Biochimica applicata

I LAVAGGI SONO FATTI PER EVITARE FALSI POSITIVI SOVRASTIME E INGOMBRO STERICO ATTORNO AGLI ANTICORPI

L'immobilizzazione di antigeni e anticorpi è permessa dal fatto che sulla base del pozzetto sono presenti sostanze in grado di legare aspecificatamente ogni proteina; se ciò fosse sempre vero, ogni volta che aggiungiamo antigeni o anticorpi nel pozzetto avremo problemi di mancato lavaggio e quindi falsi positivi. Viene quindi effettuato, prima di iniziare il test vero e proprio, il cosiddetto bloccaggio: questo processo ha lo scopo di formare una sorta di tappeto di proteine sul fondo del pozzetto per evitare l'attacco aspecifico di anticorpi e antigeni. Per formare questo tappeto vengono utilizzati principalmente SBA (albumina sierica bovina) o proteine del latte.

Facciamo un esempio pratico: sul fondo di un pozzetto abbiamo glucagone e insulina immobilizzati. Ho necessità di marcare in verde l'insulina, e in rosso il glucagone: per farlo utilizzo...

anticorpi primari anti-insulina di coniglio e anticorpi primari anti-glucagone di topo. Una volta formatosi l'immunocomplesso aggiungo l'anticorpo secondario, questa volta di capra anti-coniglio per l'insulina, e di coniglio anti-topo per il glucagone. Sorge quindi un problema relativo al fatto che l'anticorpo secondario per l'insulina è anti-coniglio, e di conseguenza si legherà all'anticorpo secondario del glucagone; essendo questi due marcati uno in rosso (glucagone) e uno in verde (insulina), la colorazione rossa verrà mascherata da quella verde dell'anticorpo secondario dell'insulina dandoci un potenziale falso negativo per il glucagone (e, sempre per lo stesso ragionamento ma al contrario, un falso positivo per l'insulina). Sarà quindi necessario scegliere un anticorpo secondario per il glucagone di un animale diverso rispetto al coniglio (es. scimpanzé);• Western blotting: una volta separato undeterminato insieme di proteine, grazie all'elettroforesi e in base al loro PM, si fa aderire al gel elettroforetico un foglio di nitrocellulosa; questo materiale si comporta come quello presente sulla base dei pozzetti dell'ELISA, e perciò legherà su di sé tutte le proteine presenti in modo aspecifico (processo aiutato dall'elettricità). È possibile fare più analisi allo stesso tempo poiché le proteine si divideranno formando delle bande verticali (non si mischieranno tra di loro). La membrana di nitrocellulosa verrà quindi bloccata e ricoperta con una soluzione contenente l'anticorpo primario; lascio agire qualche ora e lavo il foglio. Aggiungo quindi l'anticorpo secondario marcato, che si andrà a legare alla catena pesante dell'anticorpo primario, e lascio agire qualche ora (o tutta la notte). Lavo il foglio e aggiungo il substrato dell'enzima con cui viene tracciato il secondario (o

eventualmente faccio analisi di fluorescenza).’ ,CON L IMMUNOFLUORESCENZA È POSSIBILE OTTENERE ANALISI ALTAMENTE SENSIBILI-12pg (10 )FINO AD ARRIVARE A CONCENTRAZIONI DISOLITAMENTE IL MARCATORE ENZIMATICO È O PEROSSIDASI DI RAFANO O FOSFATASI ALCALINA

Su questo tipo di analisi immunologiche si basa il test di gravidanza. Il test prende il nome di ELISA a saponetta, e va a ricercare la presenza di (gonadotropina corionica umana) nelle urine; è possibile ricercarla anche nel sangue. Il test deve dare due risultati positivi sulla stessa lastrina per essere completamente positivo:

• Controllo: si trova più lontano rispetto al sito di semina. Contiene un anticorpo non generico ma che permetta il riconoscimento di una qualche sostanza sempre presente nelle urine; in questo modo possiamo sapere se il test è affidabile o meno, e inoltre che il campione seminato abbia almeno raggiunto C e quindi T poiché posto prima;
• HCGTest: si

trova più vicino al punto di semina. Contiene un anticorpo specifico marcato con un enzima in grado di (?) Nel caso di test come quelli del covid, viene fissato l'antigene per le IgM e successivamente quello per l'IgG.

20/10/21

Omogeneizzazione

Processo fisico che ha lo scopo di disorganizzare le strutture cellulari e, idealmente, recuperare integralmente i componenti intracellulari. A seconda della sorgente della struttura/molecola da isolare, bisognerà scegliere il tessuto adatto e quindi la sede della struttura stessa; nel caso in cui vengano estratte proteine, queste potranno essere:

• Proteine solubili: presenti nel citoplasma;
• Proteine associate a strutture subcellulari: presenti associate a nucleo, mitocondri, RE, membrane plasmatiche.

È una tecnica empirica, e quindi non ci sono vere e proprie leggi che la regolano. I protocolli ad oggi presenti sono stati infatti creati sulla base del try-and-error. Cellule e tessuti vengono sospesi su media

di omogeneizzazione, ovvero sostanze con caratteristiche tali da mantenere la struttura delle proteine e la loro attività biologica. Solitamente i media sono soluzioni, classificate come segue:

• Isotoniche: con saccarosio o mannitolo 0.25 M e/o NaCl 0.15 M. L'aggiunta del sale ha lo scopo di mantenere una forza ionica prossima a quella degli organelli intracellulari, oltre che stabilizzare le proteine. Più frequente;
• Tamponate: a pH 7.8;
• Acquose.

Inoltre, possono essere addizionate con:

• Agenti riducenti: 2-mercaptoetanolo o ditiotreitolo;
• Inibitori di proteasi lisosomiali e nucleasi;
• Chelanti: come EDTA o EGTA (EGTA chela solo il Ca, non il Mg), hanno lo scopo di togliere di mezzo minerali come Ca e Mg;
• Detergenti ionici o non: hanno lo scopo di proteggere le membrane;
• Batteriostatici: come la sodio azide, solitamente sono utilizzati in caso di grandi quantità di campione o in caso di conservazione prolungata;

nome di TRIS (Tris(hydroxymethyl)aminomethane) ed è comunemente utilizzato in biochimica per la sua capacità di mantenere il pH stabile nell'intervallo desiderato. TRIS ha un range tamponante tra 7.2 e 9.0, quindi è adatto per mantenere il pH a 7.2 durante l'isolamento della proteina. TRIS è altamente solubile in acqua e non interagisce con le membrane biologiche, rendendolo un'ottima scelta come tampone per l'isolamento proteico. Inoltre, TRIS ha effetti minimi sui sali presenti nel tampone e ha interazioni ben definite con i cationi. TRIS è stabile, concentrato e ha un assorbimento UV-vis trascurabile, il che lo rende adatto per l'uso in spettrofotometria e altre tecniche di analisi. Inoltre, TRIS è facilmente reperibile in forma pura, rendendolo una scelta conveniente per i laboratori di ricerca. È importante mantenere il tampone TRIS a basse temperature, come in un bagno di ghiaccio o in una camera fredda a 4 °C, per evitare la denaturazione proteica e la proliferazione batterica. La temperatura è un fattore critico da controllare attentamente durante l'isolamento della proteina.nome di tampone di omogeneizzazione. T (°C) pKa Un altro motivo per cui è molto importante tenere controllata la T è 0 °C 8.55 che i tamponi vanno sempre piaccati alla giusta T e concentrazione; 20 °C 8.30 anche la quantità di tampone da utilizzare deve essere controllato, 37 °C 7.22 solitamente 2/3 del V totale (V di tessuto + V di tampone). Per rompere le cellule possiamo applicare diverse tecniche di omogeneizzazione, classificabili come blande o vigorose: - Shock osmotico: si mettono le cellule in soluzioni ipotoniche (banalmente, acqua distillata); - Shock termico: le cellule vengono passate dal refrigerante al bagno termostatato continuamente e velocemente, in modo tale che si formino aghi di ghiaccio (visti per la crioconservazione delle cellule) che buchino le membrane; - Metodi enzimatici: usati principalmente con batteri o funghi poiché dotati di parete cellulare; la digestione enzimatica, portata avanti da lisozimi oe poi applichiamo una pressione elevata tramite il pistone. Questo permette di rompere la membrana cellulare e ottenere il materiale desiderato. • Lisi meccanica: si utilizzano perline di vetro o sfere di metallo che vengono messe in un tubo di omogeneizzazione insieme al campione da lisi. Attraverso l'agitazione meccanica, le perline o le sfere rompono le cellule e permettono di estrarre il materiale interno. • Lisi chimica: si utilizzano sostanze chimiche come detergenti o solventi organici per rompere la membrana cellulare. Questo metodo è molto efficace ma può alterare la struttura e le proprietà del materiale estratto. • Lisi enzimatica: si utilizzano enzimi specifici per rompere la membrana cellulare. Gli enzimi possono essere selezionati in base al tipo di cellule da lisi e permettono di ottenere un'estratto molto puro. Questi sono solo alcuni dei metodi più comuni utilizzati per la lisi cellulare. La scelta del metodo dipende dal tipo di cellule da lisi e dal materiale che si desidera ottenere.

attiviamo il pistone (che può raggiungere P fino a 10 kPa) e togliamo lo spillo: la variazione di P sarà talmente drastica che le cellule scoppieranno;

• Mezzi frizionali:
• o Liquidi:
• ▪ Frullatori (Waring Blender): costruito in acciaio inox per permettere di mantenere il freddo e ridurre l'aumento di T dovuto alla frizione;
• ▪ Rotatori stativi (Ultra Turrax): il campione va messo in bagno di ghiaccio;
• ▪ Omogeneizzatore di Dounce e Potter – Elvejhem: formato da una camera contenente un pistone che muovendosi rompe le cellule del campione nel momento in cui entrano nell'intercapedine che si forma tra camera e pistone.
• o Solidi: troviamo solo la macinazione tramite mortaio. Al suo interno, oltre al campione, possono essere aggiunte o sferette di vetro o metallo, nel caso di omogeneizzazione di cellule di lievito, o sabbia, nel caso di cellule vegetali. Entrambi gli additivi hanno lo scopo di aiutare a rompere

più facilmente le cellule.

• Detergenti:
  • Non ionici: non provocano denaturazione delle proteine, ma anzi aiutano a proteggerla poiché vi silocalizzano attorno all’interno della membrana plasmatica. Il più utilizzato è il Triton X-100;
  • Ionici: mimano i fosfolipidi, inserendosi nelle membrane e distruggendo prima i fosfolipidi e le membrane. Sono:
    • SDS (Sodio dodecil solfato)
    • DOC (Sodio deossicolato)
    • CTAB (Cetil-trimetilammonio bromuro)

Una volta ottenuto un campione omogeneo, bisognerà separare la molecola o la struttura intracellulare di nostro interesse. Per farlo possiamo usare diversi metodi di separazione, la cui scelta dovrà essere fatta in base a:

• Finalità analitica/preparativa;
• Potere risolutivo e capacità;
• Proprietà fisiche della sostanza (solubilità, volatilità, dimensioni, …);
• Stabilità al trattamento specifico;
• Disponibilità

ghe per la separazione di particelle solide e liquide sono ampiamente utilizzate in diversi settori industriali. Queste apparecchiature sfruttano la forza centrifuga per separare le particelle solide dal liquido. I dati in letteratura indicano che le centrifughe possono raggiungere una separazione efficace delle particelle con dimensioni che vanno da pochi micron a diversi millimetri. La capacità di separazione dipende dalla velocità di rotazione della centrifuga e dalle caratteristiche delle particelle da separare. I costi e i tempi di utilizzo delle centrifughe possono variare a seconda delle dimensioni e delle specifiche dell'apparecchiatura. In generale, le centrifughe di piccole dimensioni sono più economiche e richiedono meno tempo per la separazione delle particelle rispetto alle centrifughe di grandi dimensioni. In conclusione, le centrifughe sono strumenti efficaci per la separazione di particelle solide e liquide. La scelta dell'apparecchiatura e l'esperienza dell'operatore sono fondamentali per ottenere risultati ottimali.