Biochimica applicata

Biochimica applicata

28 febbraio

Coltivazione delle cellule eucariotiche

Si parla di culture primarie quando prendiamo una biopsia di un tessuto o organo, facciamo un trattamento con tripsina, per disgregare le cellule l’una dall’altra, eliminando la parte delle proteine che costituiscono la matrice extracellulare e successivamente le poniamo in un determinato compartimento. Aggiungiamo a questa cultura primaria tutte le sostanze di cui necessitano: sali, coenzimi, vitamine, glucosio (è la sostanza nutritizia) e si aggiunge il siero vitale bovino perché qui vi sono i fattori di crescita. In questo ambiente controllato e sterile vengono aggiunti anche degli antibiotici o fungicidi per evitare la crescita di contaminazioni.

Questo processo di coltivazione avviene in un luogo sterile con l’utilizzo delle cappe a flusso laminare che permettono di lavorare in condizioni sterili. Le cellule per crescere hanno bisogno di una temperatura controllata in un ambiente in cui il pH deve essere controllato e hanno bisogno di un grado di umidità e di un ambiente particolare: in genere si mima la concentrazione che normalmente è presente nei tessuti periferici, 95% di aria e 5% di CO₂.

Abbiamo bisogno di un’altra apparecchiatura chiamata incubatrice, la quale permette di mantenere una temperatura entro certi limiti e il grado di umidità. In questi contenitori le cellule crescono. La soluzione è colorata in rosso; questo perché le cellule che crescono producono CO₂ e acido carbonico quindi producono un’acidità della soluzione e all’interno viene messo un indicatore chiamato rosso fenolo, rosso a pH 7,2-7,4 e diventa, quando producono acidità, giallo.

Culture primarie e secondarie

Le colture primarie sono derivate dalle cellule prese dall’autopsia e coltivate. Sono cellule “normali” quindi si riproducono sulla superficie dove voglio farle crescere e arrivano a completare, a saturare, tutta la superficie in cui sono a contatto, dopodiché si bloccano, cioè le cellule hanno quella inibizione da contatto.

Prima di raggiungere la confluenza cioè il momento in cui le cellule sono completamente su tutta la superficie, con un rastrellino screpiamo le cellule dal nostro materiale, le ritrattiamo con tripsina e le riseminiamo con una densità inferiore, queste sono le culture secondarie. Con la crescita è normale che le mutazioni possano avvenire; la cellula subisce il fenomeno della mutazione e perde quel fenomeno di inibizione da contatto, inizia a crescere in tutte le direzioni e si dice che è una linea secondaria continua, cioè la cellula ha una vita infinita.

Queste mutazioni avvengono normalmente, però possono essere indotte utilizzando delle mutasi che permettono alle cellule di perdere questa caratteristica di normalità. Le linee secondarie continue ci sono già, basta prendere un tumore, prendere le cellule e coltivarle. Hanno già perso l’inibizione da contatto e le possiamo coltivare.

Adesione e sospensione

A questo punto è bene considerare due tipologie di coltivazione di cellule: per adesione o per sospensione. Quando sono in adesione sono cellule che aderiscono alla superficie della piastra e quelle in sospensione sono cellule che non hanno la capacità di legarsi l’una all’altra, formare una matrice di proteine extracellulari, sono cellule ematopoietiche, quelle che abbiamo nel sangue e che già di per sé sono separate.

Per facilitare l’adesione sul contenitore, il quale non è altro che una plastica, su di esso vengono stratificati prima di mettere le cellule, dei polimeri, cioè hanno delle cariche, positive o negative a seconda del pH a cui lavorano, e questo favorisce l’interazione tra le cellule e stanno in contatto, sono aderite sulla superficie. Il calcio come sale ha la funzione di far aderire le cellule alla base della piastra. Quando cerchiamo di staccare le cellule dal supporto utilizziamo l’EDTA, che è un chelante degli ioni calcio e viene bloccata l’adesione.

La tripsina è un enzima proteolitico e che riesce a tagliare i legami peptidici tra gli amminoacidi quali arginina, amminoacidi basici. La concentrazione di tutto il materiale che ho sia alla stesso range di concentrazione del materiale isotonico, che si trova all’interno della cellula, cioè deve creare un ambiente isotonico, la cellula ha lo stesso gradiente di concentrazione sia all’interno della cellula che verso l’esterno, la cellula non si deforma. Se la cellula fosse stata di tipo ipotonico all’esterno della cellula ci sarebbe una parte della cellula che farebbe entrare acqua e la cellula rigonfierebbe.

L’ambiente medium utilizzato è quello isotonico. Ci sono dei protocolli ben precisi che variano da cultura a cultura. Prendiamo le cellule, staccandole con un rastrellino e le poniamo in una provetta, per mantenere un pH costante usiamo un tampone fosfato e si aggiunge un’adeguata quantità di tripsina, si incuba a 37°C per tre minuti. Se si va oltre abbiamo la degradazione anche delle proteine cellulari e quindi per bloccare l’attività di questa proteasi vengono utilizzati degli inibitori.

Un po’ di tripsina può rimanere; il siero che è contenuto nel medium in cui coltiviamo le cellule, di per sé ha già un inibitore che si chiama alfa 1 antitripsina che blocca l’attività della tripsina stessa. Una volta che abbiamo bloccato la tripsina si fa la semina. La semina viene fatta in un nuovo contenitore e per poter essere efficace la crescita delle cellule non deve essere inferiore a 10.000 cellule per centimetro quadrato. Le cellule animali per poter replicarsi occorre dalle 20 alle 24 ore; per le cellule umane dalle 24 alle 30 ore.

Importante è l’ambiente sterile perché se ci va un batterio, questo nell’arco delle 24 ore si replicherà centinaia di volte e quindi dopo due giorni la cultura sarebbe da buttare per via del contaminante. Le piastre hanno varie dimensioni, con diversi tipi di diametro e quindi con superficie differente. Più la superficie è elevata più tempo ci vorrà per la duplicazione.

Multi well e fiasche

Le multi well sono piastre dove ci sono molti pozzetti si va da 96 a 6 pozzettini. Si fanno crescere quantità di cellule all’interno di questi pozzi: le cellule qui vanno in confluenza. Se abbiamo un farmaco o abbiamo sintetizzato un determinato farmaco servono per trovare l’efficacia del composto di sintesi direttamente sulle cellule e vedere la vitalità. Metteremo concentrazioni del farmaco X, vediamo la sua tossicità e possiamo verificare la vitalità delle cellule e capire se il farmaco è efficace o meno.

Le fiasche sono contenitori dove la crescita avviene sulla superficie di questa fiasca. A differenza delle piastre hanno superficie molto più ampia e si può far crescere una quantità maggiore di cellule. Lo scopo della semina è quello di far crescere le cellule e poi fare delle prove di tossicità o vedere se queste cellule esprimono per un determinato recettore ecc. Anche se riusciamo a coltivarle in maniera efficiente, dobbiamo trovare un sistema per poter conservare queste cellule che abbiamo coltivato.

Se prendiamo una cellula e la poniamo a -10°C al microscopio vedremo che i cristalli di acqua sono molto acuminati e romperebbero la struttura della cellula; accadrebbe anche a -50 o -60°C. Per poter mantenere le cellule potenzialmente native e funzionali dobbiamo raggiungere temperature, in azoto liquido, di almeno -196°C. Questo azoto si trova in contenitori specifici.

Crioprotettori

Nelle nostre cellule che vengono messe in flaconcini di plastica vi viene aggiunto due possibili crioprotettori: uno è il dimetil solfossido (DMSO) che messo insieme alle cellule viene assorbito all’interno della cellula stessa. L’altro crioprotettore è il glicerolo che sta esternamente alla cellula. Questi due crioprotettori hanno la funzione nel momento in cui si arriva a temperature di -196°C, di disidratare la cellula, cioè eliminare l’acqua all’interno di essa. A questa temperatura le reazioni enzimatiche sono azzerate.

Se le nostre criovires vengono prese dal contenitore con l’azoto, possono essere rimesse direttamente in un bagno a 37°C dove la cellula andrà ad idratarsi ed è funzionale, cioè è possibile riprenderla e ricoltivarla permettendo la duplicazione. Questo ci permette di coltivare cellule e di metterle in un congelatore e di accumularle per la nostra sperimentazione. Le cellule non sono visibili ad occhio nudo, hanno dimensioni piccole e abbiamo bisogno di strumenti quali il microscopio.

Microscopio a contrasto di fase

Abbiamo bisogno di un microscopio particolare, un microscopio a contrasto di fase. La fiasca con la nostra cultura viene posta sotto l’oculare del microscopio a contrasto di fase e quindi vedremo le cellule con una tonalità che va dal grigio chiaro al grigio scuro. Nel microscopio è presente una sorgente che è costituita da una lampadina e davanti a questa c’è un diaframma anulare. Ha una componente solida, che non fa passare la luce mentre nella parte più interna, circolare, possono passare le radiazioni luminose.

Perciò la nostra sorgente luminosa attraversa soltanto questo anello circolare che le permette di uscire e va su un condensatore il quale converte i propri raggi sul nostro materiale. La radiazione luminosa va a colpire il medium e non subisce nessun processo di deviazione o rifrazione, mentre se c’è la nostra cellula il raggio può subire un processo di rifrazione cioè di deviazione della nostra sorgente luminosa. Questo consente di avere raggi rifratti e raggi non rifratti e si può considerare come sfasamento dell’onda luminosa. È come se il raggio luminoso fosse più ritardato quando viene rifratto dalla componente più solida come membrana citoplasmatica o nucleo rispetto al raggio che passa nella soluzione medium e non incontra alcun ostacolo.

I raggi vengono poi mandati direttamente su un anello di fasi: i raggi che hanno subito rifrazione vengono ulteriormente sfasati da questo anello di fase e mentre i raggi rifratti dalle cellule del campione, non lo sono e questo aumenta ancora di più il contatto di fase tra le due radiazioni. Questo si riflette nell’obiettivo di vedere due differenze di due tonalità che va dal grigio chiaro ad un grigio scuro. La differenza di fase si riflette sulla luminosità del materiale: vedremo il contorno delle cellule nella tonalità del grigio.

Noteremo la piastra dove ci sono molte cellule, la tonalità è del grigio e le cellule sono legate insieme, si può dire che sono a confluenza, cioè stanno crescendo e probabilmente sono arrivate alla loro fine e dobbiamo procedere a toglierle dalla superficie, a diluirle e riseminare le cellule.

Microscopio in campo scuro

Un altro microscopio più semplice che non ha la lamina ma il diaframma di base, il condensatore e in questo caso abbiamo un obiettivo. Questo raggio luminoso se non viene rifratto, perché attraversa solamente il medium, prosegue la sua corsa verso l’esterno e quindi non è visibile dall’obiettivo. Quindi il punto in cui è passato il raggio, non essendo visto dall’obiettivo verrà visto dai nostri occhi con una colorazione nera perché non è luminosa perché il raggio luminoso è andato fuori dall’obiettivo.

Se invece il nostro raggio incontra la cellula e viene rifratto il raggio va verso l’obiettivo e quindi l’occhio vedrà una luminosità: si dice microscopio a campo scuro perché vedremo dove non c’è rifrangenza il raggio va fuori dall’obiettivo e sarà scuro, mentre dove il raggio è stato rifratto ci saranno le cellule che avranno una tonalità più luminosa.

Il microscopio a contrasto di fase e il microscopio che definisce in campo scuro sono mezzi che permettono di osservare direttamente le cellule senza fare nessun tipo di manipolazione; si può osservare se stanno crescendo, se sono arrivate a confluenza e per vederle nel periodo in cui vengono allevate. Se vogliamo andare ad osservarle in tutti i loro compartimenti, ovvero all’interno, dovremo operare sistemi di colorazione in modo tale che il materiale abbia diverse tonalità.

Coloranti vitali e fissativi

Ci sono coloranti chiamati vitali cioè una volta dati, la cellula rimane allo stato nativo, un esempio è il Trypan Blue e ci sono molte sostanze a carattere fluorescente utilizzate per mettere in evidenza le varie zone della cellula. Ci sono anche coloranti che permettono la fissazione cioè cellule colorate non saranno più native, funzionali; sono coloranti con ematossilina o i coloranti con eosina.

L’ematossilina è un colorante per i processi di fissazione e disidratazione del campione si lega alle molecole degli acidi nucleici (DNA, RNA), mentre l’eosina ha più un’attività verso le proteine che sono contenute nella cellula. Nella colorazione all’ematossilina noteremo bene la parte del nucleo, citosol e siccome si lega bene agli acidi nucleici nel reticolo endoplasmatico ruvido in cui ci saranno gli RNA messaggeri, ribosomiali e avremo una colorazione color rosso. Se invece parliamo della colorazione con eosina queste sono cellule verranno colorate le proteine che si trovano nel nucleo, citosol e nella membrana quindi la cellula ha distribuzione più generale che non quella con ematossilina.

Con questo microscopio siamo in grado di vedere la crescita delle nostre cellule: mettiamo che siano arrivate a confluenza, è necessario riseminare il nostro materiale con densità minore quindi stacchiamo le cellule, queste vengono attaccate con tripsina ed EDTA. Per separarle l’una dall’altra e si può procedere a una nuova semina diluendo il campione. Come si fa a sapere la quantità? Viene utilizzata la camera di Burker.

Camera di Burker

È una piastrina, al microscopio si presenta divisa in vari quadrati, a sua volta i quadrati più grandi sono divisi in quadrati più piccoli e su questa camera di Burker poniamo una certa quantità del nostro materiale che abbiamo separato. Andiamo a vedere al microscopio in contrasto di fase e le cellule si dispongono in questi quadrati. I quadrati sono molti e la tecnica dice di prendere almeno 3 quadrati e contare le cellule che ci sono al suo interno. Questi quadrati devono avere due linee di separazione. L’operazione di conta viene eseguita dal personale di laboratorio per almeno 3 quadrati in modo tale da fare il numero di cellule diviso tre e fare la media, è ovvio che più quadrati ho più la conta è precisa. Ogni quadrato avrà così un certo numero di cellule.

La camera di Burker ha tot numero di quadratini qui ci sta un quantitativo fisso di volume; il numero di cellule trovato va moltiplicato per un certo valore che sono i valori dei quadratini che ci sono per il volume complessivo e otterremo la quantità di cellule. Importante è che le cellule siano nate e quindi funzionali, perché alcune cellule possono andare incontro a un processo di morte cellulare (apoptosi). Come si fa a riconoscere le cellule vive da quelle morte? Sempre usando la camera di Burker (che permette di eseguire la conta), al nostro materiale cellulare viene aggiunto un colorante che si chiama Tryptan Blue. Questo colorante ha la capacità di essere assorbito dalle cellule non più funzionanti. Nella pratica si vanno a contare le cellule che non sono colorate da quelle colorate.

Una volta fatto il conteggio si può calcolare la percentuale di vitalità: questa sarà il numero di cellule vitali diviso il numero di cellule non vitali più cellule vitali per 100. Questo è un indice di come viene eseguita la semina, se le cellule sono tutte vitali significa che è stata fatta correttamente altrimenti alcuni passaggi sono da modificare.

Le cellule viste al microscopio sono in quantità piccola ovvero si osservano quelle colpite dall’obiettivo, abbiamo quindi una limitazione però esiste uno strumento che si chiama citometro a flusso.

Citometro a flusso

Questo permette l’analisi di miliardi di cellule in un minuto. È formato da tre componenti:

• Fluidica
• Ottica
• Elettronica

Nella componente fluidica troviamo un contenitore, nello strumento dove vengono messe le cellule. C’è una pompa peristaltica che non ha la funzione di comprimere e quindi aumentare il flusso. Le cellule passano in questo canale senza essere sottoposte a pressione perché se noi sottoponiamo a pressione il liquido le cellule possono deformare la loro struttura. Le cellule passano singolarmente in questo tubo di flusso. La componente fluidica ha velocità costante, ed importante è che la pressione non sia elevata perché si potrebbero avere cambiamenti nella struttura della cellula stessa.

L’altro componente è l’utilizzo di un laser. Il laser è una radiazione luminosa a una lunghezza d’onda definita. Il laser funge da sorgente la quale va a colpire ciò che passa nel canale. In maniera opposta abbiamo un sensore elettronico che è capace di quantificare l’energia luminosa che il laser dà.

• Se il laser colpisce, non la cellula, ma il liquido in cui è sospesa, non avrà o avrà piccolissime deviazioni (per riflessione, rifrazione) e quindi il raggio sarà in maniera rettilinea.
• Se invece il raggio laser colpisce la cellula è chiaro che subisce dei processi di riflessione o rifrazione e questo sensore riesce a valutare in una certa quantità di deviazioni, si dice, ad angolo basso e questa si chiama deviazione frontale della luce laser, a piccoli angoli, cioè va a visualizzare soltanto deviazioni del laser per piccoli angoli.

Che cosa è che fa deviare per piccoli angoli? La forma della cellula.