Biochimica applicata

STRATEGIE DI PURIFICAZIONI PROTEICHE

È molto difficile ottenere proteine purificate in forma funzionalmente attiva, che è quello che serve per avere un farmaco biologico. Perché vogliamo purificare una proteina?

• Per studi strutturali - Diffrazione raggi-X, NMR, altre tecniche spettroscopiche
• Preparare anticorpi
• Analisi di sequenza
• Studi funzionali
• Per venderla

Strategia

La strategia di separazione di una proteina dipende dallo scopo che la separazione ha. Si dovrà valutare:

• In quale quantità la proteina dovrà essere purificata:
  • Cristallografia raggi X > 10 mg
  • Studi strutturali 1-10 mg
  • Anticorpi 0.2-0.5 mg
  • Sequenziamento o spettrometria di massa - circa 1 pmol (50 ng per una proteina da 50 kDa)
• Con quale grado di purezza si intende ottenerla:
  • Niente altro determinabile (pura al SDS-PAGE e all'HPLC)
  • Nessun contaminante con la stessa attività
  • Una banda sola sul gel
• Se in forma

nativa o denaturata;- Quanto tempo e quante risorse si intende investire?Non esiste una tecnica di purificazione specifica per ciascuna proteica, abbiamo tante tecniche che vanno combinate insieme per tentativi. 3820-03 LABORATORIO 2a-2b25-03La migliore strategia di purificazione mi deve dare: la quantità massima di proteina (più ne ho meglio è), completamente pura e possibilmente funzionalmente attiva e nel minor tempo possibile.La cromatografia, quindi la purificazione di una proteina dalle proteine totali estratte da una coltura cellulare è l'ultimo dei numerosi passaggi che devono essere compiuti per ottenere il miglior protocollo di purificazione che è quello che ci dà il massimo della proteina, la più pura possibile, funzionalmente attiva e nel minor tempo possibile.Questa è la tipica sequenza dei passaggi per la purificazione di una proteina:1. Avere la possibilità di seguire la proteina dalla coltura cellulare

fino alla fine (se è un enzima esistono saggi enzimatici specifici).

Capire da dove purificare la proteina: non da tutti i tessuti è facile estrarre la proteina. Devo scegliere il sistema che mi permette di esprimere la proteina attiva.

Devo poter rilasciare la proteina dal tessuto o dalla coltura cellulare nella quale ho scelto di esprimerla proteina e devo poterla solubilizzare ci sono diverse modalità con cui la proteina può essere rilasciata in soluzione dal tessuto: se abbiamo una coltura cellulare di cellule eucariotiche la cosa più semplice è la lisi cioè farle scoppiare basta mettere le cellule in un tampone ipotonico (meno concentrata) che richiama per osmosi liquidi all'interno della cellula che si gonfia fino a scoppiare rilasciando il suo contenuto all'esterno; se abbiamo a che fare con tessuti (come per esempio l'estrazione della LDH dal fegato o dal cuore) si usano degli omogeneizzatori di tessuti; se

prodotto l'omogenato lo sottoponiamo ad una centrifugazione piuttosto veloce, possibilmente un'ultracentrifugazione alla fine della quale nel pellet saranno presenti detriti cellulari, organelli, cellule rimaste integre dalla rottura, mentre nel surnatante solo proteine solubili (quelle normalmente presenti nel citosol). In questo modo noi arricchiamo il nostro tampone.

A questo punto i passaggi di purificazione entrano nella fase più critica: da un ambiente intracellulare ad un ambiente in cui sono esposte a eventi di degradazione che sono inevitabili e che noi dobbiamo controllare. Questa è la fase più complicata perché per ogni proteina va messo uno specifico tampone di solubilizzazione che va mantenuto per tutto il corso della purificazione che consenta di stabilizzare la proteina quindi preservare la proteina nella sua integrità strutturale e quindi anche funzionale. I fattori più critici per la stabilità delle proteine in

• Molte proteine sono suscettibili di ossidazione. Questo è un problema molto critico per proteine che hanno gruppi sulfidrilici liberi, che possono venire facilmente ossidati e convertiti a ponti disolfuro. Un ambiente riducente può essere mantenuto aggiungendo al tampone mercaptoetanolo, cisteina oppure ditiotreitolo.
• Proteasi endogene: Molte cellule contengono enzimi degradativi (proteasi) che catalizzano l'idrolisi di legami peptidici. Nelle cellule intatte le proteine funzionali sono protette dall'azione delle proteasi, confinate all'interno degli organelli (per es. lisosomi) e rilasciate nel citosol solo se e quando necessarie. In seguito alla rottura delle membrane le proteasi vengono liberate ed

proteina a temperature compresetra 0 e 4 °C.

Frazionare i diversi componenti sulla base della loro diversa solubilità.

5. A questo punto si possono frazionare i diversi componenti sulla base della loro diversa solubilità.

Le proteine sono solubili in un ambiente acquoso principalmente perché i loro residui amminoacidi carichi epolari sono legati a molecole d’acqua.

Qualunque agente in grado di interrompere queste interazioni proteina-acqua diminuisce la solubilità delle proteine perché le interazioni proteina-proteina diventano preponderanti. Gli aggregati proteina-proteina non sono più adeguatamente solvatati e precipitano dalla soluzione.

Ogni specifico tipo di proteina ha una composizione amminoacidica unica. Il grado e l’importanza dellasolvatazione varia quindi molto da proteina a proteina. Differenti proteine precipitano a differenti concentrazioni di agenti precipitanti.

Agenti/condizioni precipitanti:

• Sali inorganici
• Solventi

organici- Polietilenglicole (PEG)- pH- Temperatura

Salting-out: processo che diminuisce la solubilità delle proteine grazie all’aggiunta di determinate concentrazioni di sale, che sottrae l’acqua disponibile per l’interazione con gli amminoacidi carichi. Avranno un effetto diverso a seconda della composizione amminoacidica della proteina.

Principio:

1. Gli ioni di sale aggiunto competono con gli ioni presenti nella soluzione per le molecole di solvente, facilitando l’aggregazione proteica.
2. Per ogni proteina esiste una concentrazione di sale alla quale non c’è più sufficiente acqua per mantenerla in soluzione.
3. Proteine diverse precipitano a diverse concentrazioni di sale.

Questo grafico riporta l’andamento della solubilità di una proteina cellulare tipica, in funzione sia della forza ionica (concentrazione di sale) che del tipo di sale aggiunto. In ascissa abbiamo la concentrazione salina, in ordinata la solubilità.

della proteina.

• La solubilità di una proteina ad una determinata forza ionica varia con il tipo di ioni in soluzione.
• L'efficacia dei vari ioni nell'influenzare la solubilità di una proteina è simile per differenti proteine ed è dovuta alla dimensione dello ione e all'idratazione.

Una proteina globulare tipica, come l'emoglobina, è molto solubile, mantiene la sua solubilità elevata in NaCl che viene aggiunto generalmente nei tamponi di risospensione di una proteina. La solubilità della proteina aumenta gradualmente all'aumentare della concentrazione di NaCl e rimane piuttosto stabile a concentrazioni saline piuttosto elevate. Questa solubilità della proteina diminuisce per l'aggiunta di altri Sali in particolare per l'ammonio solfato che viene generalmente aggiunto nei processi di salting out.

Ammonio solfato (NH₄)SO₄

L'ammonio solfato è il reagente più

comunemente usa