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tempo di migrazione maggiore o una d.d.p. più elevata. Per tali motivi si preferisce usare

tamponi a bassa forza ionica.

Densitometro: è un fotometro a filtri oppure uno spettrofotometro capace di misurare la

trasmissione della luce attraverso una striscia colorata anziché attraverso una soluzione.

Determinazione qualitativa e quantitativa

Una volta avvenuta una migrazione elettroforetica la striscia viene immersa in coloranti adatti o

opportuni reagenti che producano la loro specifica colorazione che consente di distinguere le

diverse frazioni. Per quanto riguarda la determinazione quantitativa si può scegliere fra due

tecniche: l’eluizione e la lettura densitometrica.

La prima prevede di tagliare le frazioni sulla striscia e di porre i frammenti in altrettante provette in

cui volume noto di solvente in cui vengono eluite. Dopo l’eluizione le soluzioni vengono lette ad

uno spettrofotometro contro il bianco della soluzione di eluizione di una striscia priva di bande

colorate. In base all’assorbanza delle singole eluizioni si può determinare la quantità delle frazioni

in percentuale rispetto al totale di tutte le frazioni. Questo metodo presenta l’inconveniente di essere

lento.

Il metodo densitometrico è più rapido e consiste nel far avanzare con velocità costante la striscia di

fronte al fototubo. Dal registratore si ottiene un grafico avente in ordinate l’assorbanza e in ascisse

la posizione delle bande. L’azzeramento dello strumento viene fatto in un’area priva di componenti

colorati. Il grafico sarà costituito da una serie di picchi relativi alle frazioni separate. L’area di

ciascun picco è proporzionale alla concentrazione della corrispondente frazioni. Di solito un

calcolatore elabora ed esprime il dato in percentuale.

Caratteristiche dei supporti per elettroforesi

La scelta del supporto da usare dipende dal tipo di sostanza da separare e dal grado di risoluzione

che si vuole ottenere.

Carta

Presenta alcuni inconvenienti: richiede molto tempo per la separazione, non è molto precisa poiché

tra una frazione e l’altra permangono zone diffuse di colore dovute al fatto che alcune molecole

proteiche denaturano e precipitano, altre vengono rallentate dalla mancanza di uniformità della

carta. Inoltre si può avere adsorbimento di alcune costituenti proteiche sulle fibre di cellulosa. I tipi

di carta più usati sono la Whatman n1 e n3. Le varie frazioni vengono valutate per eluizione.

Un’applicazione dell’elettroforesi su carta è sfruttata nella “fingerprinting” in cui all’elettroforesi è

associata cromatografia in senso perpendicolare alla separazione elettroforetica.

Acetato di cellulosa

E’ il supporto più usato in quanto è maneggevole e rapido. Si ottiene per acetilazione della cellulosa

e a seconda del grado di acetilazione si hanno membrane con spessore e consistenza diverse, e

anche una capacità maggiore o minore di risoluzione delle componenti proteiche. Le strisce possono

essere rese trasparenti per trattamento con acido acetico ed etanolo il che consente di analizzare

facilmente, al densitometro, il risultato della separazione. Alcuni tipi di acetato di cellulosa sono

secchi mentre altri sono gelatinizzati.

Strato sottile

L’elettroforesi può essere eseguita su strato sottile usando come supporto gel di silice o allumina. In

genere si ricorre a questo metodo quando si vogliono separare aminoacidi e peptici. All’elettroforesi

si fa seguire un’altra elettroforesi (elettroforesi bidimensionale) o una cromatografia perpendicolare

all’elettroforesi.

Amido

Viene usato come gel che la proprietà di separare le sostanze in base alla loro grandezza

molecolare. Si usa amido idrolizzato perché l’amido comune è troppo polimerizzato per dare dei

gel. Le separazioni su gel d’amido sono piuttosto lunghe ed è necessario che durante l’elettroforesi

il gel non si surriscaldi e che non si abbia evaporazione del gel, che a questo scopo viene sempre

protetto da un foglio di plastica che aderisca bene alla superficie superiore del gel.

Agar e agarosio

L’agar è un polisaccaride ottenuto da alghe marine, l’agarosio un suo derivato polimero

dell’agarobiosio costituito da due molecole di galattosio unite da un ponte a Ossigeno tra le

posizioni 3 e 6.

Se si porta a ebollizione una sospensione di agar o agarosio all’1-2%, il polisaccaride si scioglie e

successivamente raffreddandosi gelifica. Questi gel hanno un potere di risoluzione inferiore a quello

dell’amido ma sono più pratici: si preparano rapidamente, si colorano e decolorano con facilità e,

portati a secchezza, costituiscono una pellicola trasparente che può essere letta al densitometro e

conservata senza che si alteri.

Questo tipo di supporto è particolarmente utilizzato per la separazione delle lipoproteine. Inoltre

esso è il mezzo di elezione della immunoelettroforesi nella quale si esegue su gel la sparazione

elettroforetica delle sostanze da esaminare e successivamente si depone un antisiero lungo una linea

parallela alla migrazione. Sia le sostanze che si sono separate che l’antisiero diffondono nel gel e in

corrispondenza della zona di equivalenza di ogni antigene col proprio anticorpo si forma un

precipitato visibile. Usando gli antisieri adatti è possibile riconoscere dalla posizione e dalla forma

degli archi di precipitazione un notevole numero di antigeni.

Poliacrilamide

I gel di poliacrilamide si formano per la copolimerizzazione di acrilamide, un monomero solubile in

acqua, e di un agente che forma legami trasversali a formale un reticolo. L’agente che forma tali

legami è l’ N-N’-metilen bisacrilamide (BIS). La BIS contiene due doppi legami che nelle reazioni

di polimerizzazione formano legami trasversali con catene adiacenti di poliacrilamide. La reazione

di polimerizzazione avviene per un meccanismo a catena di radicali liberi i quali sono generati per

fotolisi di un composto labile (es: riboflavina) o per decomposizione chimica di un composto labile.

Con questo ultimo metodo si genera il radicale instabile SO4- a partire dall’ammonio per solfato.

Altro radicale è ottenuto dalla tetrametiletilendiamina o Temed che reagisce con i radicali per

solfato per formare radicali liberi Temed, che a loro volta reagiscono con l’acrilamide a indurre

polimerizzazione.

Le dimensioni dei pori in un gel di poliacrilamide possono essere controllate variando la quantità di

monomero usato o aumentando il grado di legami trasversali per ottenere pori più stretti. Proteine

relativamente piccole migreranno nel gel con un impedimento minimo, mentre la migrazione delle

proteine più grandi sarà ritardata perché non possono passare attraverso tutti i pori del gel. In ogni

dato gel verranno separate soltanto le proteine che sono in un particolare ambito di dimensioni.

Un gel a gradiente è una forma speciale di gel in cui il grado di porosità varia continuamente dal

basso in alto creando un gradiente nella percentuale di acrilamide e può separare una vasta gamma

di proteine.

Elettroforesi su gel di poliacrilamide in SDS di proteine

La separazione di proteine mediante elettroforesi in gel di poliacrilamide è influenzata sia dalla

carica delle proteine al pH scelto, che dalle dimensioni e dalla resistenza di attrito durante la

migrazione. Per semplificare l’analisi di miscele di proteine è possibile fare in modo che la

separazione si basi solo sulle dimensioni delle catene polipeptidiche. Ciò si ottiene denaturandole

con il detergente sodio dodecil solfato (SDS) che si lega con forza alle proteine in media ogni due

aminoacidi. Le catene rivestite di SDS avranno una carica molto più negativa di quelle non rivestite,

inoltre il rapporto carica/massa sarà identico per proteine diverse poiché il rivestimento di SDS

domina la carica. Pertanto la separazione sarà dovuta quasi esclusivamente alle dimensioni delle

catene polipeptidiche.

Apparati da elettroforesi

Per la separazione di proteine su gel di poliacrilamide è stata usata una varietà di apparati, ma

quello più comune utilizza gel che hanno la forma di tubi o lastre.

Le lastre di gel vengono formate fuori dall’apparato fra due lastre di vetro separate fra loro da

spaziatori di Teflon, e lo spazio viene sigillato in un letto di agarosio fuso. Dopo la sua gelificazione

si versa il gel liquido di poliacrilamide fra le lastre e lo si fa polimerizzare. Lo stocking gel viene

versato sul gel di risoluzione ed ha la proprietà che fanno concentrare le proteine del campione in

una zona sottile sopra il gel di risoluzione, permettendo una separazione per dimensioni efficace e

riproducibile, delle proteine rivestite da SDS di risoluzione.

Disc elettroforesi

Si impiega una colonna di vetro alta 12cm, chiusa in fondo da uno strato di parafilm (specie di

pellicola resistente agli agenti chimici) nella quale si inserisce la miscela (poliacrilamide,

bisacrilamide al 2%, temed e per solfato di ammonio) che si sta trasformando in gel di

poliacrilamide.

Oppure si può impiegare un contenitore dal quale si ottengono lastre di dimensioni 12x14 e di 2-

3mm di spessore (lastra elettroforesi). Sulla “forma” di gel si sovrappone un altro pezzo di gel con

pH inferiore rispetto all’altro gel (pori a 9 circa) e vicino al pI degli aminoacidi, e che ha delle

maglie meno strette (contiene una quantità minore di bisacrilamide).

Ponendo quindi sul gel posto in testa alla colonna alla miscela di proteine da separare avrò

inizialmente una migrazione pressoché uguale alle stesse fino al punto di separazione tra i due tipi

di gel. Da qui in poi la migrazione avviene secondo le dimensioni e le proprietà specifiche di ogni

proteina.

Tecniche di rivelazione

Esistono molti modi per visualizzare la presenza di bande proteiche dopo elettroforesi su gel di

poliacrilamide in SDS. La tecnica più usata è quella di colorare le proteine con coloranti che si

legano con forza. A questo scopo sono stati usati numerosi coloranti ma il più usato è il Comassie

Brilliant Blue R-250.

Per colorare le bande il gel viene rimosso dalle lastre di vetro e le bande proteiche fissate. La

maggior parte dell’SDS viene rimosso immergendo il gel in una soluzione contenente acideo


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AUTORE

Moses

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+1 anno fa


DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea magistrale in chimica e tecnologia farmaceutiche
SSD:
Università: Messina - Unime
A.A.: 2013-2014

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher Moses di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Biochimica applicata e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Messina - Unime o del prof Caruso Donatella.

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