Biochimica applicata - elettroforesi

Elettroforesi

L'elettroforesi è un metodo di separazione basato sulla diversa velocità di migrazione di particelle elettricamente cariche attraverso una soluzione, sotto l'influenza di un campo elettrico applicato. Supponiamo di avere una cella elettrolitica riempita d'acqua e deponiamo all'interno un sottile strato di una soluzione ionica ed applichiamo una certa differenza di potenziale agli elettrodi. All'interno della cella si instaura un campo elettrico che favorisce la migrazione delle particelle cariche verso gli elettrodi opposti.

Perché il fenomeno sia rivelabile, è necessario che gli elettrodi siano abbastanza distanti fra di loro, in modo da non avere una scarica immediata delle specie ioniche ai rispettivi elettrodi. I fattori che influenzano la mobilità di una molecola in un campo elettrico comprendono la carica della molecola (q) e il gradiente di voltaggio del campo elettrico (E) che insieme forniscono la forza che muove gli ioni, e la resistenza di attrito del mezzo di supporto f, che ne contrasta il movimento.

Definizione di mobilità

La mobilità è definita come la velocità di migrazione con un gradiente di voltaggio 1V/cm e viene misurata in centimetri al quadrato per secondo per volt. Questa grandezza può essere definita per ogni sostanza, intendendo come misura di essa la distanza in cm che una particella percorre nell'unità di tempo per unità di campo elettrico, cioè in pratica come rapporto tra velocità della particella e campo elettrico applicato.

V= velocità in cm/s

E= V/cm

Sostituendo in questa espressione al termine V la velocità di una particella elettricamente carica in un mezzo viscoso si avrà l'equazione finale:

n= viscosità del mezzo

Q= numero di cariche della specie ionica considerata

= raggio ionico

In un dato esperimento il prodotto è costante, perciò l'equazione diventa: Risulta quindi che la mobilità elettroforetica di una particella, cioè la sua attitudine a muoversi in un dato mezzo è funzione del rapporto fra carica e raggio della particella e perciò è diversa da una particella all'altra.

Applicazioni dell'elettroforesi

L'elettroforesi è difficilmente applicabile alla separazione di particelle di piccole dimensioni, in quanto queste giungerebbero agli elettrodi in un tempo estremamente breve; al contrario risulta un mezzo di separazione eccellente per macromolecole ed in particolare per le proteine. In genere si determina la mobilità relativa delle proteine, Rf, come il rapporto fra la distanza percorsa da ciascuna proteina rispetto a quella percorsa da una piccola sostanza colorante anionica. L'elevato rapporto carica/massa del colorante lo fa migrare vicino al fronte elettroforetico e davanti alle proteine.

Tipi di elettroforesi

Tiselius ha sfruttato per primo il principio di separazione elettroforetica con una tecnica abbastanza simile al processo descritto prima: tale tecnica impiegata per la separazione delle proteine è conosciuta come "elettroforesi in fase libera". Le particelle cariche venivano separate in una soluzione contenuta in un tubo ad U alla cui estremità era applicata una d.d.p. Le proteine si disponevano in zone diverse lungo le branche del tubo a seconda dell'attrazione subita da parte degli elettrodi in funzione della loro carica. Le diverse frazioni erano valutate in modo complesso, misurando la variazione dell'indice di rifrazione della soluzione in corrispondenza delle zone di localizzazione delle diverse frazioni.

Questo metodo è stato tuttavia abbandonato e sostituito da uno più semplice e pratico chiamato "elettroforesi zonale". Con questo termine si intende un processo di migrazione elettroforetica che avviene su un supporto solido di natura porosa, imbevuto di una soluzione elettrolitica (tampone) in modo da permettere il passaggio di corrente. Usando un supporto poroso come carta da filtro, acetato di cellulosa, gel di agar, agarosio, acrilamide ecc., si ottiene una migliore risoluzione della separazione delle frazioni anche a causa contemporanei processi cromatografici; inoltre è ridotto fortemente il fenomeno della diffusione, con il risultato che le sostanze restano separate in certe zone ben distinte. Quest'ultimo fatto permette di eseguire con facilità i successivi passaggi analitici.

Procedura elettroforetica

Nella forma più semplice una separazione elettroforetica, per esempio su acetato di cellulosa, consta delle seguenti operazioni: la striscia imbevuta di soluzione tampone è montata ben tesa in una cella, il campione è deposto in una determinata posizione e tra i due elettrodi viene applicata una d.d.p. per un certo tempo, durante il quale le sostanze migrano con diverse velocità. Il successivo trattamento di rivelazione sulla striscia mette in evidenza il tracciato elettroforetico, ossia la successione di bande colorate corrispondenti alle varie frazioni separate.

Ciò che avviene è che il tampone che bagna la carta riempie gli spazi tra le fibrille della carta stessa ed è per questo che le sostanze (per esempio gli aminoacidi) riescono a muoversi secondo la differenza di potenziale. Questo sistema ha subito una modifica in quanto la carta è stata sostituita da acetato di cellulosa che è più resistente e va bagnato con il tampone ma non in eccesso.

Fattori che influenzano una separazione elettroforetica

• Mobilità elettroforetica
• Tampone e il suo pH: il tampone ha la duplice funzione di rendere possibile il passaggio della corrente e di mantenere costante il pH poiché una eventuale variazione di quest'ultimo produce una variazione nella carica dello ione e quindi una variazione della sua mobilità. La forza ionica di un tampone assume particolare importanza, in quanto incide notevolmente sulla velocità di migrazione di una particella carica. Infatti, ogni particella carica presente in soluzione è soggetta ad interazione elettrostatica con i vari ioni presenti, i quali rallentano il suo movimento verso il polo opposto. Quindi, con tamponi a forza ionica elevata è necessario un tempo di migrazione maggiore o una d.d.p. più elevata. Per tali motivi si preferisce usare tamponi a bassa forza ionica.
• Densitometro: è un fotometro a filtri oppure uno spettrofotometro capace di misurare...