Biochimica applicata - tecniche elettroforetiche

Indice

• Prefazione pag.3
• L'elettroforesi e la sua applicazione pag.4
• Le proprietà elettriche e magnetiche delle molecole pag.4
• La mobilità elettroforetica pag.7
• La corrente elettrica pag.8
• Le applicazioni analitiche pag.9
• Strumentazione pag.12
• Elettroforesi su carta pag.13
• Elettroforesi su acetato di cellulosa pag.14
• Elettroforesi su gel di agarosio pag.14
• Elettroforesi su gel di poliacrilamide pag.18
• Tecniche post-elettroforetiche pag.22
• Metodologie avanzate di elettroforesi pag.25
• L'isoelettrofocalizzazione pag.25
• L'elettroforesi bidimensionale pag.27
• L'elettroforesi capillare pag.28
• Glossario pag.33
• Bibliografia pag.38
• Webgrafia pag.38

Prefazione

La biochimica clinica è una disciplina biologica applicata al campo medico che si occupa dello studio delle alterazioni biochimiche di natura patologica e dell'applicazione di tecniche analitiche chimico-strumentali ed immunochimiche per effettuare determinazioni diagnostiche o di routine sui liquidi biologici. La chimica analitica è la branca della chimica che svolge attività volte all'identificazione, alla caratterizzazione chimico-fisica e alla determinazione qualitativa e quantitativa dei componenti di un determinato campione. Essa in particolare si basa sullo studio di reazioni chimiche tra reagenti per dare prodotti e sulla determinazione di parametri chimico-fisici riconducibili all’analita. Rientrano in questo campo ad esempio tecniche come la spettrofotometria, la spettrometria di massa, la cromatografia e appunto l’elettroforesi.

L'elettroforesi e la sua applicazione

L'elettroforesi (dal greco phóresis = trasportato) è una tecnica analitica e separativa basata sul movimento di particelle elettricamente cariche immerse in un fluido per effetto di un campo elettrico applicato mediante una coppia di elettrodi al fluido stesso. Le particelle si spostano verso il catodo se hanno carica positiva e verso l'anodo se hanno carica negativa; nel primo caso il processo è detto cataforesi, nel secondo anaforesi.

Le proprietà elettriche e magnetiche delle molecole

Usualmente un gran numero di atomi nel loro insieme costituiscono la materia, essi non restano isolatamente individuali, ma si riuniscono in gruppi abbastanza stabili da poter essere considerati essi stessi dei costituenti unici. Tali gruppi formano le molecole. La molecola infatti possiamo considerarla come un singolo ente in virtù del fatto che la sua decomposizione richiede una certa energia, ed essa conserva tale individualità finché le energie in gioco nei processi che si considerano, non superano un certo valore critico. Facendo uso di energie relativamente modeste è possibile frammentare un corpo macroscopico in parti ancora macroscopiche, ed energie più elevate sono richieste per scindere un corpo in molecole. La scissione di una molecola negli atomi che la costituiscono richiede energie ancora più grandi, ed ancora maggiore dovrà essere l’energia occorrente per separare un atomo in nucleo ed elettroni. Per ciascuna specie atomica sono stati determinati diversi valori delle energie corrispondenti alle diverse forze, di interazione, agenti tra due atomi o gruppi di atomi. Tali forze sono responsabili della formazione dei legami atomici. Tali legami danno luogo alla formazione di “aggregati” che possono essere suddivisi in due grandi categorie: legami eteropolari e legami omopolari o covalente puro. I primi si manifestano fra atomi diversi, i secondi invece fra atomi uguali. Nel primo caso la coppia elettronica risulta spostata verso quello che ha la maggiore affinità elettronica e maggior potenziale di ionizzazione. La molecola si comporta come un dipolo elettrico in quanto il baricentro delle cariche negative non coincide con quello delle cariche positive; la molecola è polare e presenta un’estremità con parziale carica negativa e un’estremità con parziale carica positiva. In entrambi i casi il sistema si porta ad uno stato di energia totale più basso (molecola) rispetto a quello iniziale (atomi isolati).

Nel legame covalente polare la coppia elettronica, pur presentando un maggior spostamento verso l’atomo più elettronegativo, rimane comunque condivisa tra i due nuclei. Quando però, la differenza di elettronegatività tra i due elementi legati è molto grande, la coppia di elettroni di legame finisce col trasferirsi definitivamente sull’atomo più elettronegativo, rimanendo sotto la sola influenza del suo nucleo. In questo caso, in pratica, non si può più parlare di legame chimico vero e proprio, in quanto tra i due atomi non esiste alcuna coppia di elettroni condivisa, ma esiste soltanto un’attrazione elettrostatica tra i due ioni che si sono formati. Per tale motivo questo tipo di legame viene chiamato legame ionico. Il grado di polarità del legame è correlato quindi ad una proprietà degli atomi detta elettronegatività, che può essere definita concettualmente come la tendenza di un atomo ad attrarre verso di sé gli elettroni di legame. Secondo Mulliken, l’elettronegatività si può esprimere come la semisomma (media) del potenziale di ionizzazione e dell’affinità elettronica. Purtroppo la formula di Mulliken consente di calcolare l’elettronegatività solo per quegli elementi cui è nota l’affinità elettronica che sono piuttosto pochi a causa della difficoltà della misura sperimentale di questa grandezza. Linus Pauling propose per il calcolo dell’elettronegatività un metodo di più ampia applicabilità, basato sul confronto delle energie di legame in molecole biatomiche.

Tavola periodica dell'elettronegatività con utilizzo della scala di Pauling (giallo = elemento poco elettronegativo, rosso = elemento molto elettronegativo)

L’elettronegatività è una proprietà periodica degli elementi, proporzionale all’affinità elettronica e al potenziale di ionizzazione, che tende a diminuire all’interno di un gruppo procedendo dall’alto verso il basso e lungo un periodo procedendo da destra a sinistra. I motivi di questo andamento sono i seguenti:

• L’aumento che si verifica andando verso destra deriva dalle sempre più ridotte dimensioni degli atomi, per cui c’è un minore effetto di schermo e quindi una maggiore attrazione degli elettroni;
• La diminuzione che si ha invece scendendo lungo un gruppo, deriva sia dall’aumento delle dimensioni atomiche sia anche dall’aumento dell’effetto di schermo, visto che aumentano gli elettroni.

C'è una zona che non rispetta la periodicità dell'elettronegatività ed è chiamato Periodo Massimo Locale di Elettronegatività (questo periodo è importante per spiegare come l'oro (Au) non si ossidi). Gli atomi che sono in questo intervallo sono racchiusi nel rettangolo della tabella periodica che ha come vertici il ferro (Fe), il rame (Cu), l’osmio (Os) e l’oro (Au). Pauling non inserì nella sua scala i gas nobili, poiché quando la stese la sua teoria non si conoscevano ancora reazioni di quest'ultimi. L'elettronegatività però non è un valore fisso assegnato ad un elemento: essa può variare per molti motivi. Il primo di questi è il contesto in cui l'atomo è inserito: se quest'ultimo è legato ad un elemento più elettronegativo, esso dimostrerà un carattere elettronegativo maggiore di quello riscontrabile in tabella. Le molecole quindi possono essere esaminate oltre che dal punto di vista dell’energia di legame anche per le loro proprietà elettriche e magnetiche (il momento dipolare, la polarizzabilità, la suscettività magnetica), proprietà che come vedremo caratterizzano il comportamento della materia in presenza di campi elettrici e magnetici.

La mobilità elettroforetica

In base al loro rapporto carica/massa e alla loro forma, le molecole cariche migrano a velocità differenti e i componenti di una miscela si separano quando si applica il campo elettrico per effetto elettrosmotico. La mobilità elettroforetica di una molecola dipende da diversi fattori:

• La carica netta delle molecole: ossia gli anioni (-) migrano verso l’anodo (+), e i cationi (+) verso il catodo (-). Le molecole più cariche sono anche quelle che si muovono più velocemente verso l’elettrodo di carica opposta rispetto a quelle con carica minore.
• La forma: l’effetto dell’attrito fa anche sì che la forma della molecola influenzerà la mobilità, ad esempio proteine globulari migrano meglio di quelle fibrose.
• La dimensione: molecole più piccole migrano più velocemente di quelle più grandi.
• La forza del campo elettrico: la mobilità aumenta in proporzione al voltaggio del campo elettrico.

Tali combinazioni possono essere espresse con la formula: u = qE/r

Dove u rappresenta la mobilità elettroforetica, q rappresenta la carica netta della molecola in coulomb, E l’intensità del campo elettrico o gradiente di potenziale in volt/cm, ed r il raggio molecolare.

Se la distanza tra gli elettrodi è di d metri ed essi presentano una differenza di potenziale di V volt, avremo un gradiente di potenziale V/d volt, un campo elettrico in cui la forza elettrica è data da q . E mentre la forza frizionale da f . v dove f indica il coefficiente frizionale e v la velocità. Verrà raggiunto l’equilibrio quando le due forze avranno uguale intensità e le varie particelle si muoveranno ad una velocità v costante F = q x E = f x v v/E = q/f = u qV = (v . E) / f . d . f. Un aumento del gradiente di potenziale provocherà, quindi, un aumento proporzionale della velocità di migrazione.

La corrente elettrica

La corrente elettrica è un qualsiasi flusso ordinato di carica elettrica, tipicamente attraverso un filo metallico o qualche altro materiale conduttore per un tempo prolungato. La corrente convenzionale venne definita inizialmente, nella storia dell'elettricità, come il flusso di carica positiva, anche se sappiamo, nel caso della conduzione metallica, che la corrente è causata dal flusso di elettroni con carica negativa nella direzione opposta. Nonostante ciò, l'originale definizione di corrente convenzionale resta valida. Il simbolo normalmente usato per la quantità di corrente (la quantità di carica che scorre nell'unità di tempo) è I, e l'unità di misura nel SI per l'intensità di corrente elettrica è l'ampere. Nei conduttori metallici, come i cavi elettrici, la corrente è causata da un flusso di elettroni (particelle a carica negativa), ma non è così nella maggior parte dei conduttori non metallici. La corrente elettrica negli elettroliti è data dal flusso di atomi e/o molecole elettricamente cariche (ioni), che possono essere sia negativi che positivi. Sappiamo che un conduttore si trova in equilibrio elettrico se il campo elettrico è nullo in ogni punto interno al conduttore, ossia il potenziale elettrico sia costante in ogni punto del conduttore. Chiaramente se vi è una differenza di potenziale fra due punti del conduttore allora vi è anche campo elettrico diverso da zero e quindi corrente elettrica. Questa differenza di potenziale viene chiamata forza elettromotrice ed è alla base del funzionamento dei circuiti elettrici ed elettromagnetici insieme alla Legge di Ohm e alle Leggi di Kirchhoff. La legge di Kirchhoff delle correnti afferma che, definita una superficie chiusa che attraversi un circuito elettrico in regime stazionario, la somma algebrica delle correnti che attraversano la superficie (con segno diverso se entranti o uscenti) è nulla.

La legge di Ohm esprime unicamente la relazione di linearità fra la corrente elettrica I e la differenza di potenziale V applicata. L'equazione indicata è semplicemente una forma dell'espressione che definisce il concetto di resistenza ed è valida per tutti i dispositivi conduttori: V = RI

Dove I indica la corrente elettrica (misurata in ampere A), V il voltaggio (misurato in volt V) e R la resistenza (misurata in ohm Ω). La resistenza che dipende dal mezzo di supporto, dal tipo di tampone e dalla sua concentrazione, aumenta con l’aumentare della distanza tra gli elettrodi, ma diminuisce con l’aumento sia dell’area della sezione trasversale del supporto, sia della forza ionica del tampone.

Uno degli effetti del passaggio di corrente in un conduttore è il suo riscaldamento. L’effetto Joule è proprio quel fenomeno per cui un conduttore attraversato da una corrente elettrica dissipa energia sotto forma di calore in quantità direttamente proporzionale all’intensità di corrente elettrica che lo attraversa: P = VI

Dove P indica la potenza dissipata (misurata in watt W), V la tensione ai capi del circuito e I la corrente elettrica che vi circola. Nel caso di una resistenza, si può riscrivere la formula utilizzando la Legge di Ohm. Il fenomeno ha spesso implicazioni negative, poiché è causa di perdita di energia nelle linee di trasporto dell'elettricità ed in generale di qualsiasi circuito, nonché abbatte il rendimento delle macchine elettriche. È però alla base del funzionamento di molti dispositivi elettrici tra cui: la lampada ad incandescenza, l'interruttore magnetotermico, il fusibile, il forno elettrico, l'asciugacapelli, lo scaldabagno elettrico.

Le applicazioni analitiche

In campo biologico sono molte le molecole che possiedono gruppi ionizzabili (come amminoacidi, proteine, peptidi, nucleotidi e acidi nucleici) e quindi, a ogni valore di pH, sono presenti in soluzione come specie elettricamente cariche. Ad esempio, grazie alla presenza dei gruppi fosfato, le molecole di DNA sono cariche negativamente e quindi migreranno verso il polo positivo (anodo) se sottoposte a un campo elettrico. Anche composti tipicamente non ionici, come i carboidrati, possono assumere una carica se trasformati chimicamente, ad esempio come borati o fosfati. Inoltre molecole con carica simile ma di diverso peso molecolare, e quindi con un diverso rapporto q/m, presentano una migrazione differenziale se sottoposte ad un campo elettrico.

Proteine:

• Determinazione del peso molecolare
• Determinazione di sostituzioni, inserzioni o delezioni di amminoacidi
• Criteri di purezza

Acidi nucleici:

• Determinazione del peso molecolare
• Determinazione di sostituzioni, inserzioni o delezioni di basi
• Analisi di sequenza

L’elettroforesi viene anche utilizzata per verificare la quantità e la qualità delle proteine che circolano nel sangue. L’elettroforesi del plasma è una tecnica che analizza le proteine presenti nel plasma, cioè la parte liquida del sangue. Con questo esame vengono separate ed esaminate le seguenti proteine: l’albumina, la più abbondante, le alfa1 globuline, le alfa2 globuline, le beta globuline e le gammaglobuline. Alcune proteine plasmatiche sono prodotte dal fegato, mentre altre vengono rilasciate nel sangue da cellule che fanno parte del sistema immunitario, il sistema di difesa naturale dell’organismo. Le proteine plasmatiche sono indicatori molto importanti, perché alterazioni delle loro concentrazioni possono mettere in luce un gran numero di malattie. L’elettroforesi proteica ed immunofissazione danno una stima della quantità di ogni singolo tipo di proteine presenti. Il valore dell’elettroforesi proteica sta nelle proporzioni tra le singole proteine e nella distribuzione delle varie sottoclassi. Il valore dell’immunofissazione risiede nell’identificazione della presenza di un particolare tipo di immunoglobulina (anticorpo).

Per esempio, determinate condizioni o malattie si possono associare alla diminuzione o aumento di alcune sieroproteine come descritto di seguito:

• Diminuzione dell’albumina: nella malnutrizione e nel malassorbimento, in gravidanza, nelle malattie del rene (specialmente nella sindrome nefrosica), malattie del fegato, infiammazione, sindrome da perdita proteica.
• Aumento: nella disidratazione.
• Diminuzione di alfa1 globulina: nell’enfisema congenito (una rara malattia genetica), nelle patologie severe del fegato.
• Aumento: nelle malattie infiammatorie acute e croniche.
• Diminuzione di alfa2 globulina: nell’ipertiroidismo o nelle patologie severe del fegato, nell’emolisi.
• Aumento: nelle malattie renali (sindrome nefrosica), malattie infiammatorie.