Lezioni, Biochimica Applicata

Appunti di biochimica applicata – anno 2014/2015

L'approccio investigativo

Il disegno sperimentale è composto da un’ipotesi che viene verificata mediante esperimenti; se viene validata diventa teoria. Il lavoro di progettazione prevede il disegno dell’esperimento e la compilazione di un quaderno di laboratorio, in cui è descritto lo scopo dell’esperimento, la descrizione dei metodi e dei materiali e l’osservazione dei risultati.

Analisi statistica

• Variabilità strumentale e biologica: necessità di ripetere la misurazione nell’ambito dello stesso esperimento. (media ± deviazione standard; coefficiente di variazione.)
• Significatività dei dati (test statistico – T di Student, utilizzato per paragonare due gruppi di ricerca. La correlazione è una misura della relazione tra due o più variabili. Il coefficiente di correlazione può variare da -1.00 a +1.00; -1.00 rappresenta una correlazione negativa perfetta mentre +1.00 rappresenta una correlazione positiva perfetta.

Correlazione lineare

y = ax + b
a = inclinazione
b = intercetta sull’asse delle y
r² = coefficiente di correlazione

• Curva di calibrazione: nell’analisi quantitativa, il segnale registrato è correlato alla concentrazione dell’analita.
• Confronto tra due metodi: la stessa variabile viene misurata con due metodi diversi e i dati riportati in grafico.

Correlazione non lineare

• Velocità enzimatica in funzione della concentrazione del substrato.
• Glucose tolerance test.

Spettrofotometria – Principi e applicazioni

Le radiazioni elettromagnetiche sono prodotte dal moto di particelle cariche; si chiamano così perché si propagano nel campo elettrico e in quello magnetico. Le radiazioni viaggiano nello spazio attraverso area e sostanze. Lo spettro è l’intervallo delle possibili radiazioni elettromagnetiche. All’aumentare della lunghezza d’onda, l’energia diminuisce.

• Spettro UV va da 190 nm a 400 nm. La radiazione con una lunghezza d’onda inferiore è denominata luce UV. Scende fino ad una lunghezza d’onda di 350 nm; al di sotto dei 190 nm, si trova la zona dei raggi X e si estende fino ad una lunghezza d’onda di circa 6 nm. La lunghezza d’onda è sempre rappresentata da un intervallo. Non è possibile categorizzare i raggi. Frequenza = Energia
• Spettro Visibile va da 400 nm a 700 nm. Dopo questo intervallo l’occhio non apprezza il colore. Questo spettro cade dal violetto al rosso. Oltre il rosso, si trova la zona denominata infrarosso, che va da 0,7 µm a 0,4 mm.

La spettrofotometria è lo studio quantitativo di uno spettro elettromagnetico. Le tecniche spettroscopiche si basano sullo scambio di energia tra energia radiante e materia. La spettrofotometria di assorbimento si interessa dei fenomeni di assorbimento delle radiazioni luminose della regione dello spettro elettromagnetico del campo del visibile e del (vicino) ultravioletto.

L’assorbimento di queste radiazioni produce transizioni energetiche degli elettroni non impiegati in un legame. I più facilmente eccitabili sono quelli impiegati in un legame π. Le proteine assorbono a due lunghezze d’onda diverse: 230 nm (legame peptidico) e 280 nm (catene laterali amminoacidi). La concentrazione della proteina ad entrambe le lunghezze d’onda è identica. La spettrofotometria valuta quanta radiazione è stata assorbita dal campione. Se eccitando il campione, l’elettrone eccitato decade, questo può emettere ad una lunghezza d’onda più alta, ma in questo caso si tratta di fluorescenza. La spettrofotometria valuta solo ed esclusivamente quanta luce entra e quanta luce esce ad una determinata lunghezza d’onda.

Lo spettrofotometro valuta l’intensità della luce che entra e quella che esce, facendone il rapporto. Lo spettrofotometro più economico è quello convenzionale; è composto da un monocromatore, un prisma che “splitta” la luce a tutte le lunghezze d’onda possibili, le quali colpiscono il campione, intensità in entrata; il detector carpisce l’intensità in uscita e moltiplica il segnale. Se tutta la luce colpisce la cuvetta, vengono misurate le assorbanze a tutte le lunghezze d’onda e per fare questo si usa lo spettrofotometro “diode array” (già quantitativo ma più costoso).

Le sorgenti luminose dello spettrofotometro sono due: lampada al deuterio per l’UV e una lampada al tungsteno per il visibile. Il diode array monta la lampada allo Xeno per tutto lo spettro UV-Visibile. La trasmittanza è il rapporto tra l’intensità del raggio che esce e quella del raggio che entra. I materiali della cuvetta per l’UV e il visibile cambiano.

T = trasmittanza = I/I₀

Se abbiamo due curve di assorbimento possiamo avere due legami o due sostanze diverse.

Legge di Lambert – Beer

A (assorbanza) = log 1/T
l = b = lunghezza cuvetta o percorso ottico (1 cm)
c = concentrazione analita
K = a = costante di assorbimento (tabulata)

La legge mette in relazione A con la concentrazione del campione. a = coefficiente di estinzione molare: estinzione di una soluzione che contiene 1M in un percorso ottico di ε = 1 cm ed in condizioni standard di solvente e temperatura. Le unità di misura sono L/molxcm

λE% = coefficiente di estinzione %: estinzione di una soluzione contenente 1g di sostanza in 100 mL di soluzione alle condizioni sopra indicate. Le unità di misura sono 100mL/gxcm

La legge si applica solo ed esclusivamente a sostanze pure perché l’assorbanza gode della proprietà additiva, ovvero se ho più sostanza, l’assorbanza aumenta. Bisogna essere sicuri della purezza e dell’assenza di interferenti.

Se abbiamo una miscela a più componenti possiamo identificarli se hanno lunghezze d’onda diverse. Per quantificarle e separarle bisogna misurare la sostanza X alla sua massima, la sostanza Y alla sua λ massima, applicare la legge di Lambert – Beer ed eventualmente combinarle. Ciò è possibile perché, nonostante l’assorbanza goda della proprietà additiva, se la sostanza X ha il suo massimo di assorbimento in corrispondenza del minimo di assorbimento di Y, è possibile impostare l’equazione in modo da determinare Ax e Ay. Questo ci darà un’idea delle concentrazioni dei composti. Per determinare la concentrazione assoluta, bisogna separare i due analiti. Se X e Y assorbono alla stessa lunghezza d’onda non possono essere separati con la legge di LB.

Il termine cromoforo era inizialmente utilizzato per indicare la parte della molecola che conferiva colore al composto. Questo termine, in spettrofotometria, indica un composto che assorbe la radiazione luminosa e che può essere quantificato. Gli elettroni del cromoforo passano dallo stato basale a quello eccitato. Il termine può essere esteso all’UV e alle parti delle molecole che assorbono.

Spostamento batocromico

Lo spostamento batocromico è il cambiamento della lunghezza d’onda che aumenta a causa di determinate condizioni ambientali. Si parla di red shift, ovvero spostamento verso il rosso, quindi minore energia. Si parla di spostamento ipsocromico se c’è spostamento a lunghezze d’onda ad alta energia, ovvero blue shift. Il verificarsi dei due effetti dipende dalla sostanza che si analizza. Abbiamo un effetto ipsocromico, ad esempio, nel caso di diminuzione di doppi legami o la protonazione di un gruppo, che portano ad una diminuzione del valore di λ.

Si parla di effetto iper o ipocromico quando si osserva un aumento o una diminuzione dei valori di estensione (A), ad esempio nel caso della denaturazione al calore del DNA. L’effetto ipocromico è il fenomeno in cui una sola molecola contiene diversi cromofori ed ha una A inferiore alla somma delle A dei singoli cromofori. L’effetto ipercromico comporta un aumento dell’A ad una particolare λ in una soluzione o sostanza dovuta a cambi strutturali in una molecola. Questo vale solo per sostanze complesse come il DNA, e succede perché c’è un contenuto differente delle diverse basi.

La colorimetria

Presupposti

• L’analita assorbe ad una sola λ nel visibile e senza interferenze;
• L’analita si lega/forma un composto con un reattivo che assorbe ad una data λ;
• L’analita è coinvolto in una reazione che genera un cromoforo;
• L’analita viene determinato generando una curva di calibrazione.

Analisi quantitativa: procedimento per il quale la risposta derivante dalla miscela in esame viene confrontata con quella ottenuta da una miscela uguale ma con concentrazione nota. L’analita deve essere dosato senza interferenza (specificità). Deve essere determinata la più piccola quantità di analita che può essere determinata (limite di determinazione) ad un livello stabilito di confidenza statica. Il coefficiente di variazione % deve essere ottenuto confrontando i risultati delle misure della stessa concentrazione di analita utilizzando lo stesso metodo analitico ma su strumenti diversi, da operatori diversi e in tempi diversi. Il confronto fra la risposta della miscela in esame e quella nota è reso possibile da una funzione matematica, ovvero la curva di calibrazione. Per definirla correttamente è necessario definire con sicurezza e precisione la concentrazione degli standard, stabilire l’intervallo di concentrazione e il numero di campioni presi come riferimento. La concentrazione può essere determinata solo nella porzione funzionale della curva. La retta viene costruita con almeno 5-6 punti. Non vanno usate le proporzioni. La determinazione delle proteine in una miscela si effettua mediante colorimetria.

Metodo di Folin – Ciocalteu (Lowry)

C’è un reattivo che reagisce con la proteina e la colora. Il reattivo di Lowry utilizza l’acido fosfotungstenico e fosfomolibdico che legandosi alla proteina sui residui tirosinici, la colora di blu (effetto batocromico). La sensibilità arriva fino a 10 mg/L. Sono possibili microdosaggi in cui si arriva a 0,5 mg/L. La proteina reagisce con il reattivo di Folin a pH basici. Gli interferenti sono: tris, EDTA, PIPES ed HEPES.

Metodo del Biureto

Gli ioni rameici formano un complesso con i gruppi NH. Viene aggiunto potassio tartrato per stabilizzare il complesso, che sarà blu. È un metodo poco sensibile.

Metodo di Blu di Comassie

Questo colorante si complessa ad amminoacidi basici presenti nelle proteine in presenza di acido fosforico. Il complesso assorbe a 595 nm. È semplice da preparare ed ha una buona sensibilità, solo che non tutte le proteine possono essere complessate.

Dosaggio dell’attività enzimatica

Molti substrati, prodotti o cofattori, assorbono nel visibile o nell’UV se hanno massimi di assorbimento diversi ed è valida la LB. La differenza di estensione può essere la base per il dosaggio dell’attività enzimatica. Possiamo seguire la scomparsa del substrato, la formazione del prodotto o la conversione del cofattore. Quando il substrato è in eccesso la velocità dipende dall’enzima. Viceversa, la velocità dipende dal substrato. L’attività dell’enzima si esprime in U/I (unità internazionale). Viene espressa in unità che indicano le µmoli di substrato trasformate in 1 minuto a determinate condizioni. L’UE è il valore dell’attività catalitica di trasformazione di 1 µmol di substrato in 1 minuto. Il fattore di correzione tiene conto della linearità della risposta del sistema e dei volumi di diluizione del campione. Il cofattore più utilizzato è il NAD, che esiste come NAD⁺ e NADH, e ha dunque due picchi di assorbimento diversi.

Elettroforesi: leggi e principi

È una tecnica che sfrutta la migrazione differenziale di particelle cariche sotto l’influenza di un campo elettrico. La migrazione elettroforetica è dovuta alla forza di Lorentz.

F = q*(E + vxB)

La migrazione elettroforetica è contrastata dalle forze di frizione. La velocità di migrazione è costante. Tra due cariche migra quella più carica, più piccola, meno lunga; le celle elettrolitiche sono composte da un elettrolita, che è un solvente, un catodo negativo e un anodo positivo, e funzionano grazie all’elettricità.

Calcolo della mobilità elettroforetica: µ = v/X = dxL/Vxt

Se si aumenta il voltaggio, la proteina migra di più. Più le maglie del gel si infittiscono, più la separazione sarà semplice. Un anfolita è una sostanza che può reagire sia come acido sia come base. Lo zwitterione è una molecola elettricamente neutra ma che può avere cariche nette su differenti atomi. Il punto isoelettrico è il punto in cui una molecola ha carica nulla. Un anfolita in una soluzione più acida del suo PI lega protoni, si carica positivamente e migra verso il catodo. L’elettroforesi verticale è principalmente utilizzata per proteine, quella orizzontale per acidi nucleici. La mobilità di una proteina dipende dal pH. Se viene aumentata la corrente, c’è anche un incremento sensibile della temperatura. Il tampone di corsa, liquido in cui avviene la corsa, permette il passaggio delle cariche e mantiene stabile il pH. Se il tampone ha elevata forza ionica, la banda si assottiglia ma c’è maggiore effetto termico quindi aumenta il rischio di denaturazione. La poliacrilamide si utilizza principalmente per proteine e peptidi (al 90%), l’agarosio principalmente per acidi nucleici e proteine ad alto peso molecolare, come le lipoproteine. Per vedere le proteine si usa un colorante. A seconda della % di agarosio messa nel gel, questo avrà capacità di separare più o meno bene gli acidi nucleici. Il bromuro di etidio dà il fenomeno della fluorescenza ed emette colore nel visibile. L’acrilamide è neurotossica. Per formare il gel c’è bisogno di una soluzione di monomeri, il catalizzatore TEMED, ammonio persolfato che è l’iniziatore della reazione perché forma dei radicali liberi. L’ossigeno dell’aria inibisce la polimerizzazione.

T% = concentrazione totale dei monomeri espressa in g/100mL
C% = concentrazione relativa del cross-legante, cioè solo i grammi di bis-acrilamide in 100g di soluzione. La porosità della PAA dipende da T% e C%. Aumentando T% la porosità aumenta (porosità intesa come il numero di pori presenti). Il C% ha un andamento bifasico; aumentandolo, fino ad un certo punto i pori si infittiscono, poi i pori diventano molto lassi. Il valore che deve essere tenuto in conto comunque è il T%. Maggiore porosità (intesa come grandezza dei pori) = minore effetto di setacciamento. Minore porosità (ovvero matrice più fitta) = maggiore effetto di setacciamento.

SDS-PAGE

Elettroforesi in gel di poliacrilamide in presenza di sodio dodecilfosfato; quest’ultimo destruttura le proteine batteriche. La denaturazione di una proteina consiste nella perdita di struttura secondaria e terziaria. La destrutturazione consiste nell’interazione dell’SDS sulla proteina che però non riesce a rompere i ponti disolfuro pur svolgendo la proteina. Se è presente la struttura quaternaria, c’è la dissociazione in subunità.

Come interagisce l’SDS con le proteine? E cosa fa?

L’SDS si intercala ogni due amminoacidi circa, interagendo attraverso la porzione alifatica con i residui amminoacidici ed esponendo il gruppo solfato all’esterno della struttura. Se la proteina è glicosilata, l’SDS non può entrare quindi ad esempio può essere utilizzata una β-glicosilasi per togliere il glicoside. L’SDS impartisce alla proteina una carica uniforme (negativa) per unità di massa, pertanto la separazione avviene sulla base delle dimensioni molecolari. Per vedere se il gel separa in modo lineare, si effettua il log del peso molecolare considerando la distanza percorsa. A seconda del T% con cui è fatto il gel, si trova una relazione lineare che viene rappresentata da una curva di calibrazione. Di solito si ottiene un andamento sigmoidale. Aumentando il T%, la misura del peso molecolare diventa più accurata. Per non rifare il gel ogni volta, questo può essere graduato in modo da ottenere separazioni con un range di peso molecolare molto più ampio.

La maggior parte delle proteine ha i ponti SH. Usando l’SDS, la banda può essere ritardata e si può concludere che si tratta di una singola catena con molti legami S-S. Per determinare il peso molecolare vengono aggiunti agenti riducenti. Se invece si forma un omopolimero, questo migra più velocemente e il peso risultato è falso. In caso di un eteropolimero possiamo trovare due bande diverse.

Isoelettrofocalizzazione

Separa sostanze anfotere che si concentrano a pH=PI su un gel in gradiente di pH. Il gradiente può essere formato in modo naturale, ovvero con il passaggio della corrente in una miscela di sostanze anfotere, o artificiale, attraverso la polimerizzazione in matrice di PAA di amminoacidi e amminobasici.

Naturale

Gel di PAA o di agarosio a cui vengono miscelati gli anfoliti. Si collegano i due elettrodi, l’anodo imbevuto in una soluzione acida e il catodo in una soluzione basica. Si applica una corrente che determina la formazione del gradiente di pH mediante la migrazione degli anfoliti. Dopo aver tolto la corrente, si applica il campione su carta da filtro e si effettua la corsa. Si utilizzano piastre refrigerate per mantenere bassa la temperatura.

Artificiale

Si utilizzano diversi reattivi già pronti che “congelano” il pH. Si crea un gradiente di pH immobilizzato aggiungendo le immobiline al gel; queste sono dei gruppo acidi o basici che essendo incorporate nel gel creano il gradiente di pH.