Biochimica applicata

Biochimica applicata 2021-2022

La biochimica applicata riguarda i fondamenti teorici, le implementazioni strumentali e gli aspetti tecnici delle molteplici attività di laboratorio biochimico/biomedico, al fine di interpretare i processi biologici a livello molecolare e di utilizzarle per ottenere altre informazioni.

Microscopia

In campo biochimico, la microscopia svolge diverse funzioni:

• Valutare l'integrità del campione;
• Definire la distribuzione spaziale di macromolecole marcate;
• Studio di fenomeni cellulari come mitosi o meiosi.

La microscopia utilizza come strumento principale il microscopio, il quale possiede diverse caratteristiche e parametri fisici che permettono di ottenere immagini più o meno nitide, ingrandite e risolute a seconda delle apparecchiature scelte per la sua costruzione e customizzazione. Il limite minimo per la visualizzazione di un oggetto al microscopio è dato dalla lunghezza d'onda della luce utilizzata, che essendo solitamente appartenente al range del visibile si aggirerà attorno ai 400-700 nm; ciò significa che le cose più piccole osservabili normalmente sono strutture come mitocondri e batteri (0.5 μm).

È poi presente un ulteriore limite, ovvero il limite di risoluzione, che viene indicato come la distanza minima alla quale due punti sono visti come distinti; questo limite dipende da:

• La lunghezza d'onda dell'onda elettromagnetica utilizzata;
• Apertura numerica NA della lente: l'apertura numerica indica la capacità di raccogliere luce da parte della lente; più è grande NA, più la risoluzione aumenta.

Il limite minimo assoluto del limite di risoluzione risulta essere di circa 0.2 μm, e quindi oggetti distanti meno di questo valore non potranno essere visti come separati. In generale, per aumentare ulteriormente la risoluzione si possono utilizzare obiettivi ad immersione. In base alla risoluzione richiesta, la scelta del microscopio adatto è fondamentale e può portare a due diversi tipi di strumento:

Microscopio ottico

Microscopio classico, che focalizza la luce visibile grazie ad una serie di lenti di vetro. Permette ingrandimenti di ca. 1500 volte massimo e ha un limite di risoluzione di ca. 0.5 μm, che può scendere fino a 0.2 μm con obiettivo ad immersione e luce UV. Inoltre, possono essere ottenute immagini a colori e possono essere analizzati campioni sia vitali che non. Esistono diversi tipi di microscopi ottici:

• Classico: detto anche normale, utilizza un fascio di luce proveniente dal basso e necessita obbligatoriamente di un vetrino apposito su cui depositare il campione e quindi analizzarlo;
• Invertito: utilizza un fascio di luce proveniente dall'alto. Ha una risoluzione minore, e perciò non lo si usa per fare analisi microscopiche "classiche"; può essere invece usato per analizzare campioni direttamente nel loro contenitore, senza dover prelevarne una parte e allestire un vetrino apposito;
• A fluorescenza: permette di visualizzare solo ciò che è stato eccitato alla lunghezza d'onda scelta. È utile in caso di marcatura di una molecola o struttura con sonde fluorescenti;
• Confocale: microscopio a fluorescenza evoluto, che utilizza più luci diverse in grado di eccitare ognuna una diversa sonda fluorescente. In questo modo si ottengono delle immagini colorate con più colori e più risolute.

Microscopio elettronico

Microscopio "evoluto", che focalizza un fascio di elettroni grazie ad una serie di lenti elettromagnetiche. Permette ingrandimenti di ca. 200000 volte massimo e ha un limite di risoluzione di ca. 1 nm (la lunghezza d'onda degli elettroni è minore di quella della luce). Inoltre, possono essere ottenute immagini di diffrazione elettronica solo in bianco e nero (il fascio di elettroni non è luce visibile) e possono essere analizzati solo campioni non vitali poiché, se si dovessero muovere, avremo perdita di risoluzione. Esistono due tipi di microscopio elettronico:

• TEM: consente di visualizzare le strutture interne del campione;
• SEM: consente di avere informazioni utili e dettagliate sulle superfici del campione. Viene utilizzato anche in laboratori che studiano materiali, che si occupano di frodi alimentari e di balistica.

È poi presente la microscopia crioelettronica, ovvero che lavora a bassissime temperature in modo da ottenere risoluzioni maggiori. Inoltre, esiste un altro tipo di microscopio non riconducibile a nessuna delle due categorie viste in precedenza, ovvero il microscopio a forza atomica (AFM): con questo strumento, l'immagine viene ottenuta grazie ad una microleva, collegata ad un laser, che muovendosi sulla superficie del campione restituisce un'immagine 3D.

Colture cellulari

Le colture cellulari coinvolgono cellule isolate dal loro ambiente e messe in condizioni di vita adatte al particolare tipo di cellula. Vengono utilizzate per studiare processi cellulari, azioni farmacologiche, per la produzione di fattori di crescita o di proteine. La prima linea cellulare isolata e coltivata in laboratorio è stata la linea HeLa, acronimo derivato dal nome della ricercatrice Henriette Lacks che le isolò da un tumore alla cervice nel 1952. In generale, le colture cellulari più utilizzate sono:

• Colture primarie: cellule prelevate direttamente da un campione biologico (es. organo, embrione, tessuti) e messe in coltura successivamente alla digestione con tripsina per eliminare i ponti proteici tra le cellule. Le colture primarie mantengono le caratteristiche funzionali riscontrabili in vivo e sono perciò utilizzabili per fare studi specifici; uno svantaggio è che l'organo da cui vengono prelevate le cellule è più complesso del solo tessuto, e sono quindi in studio i cosiddetti organoidi, organi prodotti in vitro che possono quindi dare una rappresentatività maggiore di ciò che stiamo studiando. Alcuni svantaggi delle colture primarie sono che hanno un numero di divisioni massime limitato (ca. 30) dopo le quali muoiono per vecchiaia; sono composte da una popolazione eterogenea e quindi composta da più tipi di cellule; quando formano un unico monostrato di cellule, la crescita e la duplicazione vengono bloccate a causa dell'inibizione da contatto, la quale provoca a lungo termine la morte delle cellule poiché non si potranno più dividere;
• Linee cellulari: cellule immortali, o perché tumorose o perché immortalizzate in laboratorio. Quando le cellule, anche se in coltura, subiscono determinate mutazioni che le inducono a trasformare, sarà possibile vedere al microscopio le cosiddette foci di trasformazione, ovvero degli ammassi di cellule che hanno perso l'inibizione da contatto. Il processo di trasformazione può essere indotto da virus o da esposizione ad agenti cancerogeni, e porta alla creazione di cellule con determinate caratteristiche:
  • Tempi di raddoppiamento dimezzati rispetto alle cellule normali;
  • Meno siero necessario per la crescita;
  • Possono non aderire alla fiaschetta in cui crescono;
  • Perdono l'inibizione da contatto.

In generale, le cellule con cui verranno allestite le colture cellulari potranno essere sia prelevate dall'organismo da studiare che comprate da appositi rivenditori.

Laboratorio di colture cellulari

In un laboratorio per colture cellulari deve essere sempre mantenuto un altissimo livello di sterilità, e lo si può fare utilizzando materiali sterili, sanificando superfici e strumentazione (con etanolo al 70%), eliminando rapidamente i rifiuti e usando DPI sterili e/o monouso. Le superfici dei banchi da lavoro dovranno essere non porose e facilmente lavabili. Tipici contaminanti sono muffe, lieviti, batteri o micoplasmi. In generale, tutti i terreni possiedono degli indicatori di pH che permettono di visualizzare subito la contaminazione batterica: il metabolismo dei batteri, infatti, porta sempre a produzione di acidi misti e di conseguenza, in caso di positività, si avrà acidificazione del terreno e quindi cambio di colorazione dell'indicatore. Spesso si aggiungono al terreno streptomicina e antimicina, antibiotici mirati al contrasto delle contaminazioni biotiche. Muffe e lieviti hanno uno sviluppo molto lento e filamentoso, mentre i micoplasmi sono molto piccoli.

Per sterilizzare la strumentazione si possono usare strumenti, come la stufa a secco o l'autoclave, o sostanze disinfettanti, come etanolo al 70% o a base di sali di ammonio quaternari; per terreni e materiali liquidi è invece possibile utilizzare delle membrane filtranti con pori da 0.22 μm. Possono essere utilizzati anche i raggi γ, ma solo su superfici di plastica. Anche la sicurezza è un parametro da rispettare sempre, e il grado da applicare varia a seconda del tipo di cellula e del caso specifico.

Le attrezzature principali che devono essere presenti sono:

• Incubatore a CO₂: presenta due porte, di cui una più esterna, opaca, e una più interna, trasparente in modo tale da permettere la visualizzazione del contenuto dell'incubatore senza dover aprire lo sportello. L'interno è in acciaio inox, deve essere facile da pulire e circondato da uno strato di materiale termostatico. Nell'incubatore devono essere presenti determinate condizioni di T, umidità, pH:
  • T: 37 °C;
  • Umidità: si pone un vassoio di acqua distillata sul fondo dell'incubatore in modo tale che si istauri un'umidità tipica di 37 °C;
  • pH: tra 7.2 ± 0.2. Per mantenere un pH costante, l'incubatore è continuamente insufflato con CO₂ per evitare che il tampone carbonato/bicarbonato, presente nel terreno, si distrugga per allontanamento eccessivo di CO₂ prodotta dalle cellule. Come conferma del corretto pH del terreno si controlla il colore del terreno dato dal rosso fenolo presente. La concentrazione di CO₂ all'interno dell'incubatore dovrà essere di ca. 5%.
• Cappa a flusso laminare: utile per evitare la contaminazione aerea di aria proveniente da fuori la cappa e quindi non sterile. Ne esistono 3 classi:
  • Classe I: non ha utilità in campo biochimico;
  • Classe II: sono di acciaio inox, l'apertura è frontale e tutti gli scambi gassosi sono filtrati tramite filtri HEPA, ovvero filtri assoluti ottenuti mettendo in serie diversi fogli di emulsione di fibre di vetro submicroniche altamente impaccati tra di loro e con pori di diametro di 0.3 μm. L'aria viene aspirata dal basso e riemessa dall'alto. In questo modo l'aria non esce dall'apertura e allo stesso tempo filtra continuamente l'aria;
  • Classe III: sono completamente sigillate, con un flusso d'aria filtrato a priori e quindi immesso nella cappa. Vengono utilizzate in caso di lavoro con organismi anaerobi obbligati e sostanze labili a determinati gas/radiazioni. Tra tutte, le più utili e diffuse per il campo biochimico sono quelle di classe II. Possiedono un flusso laminare verticale che permette la sicurezza sia del campione che dell'operatore. Il flusso laminare è un flusso d'aria unidirezionale formato da filetti di aria sterili paralleli, che si muovono alla stessa velocità in tutti i punti creando una corrente d'aria omogenea e non turbolenta;
• Centrifuga da banco;
• Microscopi ottici: solitamente viene utilizzato quello invertito, ma ovviamente si usa anche quello classico. Per effettuare la conta delle cellule presenti nella fiaschetta da analizzare, si utilizza uno speciale vetrino da microscopio, detto emocitometro, presentante una particolare griglia: la conta avviene tramite conteggio delle cellule di un solo riquadro, in modo tale da avere una stima di quante cellule saranno presenti in tutto nel vetrino poiché basterà moltiplicare per il numero di quadrati. Le cellule presenti sui bordi del quadrato si contano solo su due bordi diversi e quindi non su tutti e 4. Prima di analizzare la coltura al microscopio, è necessario colorare le cellule con del Trypan Blue, un colorante in grado di penetrare solo nelle cellule morte; in questo modo possiamo discriminare, durante la conta, tra cellule vive e morte, le quali dovranno essere contate separatamente le une dalle altre. Ogni quadrato contiene un volume di cellule pari a 10^-4 cm³.
• Bagnetto termostatato: utile per scongelare le cellule e per termostatare i terreni che useremo alla giusta temperatura;
• Frigo congelatore: necessario per la crioconservazione delle cellule. Per essere conservate per un tempo sufficientemente lungo, pressoché illimitato, le cellule devono essere tenute in azoto liquido (-196 °C): a questa temperatura, le cellule bloccano il loro metabolismo senza venire distrutte, ma in ogni caso è necessario aggiungere alla coltura un crioprotettore, come DMSO o glicerolo, per evitare che mettendo rapidamente la coltura a basse temperature si ghiacci prima l'esterno della cellula e poi l'interno. Se ciò succedesse, si verrebbero a formare degli aghi di ghiaccio che potrebbero bucare le membrane e quindi far morire le cellule; quest'effetto sarebbe però visibile solo al momento della decongelazione della coltura. L'azione dei crioprotettori si manifesta quindi con l'abbassamento del punto di congelamento dell'acqua, prevenendo così la formazione di cristalli. Inoltre, per evitare il grande shock termico che sussisterebbe passando velocemente da +37 a -196 °C, si utilizzano i cosiddetti Mr. Frosty, ovvero scatole contenenti alcool isopropilico e all'interno dei quali vengono immerse le criovial contenenti le cellule da congelare; l'effetto dell'alcool è quello di permettere un abbassamento costante di 1 °C alla volta e quindi di evitare lo shock termico. I criovial sono vial con tappi a chiusura ermetica che impediscono l'entrata di azoto liquido e quindi l'eventuale esplosione del vial al momento del riscaldamento della coltura.
• Autoclave: strumento deputato alla sterilizzazione di materiali e strumentazioni che vi vengono poste al suo interno.

Terreni di coltura

I terreni di coltura devono fornire alle cellule tutti i nutrienti necessari come vitamine, sali inorganici, amminoacidi (13 essenziali), glucosio e, ovviamente, indicatore di pH e antibiotici. È possibile aggiungere siero bovino fetale, ma solo in caso di effettiva necessità della particolare cellula coltivata; questo perché abbiamo sia vantaggi che svantaggi riguardo la sua aggiunta:

• L'aggiunta fa sì che protegga le membrane, poiché viscoso, e introduca fattori di crescita e ormoni. Inoltre contiene inibitori della tripsina e veicola lipidi, ferro e molecole organiche;
• Gli svantaggi possono essere il fatto che si abbia un po' di tossicità dovuta alla presenza di anticorpi e/o inibitori metabolici, ed inoltre la sua composizione varia molto da lotto a lotto.

Prima di essere aggiunto al terreno contenente le cellule da coltivare, il siero viene decomplementato (e quindi viene rimosso il complemento) mettendolo a 56 °C per 30 minuti e agitando ogni 5 minuti. I terreni che non contengono siero vengono detti terreni definiti: in generale sono più riproducibili e standardizzabili, ma le cellule saranno più sensibili e deboli, cresceranno più lentamente, e i terreni saranno più costosi e specifici per un solo tipo di cellula.

Trasfezione delle cellule

In generale, le cellule possono essere trasfettate, ovvero ingegnerizzate geneticamente in modo tale da farle produrre proteine specifiche ed eventualmente tracciate con apposite sonde. Per fare entrare nelle cellule i plasmidi, o l'RNA (siRNA o miRNA), di nostro interesse possiamo agire in 3 modi diversi:

• Lipofezione: il genoma viene internalizzato in liposomi che, fondendosi con le membrane cellulari, permettono l'ingresso del materiale genetico nella cellula;
• Virofezione: il genoma viene inserito nella cellula grazie ad un virus contenente il materiale genetico di nostro interesse, il quale produrrà sia proteine virali che quelle relative al genoma introdotto;
• Elettroporazione: le cellule vengono portate in sospensione (a meno che non ci siano già) e vengono messe in una cuvetta particolare poiché contenente un microchip in grado di far passare corrente elettrica pulsata all'interno del terreno liquido. Se nell'ambiente extracellulare sono presenti DNA o RNA extragenomici, questi potranno essere inseriti nella cellula grazie ai pori creati dalla corrente elettrica. Per verificare la possibile entrata del materiale nella cellula si aggiunge all'ambiente extracellulare una certa quantità di GFP: se una volta terminato il processo di elettroporazione la coltura viene messa sotto microscopio a fluorescenza e si ha un risultato positivo alla GFP, allora con un'alta probabilità anche il genoma sarà stato internalizzato.

I siRNA, ovvero small interfering RNA, vengono prodotti a doppio filamento in modo tale da non andarsi a legare a strutture esterne cellulari prima di entrare; una volta internalizzato, l'RNA viene attaccato da una ribonucleasi, detta dicer, e quindi attaccato all'mRNA da silenziare da RISC. È poi presente un'altra proteina, Ago, che ha lo scopo di veicolare il complesso RISC-RNA inibitorio verso l'RNA da tradurre. Essendo l'mRNA a doppio filamento, esso non potrà entrare nei ribosomi e quindi essere tradotto.

Verifica dell'efficacia del siRNA e miRNA

Per verificare che effettivamente miRNA e siRNA hanno avuto l'effetto sperato, si allestisce un western blot di controllo e uno del lisato cellulare a seguito del silenziamento della proteina. Accanto a questa prova, è necessario effettuare anche un test di fluorescenza per verificare che effettivamente la proteina è stata silenziata e non che sia stata caricata una quantità minore di proteina appositamente per mostrare un risultato positivo (frode). Il tracciante fluoroforo per la proteina silenziata dovrà essere un anticorpo anti-proteina specifico; inoltre, dovrà fluorescere a una lunghezza diversa da quella della GFP, tracciante fluoroforo col quale viene verificata l'entrata o meno del siRNA. Se non si ha fluorescenza da parte dell'anticorpo fluorescente, allora significa che effettivamente la proteina manca e che quindi non è stata prodotta.