Biochimica applicata - elettroforesi

Scelta del supporto per la separazione di sostanze

La scelta del supporto da usare dipende dal tipo di sostanza da separare e dal grado di risoluzione che si vuole ottenere.

Carta

Presenta alcuni inconvenienti: richiede molto tempo per la separazione, non è molto precisa poiché tra una frazione e l'altra permangono zone diffuse di colore dovute al fatto che alcune molecole proteiche denaturano e precipitano, altre vengono rallentate dalla mancanza di uniformità della carta. Inoltre si può avere adsorbimento di alcune costituenti proteiche sulle fibre di cellulosa. I tipi di carta più usati sono la Whatman n1 e n3. Le varie frazioni vengono valutate per eluizione.

Un'applicazione dell'elettroforesi su carta è sfruttata nella "fingerprinting" in cui all'elettroforesi è associata cromatografia in senso perpendicolare alla separazione elettroforetica.

Acetato di cellulosa

È il supporto più usato in quanto è maneggevole e rapido. Si ottiene per...

acetilazione della cellulosae a seconda del grado di acetilazione si hanno membrane con spessore e consistenza diverse, e anche una capacità maggiore o minore di risoluzione delle componenti proteiche. Le strisce possono essere rese trasparenti per trattamento con acido acetico ed etanolo il che consente di analizzare facilmente, al densitometro, il risultato della separazione. Alcuni tipi di acetato di cellulosa sono secchi mentre altri sono gelatinizzati.

Strato sottile
L'elettroforesi può essere eseguita su strato sottile usando come supporto gel di silice o allumina. In genere si ricorre a questo metodo quando si vogliono separare aminoacidi e peptici. All'elettroforesi si fa seguire un'altra elettroforesi (elettroforesi bidimensionale) o una cromatografia perpendicolare all'elettroforesi.

Amido
Viene usato come gel che ha la proprietà di separare le sostanze in base alla loro grandezza molecolare. Si usa amido idrolizzato perché l'amido

comune è troppo polimerizzato per dare deigel. Le separazioni su gel d'amido sono piuttosto lunghe ed è necessario che durante l'elettroforesi il gel non si surriscaldi e che non si abbia evaporazione del gel, che a questo scopo viene sempre protetto da un foglio di plastica che aderisca bene alla superficie superiore del gel.

Agar e agarosio

L'agar è un polisaccaride ottenuto da alghe marine, l'agarosio un suo derivato polimero dell'agarobiosio costituito da due molecole di galattosio unite da un ponte a Ossigeno tra le posizioni 3 e 6.

Se si porta a ebollizione una sospensione di agar o agarosio all'1-2%, il polisaccaride si scioglie e successivamente raffreddandosi gelifica. Questi gel hanno un potere di risoluzione inferiore a quello dell'amido ma sono più pratici: si preparano rapidamente, si colorano e decolorano con facilità e, portati a secchezza, costituiscono una pellicola trasparente che può essere

Letta al densitometro e conservata senza che si alteri. Questo tipo di supporto è particolarmente utilizzato per la separazione delle lipoproteine. Inoltre, è il mezzo di elezione della immunoelettroforesi nella quale si esegue su gel la separazione elettroforetica delle sostanze da esaminare e successivamente si depone un antisiero lungo una linea parallela alla migrazione. Sia le sostanze che si sono separate che l'antisiero diffondono nel gel e in corrispondenza della zona di equivalenza di ogni antigene col proprio anticorpo si forma un precipitato visibile. Usando gli antisieri adatti è possibile riconoscere dalla posizione e dalla forma degli archi di precipitazione un notevole numero di antigeni.

Poliacrilamide

I gel di poliacrilamide si formano per la copolimerizzazione di acrilamide, un monomero solubile in acqua, e di un agente che forma legami trasversali a formare un reticolo. L'agente che forma tali legami è l'N-N'-metilen

bisacrilamide (BIS). La BIS contiene due doppi legami che nelle reazioni di polimerizzazione formano legami trasversali con catene adiacenti di poliacrilamide. La reazione di polimerizzazione avviene per un meccanismo a catena di radicali liberi i quali sono generati per fotolisi di un composto labile (es: riboflavina) o per decomposizione chimica di un composto labile. Con questo ultimo metodo si genera il radicale instabile SO4- a partire dall'ammonio per solfato. Altro radicale è ottenuto dalla tetrametiletilendiamina o Temed che reagisce con i radicali persolfato per formare radicali liberi Temed, che a loro volta reagiscono con l'acrilamide a indurre polimerizzazione. Le dimensioni dei pori in un gel di poliacrilamide possono essere controllate variando la quantità di monomero usato o aumentando il grado di legami trasversali per ottenere pori più stretti. Proteine relativamente piccole migreranno nel gel con un impedimento minimo, mentre la migrazionedelle proteine più grandi sarà ritardata perché non possono passare attraverso tutti i pori del gel. In ogni dato gel verranno separate soltanto le proteine che sono in un particolare ambito di dimensioni. Un gel a gradiente è una forma speciale di gel in cui il grado di porosità varia continuamente dal basso in alto creando un gradiente nella percentuale di acrilamide e può separare una vasta gamma di proteine. Elettroforesi su gel di poliacrilamide in SDS di proteine La separazione di proteine mediante elettroforesi in gel di poliacrilamide è influenzata sia dalla carica delle proteine al pH scelto, che dalle dimensioni e dalla resistenza di attrito durante la migrazione. Per semplificare l'analisi di miscele di proteine è possibile fare in modo che la separazione si basi solo sulle dimensioni delle catene polipeptidiche. Ciò si ottiene denaturandole con il detergente sodio dodecil solfato (SDS) che si lega con forza alle proteine e ne conferisce una carica negativa proporzionale alla lunghezza della catena polipeptidica.

proteine in media ogni dueaminoacidi. Le catene rivestite di SDS avranno una carica molto più negativa di quelle non rivestite,inoltre il rapporto carica/massa sarà identico per proteine diverse poiché il rivestimento di SDSdomina la carica. Pertanto la separazione sarà dovuta quasi esclusivamente alle dimensioni dellecatene polipeptidiche.

Apparati da elettroforesi

Per la separazione di proteine su gel di poliacrilamide è stata usata una varietà di apparati, maquello più comune utilizza gel che hanno la forma di tubi o lastre.

Le lastre di gel vengono formate fuori dall’apparato fra due lastre di vetro separate fra loro daspaziatori di Teflon, e lo spazio viene sigillato in un letto di agarosio fuso. Dopo la sua gelificazionesi versa il gel liquido di poliacrilamide fra le lastre e lo si fa polimerizzare. Lo stocking gel vieneversato sul gel di risoluzione ed ha la proprietà che fanno concentrare le proteine del campione

in una zona sottile sopra il gel di risoluzione, permettendo una separazione per dimensioni efficace e riproducibile, delle proteine rivestite da SDS di risoluzione.

Disc elettroforesi

Si impiega una colonna di vetro alta 12cm, chiusa in fondo da uno strato di parafilm (specie di pellicola resistente agli agenti chimici) nella quale si inserisce la miscela (poliacrilamide, bisacrilamide al 2%, temed e per solfato di ammonio) che si sta trasformando in gel di poliacrilamide.

Oppure si può impiegare un contenitore dal quale si ottengono lastre di dimensioni 12x14 e di 2-3mm di spessore (lastra elettroforesi). Sulla "forma" di gel si sovrappone un altro pezzo di gel con pH inferiore rispetto all'altro gel (pori a 9 circa) e vicino al pI degli aminoacidi, e che ha delle maglie meno strette (contiene una quantità minore di bisacrilamide).

Ponendo quindi sul gel posto in testa alla colonna la miscela di proteine da separare avrò inizialmente una migrazione

pressoché uguale alle stesse fino al punto di separazione tra i due tipi di gel. Da qui in poi la migrazione avviene secondo le dimensioni e le proprietà specifiche di ogni proteina.

Tecniche di rivelazione

Esistono molti modi per visualizzare la presenza di bande proteiche dopo elettroforesi su gel di poliacrilamide in SDS. La tecnica più usata è quella di colorare le proteine con coloranti che si legano con forza. A questo scopo sono stati usati numerosi coloranti ma il più usato è il Comassie Brilliant Blue R-250.

Per colorare le bande il gel viene rimosso dalle lastre di vetro e le bande proteiche fissate. La maggior parte dell'SDS viene rimossa immergendo il gel in una soluzione contenente acido acetico diluito e metanolo. Il gel viene quindi immerso in una soluzione contenente Coomassie Brilliant Blue R-250 sciolto in acido acetico diluito e metanolo. Per visualizzare le bande proteiche, in genere si colora il gel fino a che non è

uniformemente blu rimuovendo il colorante in eccesso. Un altro metodo più sensibile ma più laborioso è quello di colorare le proteine con argento, proteine diverse reagiscono diversamente con il nitrato d'argento così che la quantificazione è anche in questo caso solo approssimativa. Se le bande proteiche sono marcate con isotopi radioattivi di energia sufficiente, queste possono essere rivelate direttamente con autoradiografia.

Applicazioni dell'SDS-Page: L'SDS-Page è comunemente usata per la stima della purezza e della quantità delle proteine. Può essere utile esaminare i campioni proteici in SDS-Page durante la purificazione della proteina perché l'elettroforesi permette di visualizzare i contaminanti. Si può distinguere se la contaminazione è dovuta a piccole quantità di molte proteine o a una quantità elevata di una proteina particolare. L'SDS-Page è anche usata

Per stimare la massa molecolare di catene polipeptidiche, si utilizza un esperimento elettroforetico. Per calibrare l'esperimento, si fanno correre contemporaneamente alcuni polipeptidi di massa molecolare nota insieme al polipeptide sconosciuto e si determina la mobilità relativa all'Rf di ciascuna specie.

Immunoblot: questa tecnica viene utilizzata per rivelare e quantificare proteine che reagiscono con un anticorpo specifico. Nel processo, si esegue un frazionamento delle proteine di un campione tramite SDS-Page. Il gel viene poi rimosso dai vetri e steso su una membrana di nitrocellulosa. Un campo elettrostatico forza le proteine a migrare fuori dal gel sulla membrana, dove aderiscono. Poiché sulla membrana rimangono dei siti liberi, essa viene rivestita con una miscela di proteine non specifiche per bloccarli. Spesso, a questo scopo, si utilizza del latte. Successivamente, la membrana viene immersa in una soluzione contenente un anticorpo specifico per la proteina di interesse (detto anticorpo primario).

Poiché tutti i siti che legano proteine sulla membrana sono bloccati, l'anticorpo può aderire alla membrana solo se interagisce con il