Biochimica applicata

2)UTILIZZO DI SOLVENTI ORGANICI PER PRECIPITAZIONE FRAZIONATA

I solventi organici cambiano la loro composizione: ci saranno proteine più solubili e altre meno

solubili. Cambiando del solvente organico tenderanno a precipitare.

Il fenomeno di utilizzare solventi organici va utilizzato con cautela: se ad esempio usiamo acetone

vedrò che le proteine tenderanno a precipitare a seconda della concentrazione di acetone che ho

nel mezzo. Molte volte, questa precipitazione rompe la struttura della proteine, la denatura. Per

evitare il processo di denaturazione con la precipitazione di solventi organici va mantenuta una

temperatura molto bassa; in questo modo avviene la precipitazione senza alterare la struttura

della proteina.

3)UTILIZZO DI MEMBRANE SEMIPERMEABILI PER PRECIPITAZIONE FRAZIONATA

Si utilizzano delle membrane semipermeabili: sono permeabili a molecole molto piccole ma non

riescono a far passare al di fuori molecole che hanno una certa dimensione, in questo caso

parliamo di cut off della membrana, in base al PM.

Se prendo un polimero e lo metto esternamente alla membrana che contiene le proteine accade

che attira su di se la molecola d’acqua e all’interno della membrana diminuisce la quantità di

acqua di soluzione e le proteine tenderanno a precipitare perchè hanno meno molecole dalla

disfunzione per poter renderle solubili.

4)PRECIPITAZIONE FRAZIONATA, UTILZZZO DI TEMPERATURA.

La struttura di una proteina rimane inalterata fino a una certa temperatura; fino a 37° si ha un

aumento dell’attività cinetica enzimatica ma oltre questa temperatura si denatura, si rompe la

struttura terziaria e quaternaria e la proteina non funziona più.

Alcune proteine sono più resistenti di altre; se la proteina è termostabile cioè non si denatura se

non a 50° si può pensare di portare la miscela a 42-45°, la maggior parte delle proteine

tenderanno a denaturarsi mentre la nostra proteina rimane inalterata.

DIALISI

Le membrane semiperbeabili hanno dei pori che si possono definire cut of di grandi o piccole

dimensioni. Questi pori sono circolari.

Queste membrane vengono sfruttate per una caratteristica, che differiscono le proteine, cioè la

dimensione: ci sono infatti proteine piccole, medie e grandi.

dialisi.

Questo fenomeno è chiamato

Abbiamo un contenitore diviso da una membrana semipermeabile con delle proteine A,B,C che

differiscono per la loro dimensione, 10.000 kD, 50 kD e 200kD.

Queste proteine sono state messe in un tampone T. Nell’altra camera metto solo il tampone T.

Che cosa accade?

Il cut off della nostra membrana è 15.000 kD; la prima proteina riesce a passare, la proteina B e C

non riescono a passare. Selettivamaente la proteina A la avrò nella camera con il tampone e avrò

un equilibrio.

Se togliamo il tampone e ne mettiamo uno nuovo si ha un nuovo equilibrio.

Se la proteina di interesse è C metteremo un cut off più grande a 100kD in modo che A e B se ne

vanno e C rimane nel contenitore e riesco a purificarlo. Questo è il principio di dialisi che deve

raggiungere un equilibrio.

Perchè si raggiunga l’equilibiro deve passare del tempo. Perchè si possa eliminare la proteina che

passa bisogna aggiungere tampone fresco.

È necessario considerare il volume del tampone interno e il volume esterno; si raggiunge un

equilibrio ma i volumi possono essere diversi.

ULTRAFILTRAZIONE

Il filtro utilizzato avrà delle porosità opportune che permettono la separazione di 10^3 Daltons, è il

range dei PM delle proteine.

I dischi di filtrazione hanno diversa consistenza e dimensione. Le maglie non sono molto grandi,

non basta la pressione atmosferica per far scendere il liquido ma occorrre una certa forza, una

pressione perchè il liquido riesca a passare.

Questa pressione può essere effettuata mediante l’utilizzo di un gas, l’azoto, che è inerte ai

processi ossidativi che denaturerebbero le proteine. Può essere ottenuto tramite pressione o

tramite centrifugazione perchè il liquido sottoposto a centrifugazione subisce una forza g molto

elevata e riesce a passare il filtro.

Sistema della pressione: costituito da un apparecchio con una cella contenente il volume che

vogliamo intromettere al suo interno; c’è un sistema di agitazione che mantiene all’interno la

soluzione omogenea perchè nel momento in cui il liquido passa si creerebbe una concentrazione

sempre più alta verso il disco e impedirebbe il passaggio delle altre molecole.

Il contenitore è ermetico e la pressione è regolata: se si usa una pressione troppo alta si rischia di

rompere il filtro, se è troppo bassa non si ottiene in tempi rapidi la filtrazione.

Passerà acqua e molecole con dimensione più piccola del filtro che viene utilizzato.

Nel momento in cui abbiamo la rotazione le proteine tendono ad andare sul filtro e devono essere

tenuto in agitazione perchè vengono assorbite perchè si elettrificano quindi delle volte, la

soluzione che rimane non si riesce a dosare. Una volta fatta l'operazione bisogna lasciare lo

strumento per mezz’ora in modo tale che le proteine ritornino in soluzione sennò vediamo sparire

le proteine perchè rimangono sul fondo del dischetto.

Quando si va ad aumentare la pressione il liquido diminuisce; la proteine è passata al di sotto del

filtro ma una certa quantità rimarrà nella soluzione. Per poterla allontanare bisogna aprire il

sistema, riaggiungere il liquido tampone, rifare l’operazione.

Il materiale entra e tende a essere più pratico e il filtrato conterrà la proteina da scartare però non

riuscirò ad eliminarla tutto in un colpo solo, ritorna nel serbatoio dove viene aggiunto nuovo

tampone, rientra e quindi la concentrazione della proteina di interesse diminuisce senza che riapra

tutto il sistema, qui è un’operazione in continuo.

Ci sono apparecchiature dove la provetta a metà sistema c’è il filtro a opportuna dimensione; si

mette sopra il campione e si sottopone a centrifugazione. Il campione tenderà, per la forza g

impressa dalla centrifuga, ad attraversare il filtro e passare nell’altra provetta di raccolta e quindi il

campione si concentra. Fatta questa operazione posso aprire la testa di questa provetta rimettere

il liquido e ripetere per eliminare nel filtrato la proteina che non mi interessa.

Una volta fatta l’operazione, togliere la parte inferiore e per effetto della centrifuga il materiale va a

finire nella vaiars, ed esce fuori.

Che cosa offre questo sistema?

Questo sistema sulla base della grandezza della molecola, sia per pressione o centrifugazione

può:

-eliminare le proteine in base alla loro dimensione

-Quando abbiamo le proteine in 10ml oltre che a eliminare sulla base della dimensione questo

sistema permette di portare le volumetrie a quel volume che non interessa. Si può eliminare il

materiale ma anche concentrare il campione in maniera molto rapida.

Per quanto riguarda la riduzione del volume usiamo dei concentratori che sono centrifughe al cui

interno c’è un rotore. Dove viene messo il materiale, viene fatto girare per essere mantenuto sul

fondo e viene applicato un alto vuoto all’interno: questo bassa la temperatura di evaporazione.

Ponendo successivamente una quantità di calore al sistema io riesco a far evaporare il volume

riducendolo mantenendo la temperatura molto bassa.

ELETTROFORESI

Le proteine sono caricate in maniere opportuna a certi pH, sfruttano la carica e sfruttano anche la

dimensione della particella.

Immaginare di prendere una vasca, di utilizzare un generatre collegato a un elettrodo e collegato

all’interno di un altro elettrodo. Questi elettrodi si chiamano CATODO, accetta i cationi caricato

negativamente e ANODO caricato positivamente.

Abbiamo un elettrodo positivo e uno negativo.

Nella vasca si introduce un tampone opportuno: se il pH si questo tampone è ad esempio 8.8,

quindi superiore alla maggior parte dei punti isoelettrico delle proteine. Se prendo una provetta e li

metto nello stesso tampone come saranno caricate le tre proteine di interesse? Saranno caricate

negativamente. Le proteine hanno un loro punto isoelettrico: più è lontano 8.8 dal punto

isoelettrico maggiore saranno le cariche che se ne vanno.

Se la proteina A ha un punto isoelettrico di 6, B lo ha di 7 e C di 7.1 tutte saranno caricate

negativamente ma quale sarà quella caricata più negativamente? Sarà A.

Tra i due elettrodi c’è un passaggio di corrente, di ampere, che è dato dagli ioni presenti nel

tampone. Le proteine andranno verso l’elettrodo positivo. Chi si muoverà più velocemente? A, poi

B e poi C. C’è un nesso logico tra la quantità di carica e la sua velocità.

Se ho una manopola e applico una ddp più alta farò camminare più velocemente le proteine; c’è

una relazione tra Q (carica), E (potenziale).

A,B,C sono proteine differenti con dimensione differente; mettiamo che A sia piccola, B media e c

sia grande. Chi è più piccola ha più velocità quindi c’è una relazione anche sulla dimensione, A

cammina più di B e C meno delle altre due.

Il liquido oppone una certa resistenza; questa resistenza la chiamiamo fase F, frizione. C’è una

relazione anche tra velocità delle particelle in relazione alla carica, al potenziale e in relazione alla

frizione che sarebbe il PM.

La mobilità è V= ExQ /F

Le proteine si muoveranno in questa soluzione sulla base delle tre caratteristiche fondamentali.

Se cambiamo il sistema dove C è la più piccola, B la media e A la grande: C ha meno carica ma

più piccola e più veloce. Sappiamo che si differenzieranno questi valori ma non sapremo mai chi

elettroforesi native

arriverà per prima All’interfaccia con l’elettrodo positivo. Si parla di cioè

quando la proteina nella struttura tridimensionale con dei punti isoelettrici allo stato nativo. Allo

stato nativo le cariche sono date dalle catene laterali che si presentano esternamente.

Se cambio il pH del tampone a 5 notiamo che le proteine saranno caricate positivamente e C sarà

l’opposto.

Questa elettroforesi viene chiamata anche elettroforesi in soluzione libera. La camera è stata

divisa in due: abbiamo una camera dove c’è l’elttrodo negativo e nell’altra camera l’elettrodo

positivo. Bisogna chiudere il circuito. I primi elettroforesi utilizzarono un foglio di carta bagnato

con la soluzione di tampone 8.8; questo foglio si chiama supporto. Il foglio permette al circuito di

essere chiuso.

Se le proteine vengono depositate sempre A,B,C son caricate negativamente, si muoveranno

verso l&