Biochimica applicata

Preparazione campioni biologici

I campioni cellulari possono essere animali o vegetali, eucarioti o procarioti. Per analizzare le principali macromolecole biologiche si può partire dalla cellula intera o dai singoli organelli, estraendoli senza alterarne la struttura o la funzione.

Protocollo per estrarre le proteine

• Soluzione di lisi
• Sonicare alla massima potenza
• Centrifugare
• Recuperare il surnatante e conservarlo a -20°C.

Soluzione di lisi

Esempio composizione di una soluzione di lisi: formata da TRIS a pH 7,4, è un tampone che mantiene costante il pH. Il tampone per componenti biologici ideale deve:

• Tamponare a pH uguale alla neutralità
• Essere non tossico
• Non deve precipitare
• Essere stabile
• Non inibire le reazioni enzimatiche

I tamponi più utilizzati sono HCO₃⁻, HEPES, TRIS, acido fosforico, glicina, PIPES, tricina. Il pH si misura con phmetro che utilizza una misura potenziometrica, cartine tornasole, indicatori. Il pH all'interno dell'organismo deve essere mantenuto costante per permettere le varie funzioni enzimatiche, sistemi di trasporto, contrazione muscolare, evitare la denaturazione delle proteine.

Plasma sanguigno pH 7,4: se pH < 7,35 acidosi, se >7,45 alcalosi. Il pH dei fluidi corporei dipende dalle reazioni metaboliche e dal passaggio cellulare di ioni. Il fluido intracellulare ha un pH minore di quello del plasma e del liquido interstiziale.

Sistemi tampone fisiologici

Sono presenti nell'organismo (proteici, HCO₃⁻/H₂CO₃, fosfato):

• Tamponi proteici: capacità degli amminoacidi di legare ioni H⁺ in quanto in soluzione sono nella forma ionizzata.
• Tampone HCO₃⁻/H₂CO₃: utilizza CO₂, un gas che viene continuamente prodotto dalle attività biologiche e presente soprattutto nel fluido extracellulare. CO₂ + H₂O ↔ H₂CO₃ ↔ H⁺ + HCO₃⁻.
• Tampone fosfato: utilizzato soprattutto nei fluidi intracellulari dove c’è una maggiore quantità di ioni fosfato.

Compensazione respiratoria: variando la pressione di CO₂ varia il pH. Compensazione renale: attiva meccanismi di secrezione e assorbimento di H⁺ con la produzione di urina.

Nella soluzione di lisi è presente anche NP40, un detergente, cioè una sostanza anfipatica con una parte idrofilica e una idrofobica. Per la maggior parte sintetici hanno la funzione di solubilizzare le proteine di membrana. Ci sono detergenti non ionici o neutri, ionici, zwitterionici o anfoterici.

• Non ionici: sono neutri tra cui Triton X, NP 40. Sono quelli più blandi.
• Ionici: possono essere cationici o anionici. Gli anionici sono i più utilizzati nei laboratori di biochimica applicata e biologica molecolare. Mentre quelli cationici hanno un elevato potere disinfettante in quanto agiscono sulla membrana esterna dei Gram-.
• Zwitterionici: hanno carica + e – e quindi doppio comportamento in base al pH in cui si trovano.

Altri componenti della soluzione di lisi sono EDTA, un chelante di ioni Mg e Ca, e DTT che mantiene ridotti i ponti disolfuro delle cisteine nelle proteine, inibitori delle fosfatasi e delle proteasi.

Centrifugazione

Metodo di separazione di macromolecole e organelli, sottoposti a forza centrifuga per separarli in base a forma, densità e dimensione.

• Tecniche preparative: separano e purificano un componente per analizzarlo con altre tecniche.
• Tecniche analitiche: sofisticate per lo studio di caratteristiche chimiche e fisiche nel campione. Più sensibile e basta piccole quantità.

Coefficiente di sedimentazione: in secondi. È un tempo e dipende dalla T, densità, viscosità della soluzione. Sono valori piccoli e serve per separare le molecole. Si può usare come unità lo Swedberg dove 1S= 10^-13 secondi.

Centrifugazione preparativa

• Differenziale: consente di isolare i vari componenti cellulari attraverso centrifugazioni successive cambiando la velocità e il tempo. I vari organelli si separano in base alla massa e alla densità.
• In gradiente di densità: sfrutta la diversa densità di una soluzione man mano che si scende nella provetta. Serve a ridurre al minimo le perturbazioni e le interferenze dovute al rimescolamento. Soluti usati: cesio cloruro, saccarosio, polimeri.

Ultracentrifugazione

Sono centrifughe capaci di arrivare a 60000-70000 giri al minuto. Il rotore è generalmente in titanio ed è possibile lavorare in condizioni di vuoto. Anche in questo caso si può avere l’ultracentrifugazione preparativa o analitica.

I rotori possono essere ad angolo fisso oppure oscillanti. Nel primo caso gli alloggiamenti si trovano ad angoli ben definiti, nel secondo l’angolazione cambia durante la rotazione fino ad avere gli alloggiamenti in posizione orizzontale.

Dialisi

Processo di separazione delle molecole in base alle dimensioni. I soluti passano attraverso una membrana semipermeabile immersa in una soluzione a concentrazione diversa fino a raggiungere l’equilibrio. La soluzione viene tenuta sotto agitazione e a 4°C. Usata per rimuovere i sali contaminanti da una soluzione, cambio tampone, variare il pH. La porosità della membrana viene indicata come “limite di esclusione molecolare” ovvero il PM più piccolo che riesce a trattenere, si misura in dalton.

Colture cellulari

Sistemi costituiti da cellule disperse isolate da organi o tessuti e fatti crescere in un microambiente definito con caratteristiche simili a quelle da cui sono state isolate.

Vantaggi: è un sistema più semplice e può essere controllato, riproducibile, economico e disponibile in commercio.

Svantaggi: differente dallo studio in vivo, la coltura in vitro viene sottoposta a stimoli diversi che possono portare a delle differenze e a instabilità genetica.

Le colture derivano da una coltura primaria cioè da un frammento di un organo o tessuto animale o umano. Queste possono essere ottenute in due modi:

• Tecnica dell’espianto: per tessuti che hanno buona capacità adesiva (fibroblasti, cellule epiteliali e muscolari). Frammenti di tessuto triturati, lavati con soluzioni saline isotoniche e centrifugati e poi messi in coltura con poca quantità di terreno per evitare che galleggino. Vantaggi: si ha solo un tipo cellulare, quindi si ha già una prima selezione.
• Disaggregazione enzimatica: nei parenchimi dove devono essere separate le cellule perché sono unite da cellule della matrice (fegato). Vengono usate miscele di due o più enzimi che sono caratteristici per il tipo di tessuto che viene usato: proteasi come collagenasi, dispasi per matrice extracellulare e membrana basale; ialuronidasi o eparasi. Sono sempre associati a molecole chelanti come l’EDTA che sottraggono ioni calcio e magnesio per migliorare l’efficacia di disgregazione. Vantaggi: minore tempo per la crescita, maggior numero di cellule ma si ha una miscela eterogenea di più tipi cellulari presenti nel frammento che cresce.
• Disaggregazione meccanica: più rapida di quella enzimatica perché si forza il frammento attraverso dei setacci rompendo il tessuto. Vantaggio: la raccolta delle cellule è immediata però non lo si può usare per tessuti solidi e densi perché non passano attraverso il setaccio ma solo per tessuti molli (cervello, milza, fegato). Svantaggi: c’è un maggiore danno delle cellule.

Le tre tecniche differiscono per il tempo e per la selettività delle cellule che si ottengono. Per ottenere popolazioni cellulari omogenee è necessario utilizzare delle tecniche di separazione usando terreni di coltura selettivi che permettono la crescita di un solo tipo cellulare.

Ciclo vitale di una coltura

Una volta ottenute le cellule vengono messe in coltura. Nei primi giorni il numero delle cellule si riduce perché l’ambiente del terreno non è uguale a quello del tessuto e quindi alcune muoiono. Quelle che riescono ad adattarsi iniziano a replicarsi. Vengono poi messe in un altro recipiente con un nuovo terreno per poter continuare a proliferare. Questo passaggio viene detto passaggio in coltura e costituisce la separazione tra la coltura primaria e la linea cellulare. Questa avrà una crescita più veloce, esponenziale.

Le linee cellulari si dividono in:

• A vita finita: dopo un certo numero di duplicazioni vanno incontro a senescenza e morte.
• Immortalizzata o continua: dopo un certo numero di replicazioni le cellule vanno incontro a processi di immortalizzazione dove perdono il controllo della replicazione e iniziano a proliferare in maniera incontrollata. Nonostante abbiano una vita “illimitata” mantengono la capacità differenziativa, le caratteristiche morfologiche e la dipendenza dai fattori di crescita. Non danno origine a tumori.
• Trasformate: possono acquisire la capacità di proliferare in maniera incontrollata ma anche nuove capacità sia dal punto di vista proliferativo che morfologiche e funzionali come la crescita multistrato andando a formare dei rigonfiamenti, non rispondono ai fattori di crescita e possono essere tumorigeniche. Vengono usate per lo studio dei tumori avendo anche capacità metastatiche.
• Packaging: sono linee cellulari che si utilizzano nei laboratori per l’impacchettamento di virus per infettare cellule bersaglio. Sono linee geneticamente modificate con geni virali che codificano anche per proteine dell’envelope. Quando la linea di packaging viene infettata da un vettore virale contenente gene terapeutico si ottiene la ricostruzione del genoma virale completo che viene poi inserito nel capside, queste gemmano e si ottiene una cellula virale completa che può essere usata per l’infezione di una cellula bersaglio oppure per una terapia genica.

Queste linee cellulari si possono dividere in cellule che crescono in adesione che necessitano di un supporto e cellule che crescono in sospensione che sono tonde e non aderiscono ma galleggiano nel mezzo come quelle di origine ematopoietica.

Terreno di coltura

Con tutti i nutrienti necessari alla crescita delle cellule, pH neutro, contengono micro e macronutrienti. I terreni differiscono nella quantità dei vari nutrienti e nella concentrazione di glucosio. I tre componenti principali sono frazione salina, frazione micromolecolare formata da proteine e amminoacidi, carboidrati, vitamine, frazione macromolecolare costituita dal siero.

Il pH viene mantenuto da sistemi tampone in genere HCO₃⁻/H₂CO₃. Il pH si può controllare con un indicatore che è il rosso fenolo che può orientare sulla necessità di cambiare o no il terreno e quindi fornire nuovi nutrienti. A pH fisiologico l’indicatore è rosso-arancio mentre diventa giallo a pH acido e rosso-viola a pH basico. L’ambiente tende a diventare acido a causa della produzione di sostanze di scarto dovute al metabolismo cellulare.

L’altro elemento fondamentale del terreno è il siero che contiene fattori di crescita, proteine, ormoni, α2-macroglobulina. Quello più usato è il siero bovino. La scelta del siero è importante per permettere la crescita delle cellule.

α2-macroglobulina è una proteina che è un inibitore della tripsina che serve a staccare le cellule le une dalle altre e anche dalla piastra e poterle così contare.

Applicazioni delle colture cellulari

Utili per l'onco-ematologia molecolare, cioè lo studio di tumori solidi, per terapia genica quindi protocolli sperimentali dove le cellule possono essere geneticamente modificate, patologia molecolare per la caratterizzazione dei difetti genici, vaccini, genetica prenatale, studi di citotossicità e tossicologia per lo sviluppo di nuovi farmaci.

Tipi di test della vitalità cellulare

• Saggio con tripan blu: valuta sia la vitalità che la permeabilità cellulare. È un saggio che si associa alla conta cellulare, le cellule vengono staccate dal recipiente e vengono contate. Il colorante si attacca solo alle cellule danneggiate che presentano dei pori a livello di membrana attraverso cui il colorante entra, mentre le cellule vive attraverso le pompe buttano fuori questo colorante.
• Test rosso neutro: un indicatore che si accumula nei lisosomi di cellule con membrane integre altrimenti esce. Una volta colorato si determina spettrofotometricamente. Avrò quindi anche una misura del danno cellulare confrontandole con quelle integre.
• Rilascio di costituenti cellulari nel mezzo di coltura: viene controllato l’enzima LDH (lattico deidrogenasi). Importante non solo in analisi di laboratorio ma anche nella pratica clinica. Sfrutta una reazione che avviene all’interno della cellula che è la conversione da lattato a piruvato. Se la cellula è danneggiata l’enzima esce e si può trovare nel liquido extracellulare oppure nella circolazione o se coltivato in vitro si troverà nel terreno di coltura. Succede a seguito di infiammazioni, danni muscolari, tumori e leucemie. Si conta con un altro enzima che è la diaforasi che trasforma un composto in un altro fluorescente. La quantità di fluorescenza viene analizzata con lo spettrofotometro.
• Test MTT: è un test di funzionalità mitocondriale. È un sale che può essere trasformato attraverso la succinato deidrogenasi in un sale insolubile. Questi vengono recuperati e solubilizzati in un solvente organico e poi analizzati allo spettrofotometro.

Citofluorimetria

Consente di misurare e caratterizzare le cellule sospese su un mezzo fluido e valutarne contemporaneamente diverse proprietà (tra cui quantità di DNA, espressione di molecole di superficie, marcatori del differenziamento cellulare) cioè consente di fare molte misurazioni in un piccolo intervallo di tempo. Nel campo della biologia cellulare permette di studiare:

• Immunofenotipo: valutare l’espressione di determinati antigeni sia di membrana sia nucleari e citoplasmatici e può essere utile per valutare i vari stadi differenziativi della cellula o gli stati di attivazione funzionale.
• Morte cellulare: valutare vitalità o apoptosi/necrosi riuscendo anche a distinguere questi due processi. Molto utilizzata per la diagnosi di malattie ematologiche.

I citofluorimetri sono costituiti da:

• Sistema di eccitazione composto da una o più sorgenti luminose e da un sistema ottico che convoglia la sorgente luminosa nella cella di analisi. Il fascio di luce viene impostato a una determinata lunghezza d’onda.
• Componente fluidica che serve a convogliare le cellule in sospensione all’interno della cella di analisi in modo ordinato e singolarizzato in modo che ogni cellula venga analizzata. Può analizzare molte cellule in poco tempo. Qui vengono inglobate e/o rivestite da una soluzione salina (sheath fluid) che ha il compito di singolarizzarle.
• Sistema ottico con filtri e lenti che hanno il compito di recuperare l’emissione di luce proveniente dalle cellule e di convogliarla nei fotomoltiplicatori che trasformano questi segnali in segnali digitali che vengono analizzati.

Le informazioni che possiamo ricavare dalla luce emessa sono informazioni sulla dimensione (FSC), forma e complessità citoplasmatica cioè la granulosità (SSC). Se la cellula è rivestita da fluorocromi può essere anche analizzata la fluorescenza emessa quando vengono colpiti dal laser. I fluorocromi sono molecole che emettono fluorescenza a una certa lunghezza d’onda nel momento in cui vengono colpiti dal raggio laser.

Queste informazioni ci vengono restituite con un citogramma, cioè un grafico che ci dà un’immagine in cui ogni nuvola fa riferimento a un tipo cellulare diverso. L’analisi della fluorescenza serve per l’analisi dell’immunofenotipo, cioè quei recettori o proteine extracellulari o di membrana che definiscono il fenotipo della cellula. Indicate come CD (cluster differentiation), sono recettori che hanno una struttura specifica e possono essere marcati con anticorpi specifici che vengono coniugati con un fluorocromo. Molecole diverse esprimono CD diversi e quindi è possibile identificarli.

Il cell-sorter è un citofluorimetro che permette di separare le singole cellule in base alle diverse caratteristiche morfologiche (forma, dimensione, densità) e all’emissione di fluorescenza. Oltre che per lo studio dell’immunofenotipo può anche essere utilizzata per fare uno studio di vitalità cellulare. In questo caso non si utilizzano anticorpi ma coloranti che si legano a DNA.

Uno di questi coloranti è il propidio ioduro (PI) che si intercala nella doppia elica del DNA in modo proporzionale alla sua quantità e quindi si usa per lo studio del ciclo cellulare. Un altro metodo è la marcatura con il bromo deossiuridina (BrdU), analogo della timina che durante la fase di duplicazione viene inglobata nella doppia elica. Si può marcare questa deossiuridina con un anticorpo marcato a sua volta con un fluorocromo. Di solito è sempre accoppiata con la colorazione con il propidio che alla fine ci dà un grafico in cui in x c’è la positività al propidio e in y la positività alla deossiuridina. Si possono distinguere le tre diverse fasi: quelle nella fase S sono nella parte più alta del grafico (positive alla BrdU) mentre la G1 e G2 sono più basse (dove quelle in G1 hanno una maggiore quantità di DNA).

Possono anche essere analizzati i processi di morte cellulare, infatti, nell’apoptosi il DNA viene frammentato e con la colorazione al propidio possiamo vedere un picco ipodiploide che si trova a sinistra del picco della fase G1 dovuto ai frammenti.

Un'altra marcatura usata per l’analisi dell’apoptosi è quella con l’annessina V. Le cellule che vanno incontro ad apoptosi precoce tendono ad esporre sul foglietto esterno della membrana cellulare delle molecole di fosfatidilserina a cui si lega l’annessina.