appunti di biochimica applicata

TECNICHE ELETTROFORETICHE

• L’elettroforesi è una tecnica che viene usata per separare molecole elettricamente cariche.

PRINCIPI GENERALI

• Migrazione differenziata in un campo elettrico di molecole elettricamente cariche.

Le particelle che subiscono l’azione del campo elettrico, si muovono verso il polo di carica opposta.

→ risentono di una forza di attrazione (o di spinta)

Forza di attrito – forza che esercitano le altre molecole del sistema sulla particella quando si deve spostare per raggiungere il polo di carica opposta. (Forza frenante).

Legge di Stokes: Ff = 6πηrv

• In un intervallo di tempo, le due forze raggiungono una condizione di equilibrio.

Considerazioni:

• Le particelle si trovano tutte nello stesso mezzo;
• Sono tutte immerse nello stesso campo elettrico.

Si deduce che K (costanti)

carica della particella

raggio della particella

La velocità di migrazione di una particella carica, sottoposta all’azione del campo elettrico, è direttamente proporzionale alla carica e inversamente proporzionale alla massa.

Velocità di migrazione

2. particelle con massa diversa si muoveranno all'interno del campo elettrico con velocità diversa.

MOBILITÀ ELETTROFORETICA (μ)

Particelle con mobilità elettroforetica diversa, sottoposte all'azione dello stesso campo elettrico, migreranno con velocità diversa.

MATERIALI DI SUPPORTO

• Alimentatore di corrente
• 2 elettrodi (negativo e positivo)
• Vaschetta per tampone ➡ consente il collegamento tra il supporto e i 2 elettrodi, permettendo il passaggio di corrente. Le cariche vengono trasportate alla soluzione del tampone e dalle biomolecole cariche.
• La matrice (supporto) dove vengono caricati i campioni posti a loro volta in pozzetti creati da un pettinino posto nel gel ancora non polimerizzato.

• Le tecniche elettroforetiche sono di diversi tipi a seconda dei supporti utilizzati, della cella elettroforetica di compiere l'elettroforesi zonale (supporti idonei), ecc., nel rilevamento del materiale sottoposto ad elettroforesi, ecc.

ELETTROFORESI ZONALE

1. materiali impiegati sono:
2. ACETATO DI CELLULOSA: sostituisce la carta da filtro ➡ striscette di carta.
3. Viene utilizzata per la separazione delle proteine sieriche.
4. 1° La striscia di acetato di cellulosa, che funge da supporto viene inibita con il tampone e poi immergerla di due lati in due vaschette contenenti lo stesso tampone.
5. 2° Il siero viene caricato sull'acetato di cellulosa
6. 3° Si applica la differenza di potenziale
7. • Le proteine del siero che hanno carica negativa si muoveranno verso l'elettrodo di polo opposto (ANODO) e viceversa.
8. 6° Si spegne l'alimentatore e si ottiene una serie di spostamenti ad una proteina e ad un gruppo di proteine che hanno tutte una carica ed una mobilità elettroforetica diversa.

ELETTROFORESI DELLE PROTEINE

• Sodio Dodecil Solfato (SDS) = elettroforesi su gel di poliacrilammide

Il metodo si basa sulla separazione delle proteine in base alla dimensione e può essere usato anche per determinare la massa molecolare relativa delle proteine.

(CH₃(CH₂)₁₀CH₂OSO₃^-Na⁺) è un detergente anionico.

I campioni da analizzare su SDS-PAGE vengono prima bolliti per cinque minuti in un tampone contenente β-mercaptoetanolo e SDS 10% - 1,6 ml = 0,4 ml

• riduce eventuali ponti disolfuro presenti che tengono insieme la struttura terziaria della proteina
• si lega fortemente alla proteina e la denatura

Ogni proteina nella miscela è quindi completamente denaturata da questo trattamento e appare in una struttura a forma di bastoncello con una serie di molecole SDS caricate negativamente lungo la catena polipeptidica.

• Il tampone del campione contiene anche:
• colorante tracciabile, ionizzabile, Blu di Bromofenolo = consente di monitorare la corsa elettroforetica
• Saccarosio o glicerolo = conferisce densità alla soluzione del campione
• Tris/HCl a pH 6,8, Tris (idrossimetil)amminometano cloridrato

I gel utilizzati durante l'SDS-PAGE possono essere distinti in:

1. GEL DI IMPACCHETTAMENTO (stacking gel) (5% di acrilammide - pH 6,8) - lining (allineamento) serve per concentrare le proteine in una sottile banda prima della separazione. Si sfrutta una forza ionica del gel differente da quella del gel di elettroforesi detto stacking gel. I pori che si presentano sono larghi e per una lieve migrazione e concentrazione i linings.

Il tubo contenente gas rarefatto, presenta all'ingresso una sottile lastra di alluminio che non permette la lettura delle:

• emissioni di particelle α che presenta una dimensione tale da non passare la lastra
• emissioni di particelle β che essendo piccole penetrano all'interno del tubo ma non è in grado di urtare le molecole di gas

Soglia potenziale

Regione di scarico continuo

Rapporto della capacità di indurre ionizzazione

Il Geiger Müller mi permette solo di fare un'analisi qualitativa (c'è/non c'è) di una sorgente radiativa.

Amperometro

• Base isolata
• Catodo superficie metallizzata
• Filo anodico
• Parete di vetro
• Finestra finale

Dei dati di letteratura relaviti ai coeff.

scientifici e estinzione molari di soluzione acquose di aci.

di nucleici, che:

• DNA doppia elica ➜ O.D. A₂₆₀ = 1 corrisponde a 50 μg/ml
• DNA singola elica ➜ O.D. A₂₆₀ = 1 corrisponde a 33 μg/ml
• RNA ➜ O.D. A₂₆₀ = 1 corrisponde a 40 μg/ml

METODI DIRETTI ED INDIRETTI PER IL DOSAGGIO DELLA CONCENTRAZIONE DELLE PROTEINE

• La concentrazione delle proteine può essere stimata misurando l'assorbanza delle sa soluzioni contenti le proteine a 280 nm (UV) ➜ METODO DIRETTO
• Cromofori nelle proteine: Spettroscopia UV/visibile
  • Legame peptidico 214 nm, lontano UV
  • Ponte disulforo 250 nm
  • Anello aromatico 280 nm, vicino UV
  • Amminoacidi aromatici: TRIPTOFANO, TIROSINA e FENILALANINA

Spetto di assorbimento di una porfirina (EMOGLOBINA)

• La delocalizzazione degli elettroni si estende in tutto tetra pirrolo ciclico (anello della porfirine) e dà luogo a un'intensa transizione a 400 nm, chiamata Banda di Soret
• Lo spetto dell'emoglobina è molto sensibile ai cam. biamenti nel Ferro, da cio si ricavano informazioni sullo stato di ossidazione del metallo (es. Fe(II) e Fe(III)) questi modifino possono essere utilizzate per studio struttura-funzione dell'emo proteina

SVANTAGGI

• Gli acidi nucleici: interferiscono perchè gli anelli puri. nici e pirimidinici hanno massimi di assorbimento vicini a 260 mm, con un assorbimento considerevole che si estende fino a 280 mm.
• Se gli acidi nucleici sono gli unici contaminanti, la concentrazione della proteina può essere stimata ando una formula che corregge ragionevolmente bene il contributo apportato dai acidi nucleici.