Lezioni, Biochimica Applicata

INTERAZIONI PROTEINA-PROTEINA

Una proteina viene espressa tramite un vettore, fusa al GST tag e sottoposta a cromatografia di affinità e

SDS-page. Si colora con silver stain, che evidenzia le bande della proteina di interesse e di quelle legate, si

tagliano le bande e si analizza in spettrometria di massa. Se conosco già le proteine che interagiscono, si fa

un WB e si evidenziano tramite anticorpi. Il primo controllo da fare è che la proteina che siamo analizzando

sia presente sia paragonabile sia nel controllo che nel trattato. Bisogna fare un controllo in negativo: cellule

in cui è espresso GST+X e cellule solo con GST. Se una proteina interagisce con X, trattando solo con GST

non succede nulla. Si può produrre una proteina radioattiva introducendo il plasmide in un lisato di

reticolociti: sarà radioattiva perché marcata con S .

35

Per verificare che una proteina interagisca fisiologicamente con un’altra, si fa un’immunoprecipitazione. Al

lisato cellulare, sia controllo che trattato, vengono aggiunti 5 µL di anticorpo e le biglie magnetiche, lasciate

in agitazione per un’ora. Si pongono le provette sul REK, che ha una superficie magnetica che attrae le

biglie; a queste sarà legato l’anticorpo legato ad X, che è a sua volta legato al complesso proteico con cui sta

interagendo. Si fanno lavaggi a forza ionica crescente per rimuovere le interazioni aspecifiche. Per staccare

anticorpo+X+proteine si eluisce con NaCl 250 mM; si recuperano e si caricano su SDS-page, e si applica

WB o spettrometria di massa.

DETERMINAZIONE DELLA STRUTTURA DELLE PROTEINE

Per determinare la composizione in AA, si idrolizza la proteina con idrolisi acida e basica. Dopo si carica in

HPLC reverse phase e sulla base di una retta di taratura si determina quali AA sono presenti e quanto.

Conoscere il tipo di AA ci permette di sapere se la proteina è di membrana o citosolica. I peptidi in cui viene

frammentata la proteina sono composti da 50-60 AA. La tripsina taglia dal lato C-terminale di Lys e Arg; la

chimotripsina taglia dal lato C-terminale di Phe, Thy, Trp e Leu.

REAL TIME PCR

Metodica per amplificare frammenti di DNA in modo specifico, tramite reagenti appositi. I primers sono

oligonucletoidi che specificano la regione da amplificare. Se si parte da RNA, si retrotrascrive il cDNA. Per

appaiare i primer, la doppia elica deve essere denaturata; dopo può essere abbassata la temperatura per

consentire l’anealling dei primer; effettuato l’appaiamento si procede con l’amplificazione portando la T a

72°C, che è ottimale perché la Taq funzioni; più è lungo l’amplicone, più tempo ci vuole. Questo ciclo viene

ripetuto per 30-40 volte. Le piastre vengono messe in uno strumento chiamato termociclatore, che alza e

abbassa la T a seconda dello step del ciclo. Il cambio di T deve avvenire in pochissimi secondi. Più il primer

è lungo, più è specifico; non può essere troppo lungo perché bisogna tenere conto di quanti legami formano

le basi e della temperatura specifica di appaiamento alle sequenze complementari; se la T non fosse

specifica, il primer si appaierebbe in modo non specifico. Con la lunghezza del primer aumenta la T ottimale

per l’annealing. Nel 3° step, la Taq polimerasi estende i primers. Ogni 10 cicli, abbiamo un fattore di

amplificazione di 10 .

3

Y= quantità di frammento amplificato.

X= quantità di DNA iniziale

n= numero di cicli

E= efficienza dell’amplificazione

Y= X (1+E) n-1

Se l’efficienza è del 100%: Y= X (2 n-1) (se tutte le fasi sono ottimizzate.).

Nel 1°ciclo, non si crea il frammento definito ma si generano i frammenti lunghi. Al 2° ciclo compaiono i

frammenti di lunghezza definita. I frammenti lunghi si amplificano in modo aritmetico. Ad un certo punto,

l’amplificazione raggiunge un plateau. Le polimerasi hanno un dominio di attività polimerasica e

3’

retrotrascrittiva, una 5’ esonucleasico e uno 3’ 5’ esonucleasico. Ad un certo punto si accumula così

tanto DNA tale per cui mi avvicino alla Km della 5’ 3’ esonucleasica e dunque contemporaneamente il

DNA viene polimerizzato e degradato. MgCl2 serve perché l’enzima è magnesio-dipendente, si lega ai

nucleotidi liberi e stabilizza i legami idrogeno, anche quelli non specifici che potrebbero formarsi tra il

primer e sequenze non specifiche. Se sono presenti troppi nucleotidi potrebbero generarsi mutazioni

puntiformi. Gli ultimi 5 nucleotidi dei primer non devono contenere più di 2 GC.

Per amplificare con RNA, bisogna retrotrascriverlo a cDNA. L’RNA viene incubato con la trascrittasi

inversa e oligo dT o primers specifici. Con la PCR posso quantificare quanto RNA specifico per una proteina

ho nel campione biologico iniziale. Possono esserci degli errori che si amplificano nei vari cicli e portano a

conclusioni sbagliate, oppure si possono avere campioni con quantità diverse di acido nucleico che

raggiungono lo stesso plateau. Per avere una quantificazione reale, bisogna lavorare sulle fasi iniziali della

curva esponenziale. Il parametro da considerare è il ciclo soglia: il 1° ciclo al quale ho un segnale

statisticamente diverso dal rumore di fondo della mia metodica. Il ciclo soglia si correla con la quantità di

acido nucleico che avevo nel campione. Se ho tanto acido nucleico, mi servono meno cicli di amplificazione

per giungere al ciclo soglia. Con una curva di calibrazione correliamo il ciclo soglia (y) e il log della C di

acido nucleico (x). Per seguire la reazione in tempo reale, posso aggiungere agenti intercalanti che emettono

fluorescenza e collego tutto ad uno spettrofluorimetro che ad ogni ciclo emette il segnale. Se ci sono due

ampliconi, per distinguerli si utilizza il sistema Taq man: una sonda a doppia elica modificata al 5’ (reporter

in grado di emettere fluorescenza) e al 3’ (quencher). Quando sono sulla stessa molecola la fluorescenza

viene smorzata; degradando l’oligonucleotide, la fluorescenza non è più catturata dal Q ma è registrata dallo

spettrofluorimetro. Ciclo dopo ciclo aumenta la quantità di TaqMan degradata. Per distinguere tra due

ampliconi si utilizzano sostanze che emettono a lunghezze d’onda diverse.

SPETTROMETRIA DI MASSA

Dal momento che si parla di ioni, è necessario che siano convertiti da un sistema che trasformi i segnali in

modo da permetterci di leggerli. I diversi picchi rappresentano perdite comuni di un gruppo. La scelta di uno

spettrometro di massa dipende dalle esigenze di ricerca che si hanno. Il primo problema da affrontare è

l’introduzione del campione, perché i sistemi di introduzione sono molto diversi: direttamente, da una

cromatografia, per interfaccia con elettroforesi capillare. La seconda problematica riguarda la produzioni di

ioni in fase gassosa, dunque dobbiamo tenere conto delle dimensioni delle molecole da analizzare. Una volta

che vengono prodotti gli ioni, lo step successivo sarà la loro separazione.

Come fare a discriminare tra uno ione e l’altro?

L’unica possibilità è quella di generare campi elettrici o magnetici; il TOF non separa sulla base dela carica

ma sulla base della dimensione con elevata risoluzione. Il peso molecolare ottenuto si avvicina moltissimo a

quello reale. Tutto questo sistema è sottovuoto perché andiamo a valutare molecole in miscela in quantità

estremamente ridotte, quindi se c’è dell’aria questa può causare contaminazioni o collisione tra gli ioni. Non

è detto che spettrometri di massa disegnati per grandi molecole non siano utilizzabili anche per le piccole

molecole, ma non è vero il contrario. Nell’impatto elettrico, la ionizzazione avviene per urto con elettroni ad

alta energia: la molecola si ionizza e si frammenta. L’informazione che manca spesso da un impatto

elettronico è il peso molecolare. Nella ionizzazione chimica, un gas ionizzato ad alta energia, ionizza la

molecola per trasferimento di un protone; con questo tipo di sorgente si avranno le informazioni sul peso

molecolare. In genere, prima si individua il peso molecolare, poi si cambia sorgente per valutare la

frammentazione. In alcuni casi, la CI è utilizzata per l’analisi quantitativa. Il problema non è la ionizzazione

della molecola ma l’analizzatore, perché quelli magnetici o elettrici generano i rispettivi campi in modo

limitato. Dalla sorgente, entrerà nell’analizzatore il claster di ioni che è stato generato; il campo magnetico

può variare e quindi lo ione che entra prenderà delle traiettorie proporzionali al suo rapporto massa/carica e

al campo magnetico in cui è entrato. Il processo di entrata dello ione è così veloce che alla fine riusciamo a

recuperare una buona % di ioni. Il flusso è unidirezionale. Il campo magnetico varia e il magnete è

posizionato in modo da far entrare in sequenza gli ioni che hanno un certo rapporto m/c. il quadrupolo genera

un campo elettrico; ci sono due poli a polarità differente; lo ione avrà una traiettoria ondulatoria e prima o

poi centrerà le fenditura. Il quadrupolo è più veloce del magnetico ma meno preciso. Il problema di una

molecola al alto peso molecolare è che non è volatile, quindi la gas cromatografia non è utilizzabile. Si

trasforma l’eluato che arriva dall’HPLC in uno spray che riduca al minimo il volume della fase mobile

facendola evaporare senza usare temperature elevate. Per fare questo sono state disegnate delle sorgenti API

e la ionizzazione avviene a pressione atmosferica. Ci sono due sistemi: APCI e ESI.

L’APCI assomiglia molto alla ionizzazione chimica. Dall’HPLC esce l’eluato che viene forzato ad entrare in

un ago che lo vaporizza; questo spray è forzato a passare in una sorta di corona. C’è una cessione o

accettazione di protoni, ma non una frammentazione. In questa sorgente abbondano aria ed eluenti.

L’informazione che avremo sarà il peso molecolare.

La ESI: viene creata una sorgente che permetta di caricare più protoni su una stessa molecola in modo che il

suo rapporto m/c diminuisca (aumento di Z). Ovviamente si può fare su molecole che sopportano questo

trattamento. Vengono utilizzati analizzatori a basso peso molecolare per analizzare molecole a peso

molecolare più elevato. Questo vale solo per la ESI. Sull’ago della sorgente abbiamo contemporaneamente la

vaporizzazione e ionizzazione della molecola; qui è una protonazione diretta. Man a mano che avviene la

trasformazione in spray, l’eluente inizia ad evaporare, quindi gli ioni si trovano sempre più vicini; per

repulsione questo raggruppamento esplode e si formano singoli ioni (DESORBIMENTO). Nello spettro di

massa, si notano delle piccole gaussiane; non tutti gli ioni hanno sem