopriremo che la mitosi è la più corta, perché in realtà la cellula si prepara a dividersi, quindi ci mette tanto tempo per capire, controllare, sintetizzare il DNA, controllare che tutto il DNA sia stato sintetizzato, poi nel momento in cui è arrivato all’ultima fase di controllo, la mitosi è come se fosse l’ultima parte dell’esecuzione di un programma, velocemente si va in mitosi. Quindi la frase della mitosi è la più facile, quella più spedita e quella più immediata, tutto il resto è tutta fase di preparazione.

Struttura dei cromosomi

Dei cromosomi dobbiamo ricordare come sono costituiti, hanno al centro, poi spostati verso i vertici, una struttura particolare chiamata centromero, che interesserà in particolare questo corso, il centromero è una zona di eterocromatina, quindi non sottoposta a trascrizione, ma sono delle sequenze estremamente importanti perché legano delle proteine, che sono proteine centromeriche, queste proteine centromeriche saranno responsabili dell’aggancio di cromosomi da parte delle fibre del fuso mitotico, fibre del fuso mitotico che sono costituite da una proteina polimerica che è la tubulina, quindi la tubulina si andrà a legare esattamente al centromero, il centromero divide il cromosoma in porzioni che si chiamano braccio p, che è quello più corto, il braccio q, che è quello più lungo.

I geni quindi sono localizzati sui cromosomi, quindi un numero di cromosomi in particolare, ma ci sarà la presenza della p o della q che ci indicherà se quella porzione di gene è sul braccio corto o sul braccio lungo. Perché oltretutto è importante il centromero? A livello del centromero ci sono delle proteine che si chiamano coesine, dal nome si intuisce che queste proteine mantengono insieme i due cromatidi fratelli. Ci sono molte proteine a livello dei cinetocori, ma ci sono coesine su tutto il braccio del cromosoma, quindi i due cromatidi fratelli, in realtà, stanno attaccati gli uni agli altri, quindi quando questi si dovranno dividere noi dobbiamo separarli, ma per separare tutte queste coesine dobbiamo idrolizzarle, le dobbiamo degradare, quindi quando arriveremo in questa parte dobbiamo ricordarci che i cromatidi fratelli sono legati tra loro non solo nei centromeri, ma lungo tutta la lunghezza dalle coesine.

In questa slide vediamo il braccio p e il braccio q, vediamo la diversa colorazione che ci indica le porzioni di eterocromatina (azzurro più intenso) e di eucromatina (azzurro più chiaro). All’estremità ci sono i telomeri, di cui non parleremo, ma sono estremamente importanti, perché dalla vitalità della presenza dei telomeri dipende poi l’attività cellulare, infatti in alcuni casi di cancro è mutato proprio un enzima in particolare che è la telomerasi, quindi la porzione terminale è estremamente importante ed è quella che, divisione dopo divisione, si accorcia.

Allora è chiaro che il cromosoma, se ad ogni divisione si accorcia, si arriva ad un certo punto che perde tutto il materiale genetico, ed è chiaro che in quel punto la cellula viene compromessa e se la cellula è compromessa ovviamente va in apoptosi, cioè morte cellulare programmata, o comunque la cellula viene distrutta mediante necrosi, che è un altro processo di morte cellulare, ed i telomeri sono assolutamente importanti e funzionali per la stabilità genomica.

Classificazione dei cromosomi

In funzione del centromero, questi cromosomi possiamo dividerli in grosse categorie e calcolare anche un indice, che si chiama IC, questo indice ci indica il centromero in che posizione si trova:

• Se il centromero è presente proprio al centro del cromosoma, noi abbiamo i cromosomi metacentrici e questi hanno un indice IC del 50%, perché il centromero è esattamente a metà dei due bracci, quindi vuol dire che il braccio p e il braccio q hanno la stessa lunghezza.
• Se invece l’IC è del 30-40% vuol dire che il centromero è submetacentrico, è spostato da uno dei due lati, quindi ci sarà un braccio più piccolo e un braccio più lungo.
• Acrocentrico invece con un IC del 20-30%, vuol dire che il centromero è localizzato verso la zona veramente terminale;
• Telocentrico invece è proprio terminale, con un IC<20%.

Questo perché è importante da ricordare? È importante perché quando parleremo della divisione cellulare dovremmo pensare ai due cromatidi fratelli che, quando entrano in mitosi, hanno un livello di condensazione massimo, il cromosoma è condensato e quindi i cromatidi fratelli sono appiccicati. Abbiamo detto che la separazione avviene per rottura delle coesine, e poi vedremo con quale meccanismo molecolare, ma saranno le fibre del fuso, cioè le fibre di tubulina, che legandosi ai centromeri, separano questi due cromatidi, li separano a livello del centromero, quindi queste fibre del fuso agganceranno giusto al centro i cromosomi metacentrici, un po’ più su quelli acrocentrici, e così via. Quindi la posizione del centromero determina il punto di attacco delle fibre del fuso.

Il genoma umano

Il nostro genoma è costituito da 23 coppie di cromosomi, metà sono di derivazione materna e metà di derivazione paterna, e quello che vediamo nella slide successiva è un classico cariotipo. I cromosomi vengono numerati sulla base della grandezza, quindi il cromosoma 1 è il più grande di tutti, il cromosoma 22 è il più piccolo di tutti, e queste sono le coppie di cromosomi omologhi. Queste sono foto che possono essere rilevate solo quando ci troviamo in metafase. X e Y sono i due cromosomi sessuali. Quindi questo è il cariotipo umano, sono tutte coppie omologhe.

Genoma di diverse specie

Ora vediamo nelle varie specie quanti cromosomi ci sono e questo dà l’idea di quanto complessa è l’informazione genetica. Per esempio nei moscerini ci sono tre coppie di cromosomi, abbiamo un genoma molto semplice, poco complesso. La mosca ne ha 6; il riso invece è una monocotiledone ed ha 12 coppie di cromosomi ed è un genoma abbastanza semplice, tant’è che questo è un genoma noto, negli ultimi anni è stato sequenziato completamente, quindi si conosce la sua sequenza nucleotidica.

Se prendiamo una specie affine al riso, il frumento, un altro cereale, ha 21 coppie di cromosomi e tra l’altro il frumento può esistere in forma tetraploide ed esaploide, il che moltiplica per tre la complessità di un genoma, tra l’altro ad oggi il genoma del frumento non è noto, perché essendo grande in questa maniera, con un grande numero di cromosomi, vuol dire che ci sono milioni e milioni di sequenze di DNA e quindi il genoma non è ancora noto. Il cane ha 39 coppie di cromosomi; la carpa ha 52 coppie di cromosomi, quindi una ridondanza di informazioni genetiche incredibile; il lievito ha 16 coppie di cromosomi, e il genoma del lievito è un genoma noto.

Divisione cellulare

La divisione cellulare in cosa consiste? Durante la mitosi si ha la divisione del nucleo, e si divide il materiale genetico che precedentemente, nella fase S, si era duplicato; e poi abbiamo la citocinesi, che è la divisione propria del citoplasma. In alcuni testi, con la mitosi si intende, sia la classica mitosi che la citocinesi che si chiama anche citodieresi, ma in realtà emerge da alcuni anni che ci sono elementi molto differenti tra la mitosi e la citocinesi, quindi sarebbe molto meglio suddividere queste due parti ed indicare il ciclo cellulare come la progressione di G₁, S, G₂ come interfase, la fase vera e propria divisione del nucleo come mitosi e di divisione del citoplasma come citocinesi o citodieresi.

Evoluzione della mitosi

Nella meiosi sappiamo bene che ci sono due divisioni cellulari ed un’unica replicazione del DNA, in maniera da ottenere quattro cellule aploidi. Come si è evoluta la mitosi? La mitosi in realtà si è evoluta partendo dal nostro progenitore ancestrale, che erano i batteri, batteri che non hanno nucleo e quindi hanno una divisione estremamente più semplice. Nella divisione dei batteri c’è l’adesione del nucleoide nella porzione interna della membrana plasmatica, l’origine di replicazione si duplica, le due origini di replicazione si staccano le une dalle altre e comincia la sintesi del DNA, che viene sintetizzato con una contemporanea apertura delle due eliche e sintesi del frammento leader, costituendo una struttura che è a forma di theta (θ).

Poi dai batteri si è passato ai protisti, che in realtà è una suddivisione un po’ superata, perché i protisti sono stati classificati originariamente in moltissime specie molto semplici eucariotiche che non trovavano collocazione specificamente nei batteri, negli animali e nelle piante; oggi con delle tecniche moderne di fitogenesi molecolare si è riusciti a fare un’attribuzione un pochino più semplice, comunque i protisti sono degli organismi eucariotici, spesso unicellulari molto molto semplici, e lì si sono cominciate a vedere le prime mitosi.

In questa slide vediamo un cromosoma batterico, per esempio pensiamo ad Escherichia coli, che è un batterio bastoncellare che si riproduce per scissione binaria, cioè si allunga poi si divide esattamente a metà generando due cellule figlie. Qui non si può parlare di vera e propria mitosi perché non c’è nessun apparato che regola questa divisione cellulare.

Ma nei dinoflagellati, che sono dei semplicissimi protisti, questi essendo eucariotici hanno il nucleo all’interno, e quello che si osserva nei dinoflagellati è che esiste la struttura di microtubuli, che sono formati da α β-tubulina polimerizzate, e c’è questa membrana nucleare che durante la mitosi non si rompe ed i cromosomi sono attraversati da questi fasci di microtubuli che “bucano” e vanno dall’altra parte, nella porzione interna questi microtubuli contattano i cromosomi, quindi questa si può definire una mitosi chiusa, perché avviene all’interno del nucleo, il quale non si disgrega.

In organismi un pochino più complessi, come le diatomee, che sono sempre però unicellulari, sono protisti eucariotici, noi abbiamo il fascio del fuso mitotico che viene localizzato dentro il nucleo, quindi non abbiamo fasci che partono da una corteccia nucleare all’altra attraversando il nucleo, ma sono localizzate all’interno della membrana nucleare, anche qui questi fasci di microtubuli servono per separare i cromatidi fratelli, anche questa è una mitosi che definiamo “mitosi chiusa”.

Poi invece in gran parte degli eucarioti abbiamo le mitosi aperte, perché il fuso mitotico si forma nella zona centrale della cellula dove sono i cromosomi, ma la membrana nucleare si rompe, quindi a questo punto noi dobbiamo pensare che nella progressione della mitosi, andando dalla profase, metafase, anafase e telofase, ci deve essere un momento in cui, prima si rompe la membrana nucleare, poi i fasci dei microtubuli contattano i cromosomi nella piastra equatoriale, poi si ha la vera e propria separazione dei cromatidi, ma una volta che si è ottenuta la separazione dei cromatidi bisogna ricostituire la membrana nucleare, quindi immaginiamo che uno dei punti di controllo deve essere la rottura e la richiusura della membrana nucleare.

Nelle cellule di mammifero, che studieremo come stiamo sperimentando nelle uova di riccio di mare, negli anfibi, parleremo sempre di mitosi aperta, ma negli antichi si riproducono per gemmazione, come il Saccharomyces cerevisiae, noi avremo una mitosi chiusa, e poi vedremo un po’ la fisiologia del lievito. Quindi in pratica noi abbiamo avuto un’evoluzione della mitosi, da che non era presente nei batteri, andando dai protisti più semplici ai protisti più evoluti, noi abbiamo fatto in modo di specializzare la struttura del fuso mitotico, che è presente solo in mitosi, il fuso mitotico in interfase non ci sta.

Quindi questi microtubuli che noi vediamo nella mitosi che fine fanno? Ci dovremmo dare una risposta, perché verranno disintegrati.