Biochimica applicata - tecniche elettroforetiche

P=V I

dove P indica la potenza dissipata (misurata in watt W), V la tensione ai capi del

circuito e I la corrente elettrica che vi circola. Nel caso di una resistenza, si può

riscrivere la formula utilizzando la Legge di Ohm:

Il fenomeno ha spesso implicazioni negative, poiché è causa di perdita di energia

nelle linee di trasporto dell'elettricità ed in generale di qualsiasi circuito, nonché

abbatte il rendimento delle macchine elettriche. È però alla base del funzionamento di

molti dispositivi elettrici tra cui: la lampada ad incandescenza, l'interruttore

magnetotermico, il fusibile, il forno elettrico, l'asciugacapelli, lo scaldabagno

elettrico.

1.4 Le applicazioni analitiche

In campo biologico sono molte le molecole che possiedono gruppi ionizzabili (come

amminoacidi, proteine, peptidi, nucleotidi e acidi nucleici) e quindi, a ogni valore di

pH, sono presenti in soluzione come specie elettricamente cariche. Ad esempio,

grazie alla presenza dei gruppi fosfato, le molecole di DNA sono cariche

negativamente e quindi migreranno verso il polo positivo (anodo) se sottoposte a un

campo elettrico. Anche composti tipicamente non ionici, come i carboidrati, possono

assumere una carica se trasformati chimicamente, ad esempio come borati o fosfati.

Inoltre molecole con carica simile ma di diverso peso molecolare, e quindi con un

diverso rapporto q/m, presentano una migrazione differenziale se sottoposte ad un

campo elettrico. Proteine Acidi nucleici

1. Determinazione del peso 1. Determinazione del peso 9

molecolare molecolare

2. determinazione di sostituzioni,

2. Determinazione di sostituzioni, inserzioni o delezioni di basi

inserzioni o delezioni di acidi

3. Criteri di purezza 3. Analisi di sequenza

L’elettroforesi viene anche utilizzata per verificare la quantità e la qualità delle

proteine che circolano nel sangue. L’elettroforesi del plasma è una tecnica che

analizza le proteine presenti nel plasma, cioè la parte liquida del sangue. Con questo

esame vengono separate ed esaminate le seguenti proteine: l’albumina , la più

abbondante, le alfa1 globuline, le alfa2 globuline, le beta globuline e le gamma

globuline. Alcune proteine plasmatiche sono prodotte dal fegato, mentre altre

vengono rilasciate nel sangue da cellule che fanno parte del sistema immunitario, il

sistema di difesa naturale dell’organismo. Le proteine plasmatiche sono indicatori

molto importanti, perché alterazioni delle loro concentrazioni possono mettere in luce

un gran numero di malattie. L’elettroforesi proteica ed immunofissazione danno una

stima della quantità di ogni singolo tipo di proteine presenti. Il valore

dell’elettroforesi proteica sta nelle proporzioni tra le singole proteine e nella

distribuzione delle varie sottoclassi.

Il valore dell’immunofissazione risiede nell’identificazione della presenza di un

particolare tipo di immunoglobulina (anticorpo).

Per esempio, determinate condizioni o malattie si possono associare alla diminuzione

o aumento di alcune sieroproteine come descritto di seguito:

Diminuzione dell’albumina: nella malnutrizione e nel malassorbimento, in

 gravidanza, nelle malattie del rene (specialmente nella sindrome nefrosica),

malattie del fegato, infiammazione, sindrome da perdita proteica.

Aumento: nella disidratazione.

Diminuzione di alfa1 globulina: nell’enfisema congenito (una rara malattia

 genetica), nelle patologie severe del fegato.

Aumento: nelle malattie infiammatorie acute e croniche.

Diminuzione di alfa2 globulina: nell’ipertiroidismo o nelle patologie severe del

 fegato, nell’emolisi.

Aumento: nelle malattie renali (sindrome nefrosica), malattie infiammatorie

acute o croniche.

Diminuzione di beta globuline: nella malnutrizione e nella cirrosi

 Aumento: nell’ipercolesterolemia, nell’anemia sideropenica, alcuni casi di

mieloma multiplo e MGUS.

Diminuzione delle gamma globuline: in svariati disordini immunitari e nelle

 immunodeficienze secondarie.

Aumento Policlonale: nella malattia infiammatoria cronica, artrite reumatoide,

lupus sistemico eritematoso, cirrosi, malattie croniche del fegato, infezioni

acute e croniche, immunizzazioni recenti. 10

Monoclonale: nella macroglobulinemia di Waldenstrom, mieloma multiplo,

gammopatie monoclonali di significato ignoto (MGUS).

Quadro proteico normale

L’esame viene usato per facilitare la diagnosi di una malattia maligna chiamata

mieloma multiplo, soprattutto quando siano presenti alcuni sintomi come dolore alle

ossa, stanchezza, infezioni ricorrenti, anemia e fratture ossee senza cause apparenti.

Anche la diagnosi di altri disturbi può essere facilitata da questo esame: per esempio,

malattie infiammatorie e autoimmunitarie, infezioni croniche e acute, malattie dei

reni e del fegato, disturbi del sistema immunitario (gammopatie) e condizioni di

malnutrizione. Può inoltre essere prescritta una elettroforesi proteica delle urine per

diagnosticare la causa e stimare la severità del danno o della patologia renale.

Quando viene diagnosticata una patologia, l’elettroforesi può essere prescritta ad

intervalli regolari per monitorare il corso della patologia e l’efficacia del trattamento.

Mano a mano che la patologia progredisce, la quantità di proteine aumenta; con il

trattamento tale livello diminuisce. Da notare però che un intervallo di riferimento

univoco non è disponibile per questa analisi. Infatti i valori di riferimento possono

differire nei vari laboratori poichè dipendono da molti fattori, tra i quali l'età del

paziente, il sesso, la popolazione di riferimento, i metodi analitici. Il referto dei

laboratori dovrebbe prevedere quindi, degli intervalli di riferimento specifici per ogni

analisi. LA STRUMENTAZIONE 11

Nel corso degli anni sono state sviluppate varie apparecchiature per separare

molecole cariche basate su principi elettroforetici. Fondamentalmente qualsiasi

apparecchiatura per elettroforesi è composta da tre componenti principali: un

alimentatore, che fornisce un flusso di corrente continua (circa 500 V) agli elettrodi

applicati alla cella elettroforetica, un termostato, che permette il controllo e la

regolazione della temperatura, e una camera di separazione o cella elettroforetica, che

è la parte principale dello strumento e può essere realizzata in molti modi differenti.

La cella elettroforetica è costituita da 2 vaschette in comunicazione tra loro in cui

troviamo:

- l'elettrodo positivo e quello negativo, costituiti da fili di platino collegati ai poli

dell’alimentatore;

- la lastrina di gel con i pozzetti di alloggio per il caricamento dei campioni da

separare. I gel maggiormente utilizzati nei laboratori di biologia molecolare sono

costituiti da poliacrilamide (PAGE) e agarosio.

Il principio di funzionamento è il seguente: tutto è immerso in una soluzione tampone

che serve per consentire la conduzione della corrente e per mantenere costante lo

stato di ionizzazione delle molecole da separare.

La corrente è mantenuta lungo il circuito dall'elettrolisi che ha luogo agli elettrodi,

entrambi i quali pescano in capaci recipienti contenenti il tampone. Durante

l'elettrolisi, al catodo si producono ioni ossidrile e idrogeno, mentre all'anodo si

producano ioni idrogeno e ossigeno.

Il tampone determina e stabilizza il pH del mezzo di supporto e influenza anche la

velocità di migrazione dei componenti del campione. I tamponi dì uso comune sono il

formiato, l'acetato, il citrato, il barbitone, il fosfato, il Tris, l'EDTA (acido

etilendiamminotetraacetico la piridina. Esso inoltre non deve legarsi ai composti da

),

separare, perché ne altererebbe la velocità di migrazione. In casi particolari, tuttavia,

questo fenomeno può essere opportunamente sfruttato. Il tampone agisce come

solvente del campione e quindi una certa diffusione è inevitabile, soprattutto nel caso

di molecole piccole, come aminoacidi e zuccheri. Il grado di diffusione può essere

ridotto evitando un sovraccarico di campione, applicandolo in bande molto strette,

usando un'alta tensione per il tempo più breve possibile e rimuovendo e fissando

rapidamente il supporlo al termine della corsa.

Esistono in commercio un gran numero e modelli di celle elettroforetiche, di varia

forma, grandezza, verticali od orizzontali. I sistemi orizzontali offrono il vantaggio di

poter in ogni istante analizzare la corsa elettroforetica in quanto non contemplano

l'assemblaggio delle lastre di vetro alla vaschetta. E' quindi possibile anche ad

intervalli ravvicinati rimuovere il gel (solitamente di agarosio perché più resistente

alle varie manipolazioni) ed analizzare la migrazione delle bande. Tutte le celle sono,

comunque, costituite da 2 vaschette contenenti la soluzione tampone.

L'elettroforesi può essere condotta in soluzione libera,senza supporto ( nel qual caso

si osserva una resistenza frizionale molto piccola tra ioni e soluzione e quindi

un'elevata velocità di migrazione, questa condizione si verifica nell'elettroforesi a

flusso continuo) oppure con un supporto inerte e omogeneo. Si parla di elettroforesi a

fronte mobile. Quando l'elettroforesi è condotta su un supporto, i componenti del

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campione migrano come bande o "zone" distinte che, al termine della corsa, possono

essere rivelate mediante opportune tecniche analitiche. Questo metodo che prende,

quindi, il nome di elettroforesi zonale.

I mezzi di supporto possono presentare effetti di adsorbimento, di elettro-osmosi e di

filtrazione molecolare che modificano la velocità di migrazione dei componenti. Essi

vengono suddivisi in due categorie:

i mezzi inerti: forniscono un supporto fisico ma la separazione delle molecole

 si basa soltanto sulla densità di carica (ad esempio l’acetato di cellulosa)

i mezzi porosi: introducono un ulteriore effetto di setaccio molecolare. Le

 dimensioni dei pori restringono il movimento delle molecole più grandi

rispetto a quelle più piccole. Quindi tale separazione dipende sia dalla densità

di carica che dalle dimensioni della molecola (ad esempio gel di agarosio e

policrilamide).

Nelle separazioni di sostanze ad alto peso molecolare, come le proteine e gli acidi

nucleici, l'uso dei gel come mezzo di supporto ha ampiamente sostituito i sistemi

elettroforetici a basso voltaggio su carta e su strato sottile, in quanto questo mezzo

offre un maggior potere risolutivo. I gel si preparano subito prima dell'uso partendo

da solidi in polvere quali amido, agar, acrilamide.

2.1 Elettroforesi su carta

È una tecnica elettroforetica il cui funzionamento è molto semplice ma ormai nuove

tecniche più precise l’hanno sostituita. In q