Biochimica applicata

Biochimica applicata

La biochimica applicata rappresenta il braccio operativo della biochimica. Studia i fondamenti teorici, descrive le implementazioni strumentali e insegna le tecniche esecutive delle molteplici attività di laboratorio biomedico. La disciplina studia le tecniche di preparazione dei campioni biologici (tecniche di estrazione, separazione, frazionamento cellulare ecc.) e della loro successiva analisi (con metodi colorimetrici, cromatografici, elettroforetici, immunochimici, biomolecolari) – essa spazia quindi dalla biochimica alla chimica, immunochimica, microbiologia, biologia molecolare e fisica.

La biochimica applicata ebbe il suo enorme sviluppo nella seconda metà del XX secolo, quando le conoscenze permisero lo sviluppo di tecniche e strumentazioni molto potenti, accurate e con ottima riproducibilità della misura. In tal modo questo settore della biochimica andò via via assumendo un’ampia gamma di concetti e conoscenze fino a raggiungere una progressiva autonomia. Oggi la biochimica applicata è sempre più sensibile a problematiche di diagnostica medica di laboratorio e in tale campo è in grado di offrire un ottimo contributo.

Biochimica clinica

La biochimica clinica studia l’effetto della malattia o dei farmaci sui processi biochimici degli organi, dei tessuti o dei fluidi biologici. A differenza della biochimica, che ha l’intento di ricavare comportamenti e leggi generali, la biochimica clinica è interessata allo studio del singolo individuo ammalato.

A questo scopo utilizza la misura delle eventuali alterazioni riscontrabili nei materiali biologici per raccogliere dati che abbiano valore di prove, a favore o contrarie, all’ipotesi formulata dal clinico.

Enzimologia clinica

Lo sviluppo dell’enzimologia clinica inizia nel 1943 con l’osservazione di Warburg che molti enzimi tessutali sono presenti nel sangue e che il loro dosaggio può aumentare nel corso di diverse condizioni patologiche. L’identificazione e la quantificazione del livello di particolari enzimi nel sangue è diventato uno strumento estremamente utile nella diagnosi di malattie e di specifiche condizioni.

Effetto Warburg: consiste nel fatto che le cellule tumorali, anche in presenza di grandi quantità di ossigeno, condizioni in cui il metabolismo è preferibilmente aerobico, che consente di produrre più ATP, nonostante questo, privilegino la via fermentativa quindi la via non aerobica quella che dà la possibilità di produrre meno ATP rispetto alla respirazione mitocondriale quindi si comportano come un tessuto proliferativo indifferenziato. Anche in presenza di quantità normali di ossigeno preferiscono fermentare, produrre acido lattico.

Warburg inizialmente ipotizzò che le cellule cancerose sviluppano difetti mitocondriali che causano alterazioni della respirazione aerobica, e successivamente con studi in vitro approfonditi su mitocondri isolati da cellule tumorali in realtà erano perfettamente in grado di respirare e quindi produrre ATP attraverso la via fosforilativa. Questa capacità dei tumori di proliferare velocemente nonostante non siano in grado di produrre energia attraverso la via, che produce più energia, cioè quella mitocondriale, corrisponde a una rivoluzione metabolica che ha una precisa spiegazione molecolare/biochimica che gli enzimologi clinici usano per fare diagnosi.

Quello che succede nella maggior parte dei tessuti tumorali è che la maggior parte delle cellule che si stanno moltiplicando rapidamente cresce in assenza di ossigeno (ipossia), soprattutto le cellule presenti nella parte più interna della massa tumorale. Questo perché, almeno inizialmente, non ha una rete di capillari sufficiente per un normale apporto di ossigeno. Le cellule cancerose localizzate a più di 100-200 µm da un capillare dipendono dalla sola glicolisi per la produzione di ATP che è assolutamente il modo meno produttivo per le cellule di produrre energia, eppure crescono molto velocemente e molto più velocemente rispetto alle cellule normali.

Per sintetizzare una data quantità di ATP le cellule cancerose devono assorbire molto più glucosio delle cellule normali, convertendolo velocemente in piruvato e quindi in lattato per riciclare il NADH. In generale, più aggressivo è il tumore, maggiore è la velocità di glicolisi.

Dove sta la spiegazione molecolare/biochimica di questo effetto? Sta nel fatto che la glicolisi diventa più efficiente nei tumori ipossici grazie all’azione del fattore di trascrizione HIF-1 (Hypoxic Inducible Factor-1), che stimola la produzione di almeno 8 enzimi glicolitici e dei trasportatori del glucosio. HIF aumenta la sintesi dell’ormone peptidico VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor), che stimola l’angiogenesi (=promuove la vascolarizzazione del tumore e quindi un maggior afflusso di sangue e con esso di glucosio).

Queste sono, dal punto di vista molecolare/biochimico, i cambiamenti maggiori che si hanno nei tessuti molecolari e da un punto di vista diagnostico questo è di straordinaria importanza perché può essere sfruttato per fare una diagnosi puntuale di neoplasia.

QUINDI: in assenza di ossigeno, HIF-1 aumenta l’espressione della maggior parte degli enzimi glicolitici (esochinasi) e dei trasportatori di glucosio. In questa tabella possiamo osservare i due trasportatori del glucosio che vengono sovraespressi nei tumori ipossici, di seguito sono mostrati tutti gli enzimi la cui trascrizione aumenta a cominciare dall’esochinasi che è l’enzima che catalizza la prima reazione della glicolisi che porta alla fosforilazione del glucosio producendo glucosio-6-P ed è esattamente quello che viene sfruttato per la diagnosi biochimica dei tumori maligni.

Applicazioni dell'effetto Warburg

Questo effetto (Warburg) ha applicazioni importanti in campo biomedico. L’elevata glicolisi delle cellule tumorali può infatti essere utilizzata come:

• Fattore diagnostico
• Per localizzare esattamente la massa tumorale
• Fattore per la valutazione dell’efficacia di un trattamento

Vediamo come fattore diagnostico in che modo possiamo sfruttare quest’osservazione che Warburg fece: tradizionalmente, la diagnosi e la stadiazione di un tumore maligno, nonché la pianificazione ed il monitoraggio del relativo trattamento farmacologico, si sono basati sull’imaging anatomico mediante tomografia computerizzata o risonanza magnetica. Queste analisi forniscono un dettaglio squisitamente anatomico e sono indispensabili, soprattutto per guidare gli interventi chirurgici o protocolli di radioterapia. Tuttavia, non consentono di valutare se il tessuto tumorale è di natura maligna o benigna.

L’imaging anatomico ha generalmente un’elevata sensibilità per la scoperta di alterazioni strutturali ovvie (ad esempio strutture ingrandite, caratteristiche di imaging abnormi) ma una bassa specificità per la loro ulteriore caratterizzazione in senso maligno e benigno. Un tessuto necrotico o danneggiato oppure cambiamenti legati ad infiammazione spesso non possono essere differenziati da una formazione tumorale maligna sulla base del solo imaging anatomico, introducendo una difficoltà interpretativa (pazienti falsi positivi). Inoltre, linfonodi che non risultano patologicamente ingranditi sulla base del solo criterio di misura possono contenere cellule maligne e, dunque, rappresentano un problema diagnostico importante nel caso in cui venga utilizzato un imaging anatomico tradizionale.

Per questa ragione, sono stati compiuti notevoli sforzi per la ricerca e lo sviluppo di tecniche di imaging molecolare in grado di rilevare comportamenti anomali dei tessuti. La medicina nucleare ha messo a punto un protocollo di PET (Positron Emission Tomography) per l’imaging di un analogo del glucosio, il F¹⁸-fluoro-2-deossi-D-glucosio, marcato e innocuo, che viene iniettato nel paziente, come strumento per discriminare accuratamente tessuti benigni da tessuti maligni.

Questa tecnica è basata sul fatto che un tessuto maligno è caratterizzato da una velocità del metabolismo del glucosio marcatamente aumentata. Per la visualizzazione e la valutazione di variazioni biochimiche nei tumori, sono necessarie procedure che consentano di:

• Evidenziare con chiarezza differenze potenziali tra tessuti maligni e non-maligni, oppure tra lesioni che rispondono oppure no a una terapia.
• Ottenere dati quantitativi su uno specifico processo associato a una patologia.

IMPORTANTE: NON esistono differenze tutto-o-niente tra tessuti tumorali e tessuti normali è quindi fondamentale disporre di strumenti che ci consentano di misurare potenziali differenze nella qualità o nella quantità. Questo non posso farlo con la TAC tradizionale (quindi con l’imaging anatomico tradizionale) in quanto mi dice se ho una massa ingrandita oppure no, ma posso andare a vedere quello che succede all’interno delle cellule quantificando con estrema precisione attraverso l’imaging molecolare basato sull’effetto Warburg.

Aumento dell’attività glicolitica

• Aumento dell’espressione dei trasportatori di glucosio: ci sono diversi trasportatori del glucosio che legano il glucosio presente nel sangue in modo stereospecifico; nel momento in cui hanno legato il glucosio, si aprono verso l’interno della cellula e rilasciano glucosio all’interno che poi verrà metabolizzato nella via glicolitica. Tanto maggiore è il numero di trasportatori di glucosio all’interno delle cellule tanto maggiore è l’uptake di glucosio da parte delle cellule. Una volta che il glucosio viene internalizzato, tanto maggiore è la quantità di enzimi glicolitici tanto più veloce e più efficace darà la glicolisi.
• Variazione dell’attività di alcuni enzimi glicolitici (esochinasi): abbiamo evidenziato l’esochinasi come uno degli enzimi che viene maggiormente sovraespresso nelle cellule tumorali. L’esochinasi catalizza la prima reazione della glicolisi che è la fosforilazione del glucosio a glucosio-6-P con spesa di una molecola di ATP e infatti un altro cambiamento molecolare importante a cui si assiste nella trasformazione neoplastica delle cellule è il fatto che nelle cellule tumorali in rapida crescita, l’attività esochinasica aumenta molto e fino all’80% delle molecole di esochinasi risulta legato alla membrana mitocondriale esterna. Questo assicura un accesso privilegiato al pool mitocondriale di ATP.

Utilizzo del FDG nell'imaging PET

I cambiamenti nel trasporto e nella fosforilazione del glucosio vengono sfruttati nell’imaging mediante PET grazie all’utilizzo del:

Dal punto di vista strutturale è la stessa struttura, l’unica differenza sta nel C2: nel glucosio c’è un gruppo ossidrilico mentre nell’analogo marcato radioattivamente c’è il fluoro 18, si tratta quindi della stessa molecola che è in grado di legarsi perfettamente ai trasportatori del glucosio che sono presenti nella membrana della cellula tumorale (esattamente come il glucosio). Come il glucosio, il FDG è trasportato attivamente nelle cellule da una serie di trasportatori del glucosio strutturalmente correlati. All’interno della cellula il glucosio, e quindi anche il FDG, vengono fosforilati dall’esochinasi nel primo step della glicolisi. Normalmente, dopo essere stato fosforilato il glucosio continua a percorrere la via glicolitica per la produzione di energia. Viceversa, il FDG fosforilato non può essere substrato della fosfoglucosio isomerasi e rimane intrappolato nella cellula.

L’enzima fosfoglucosio isomerasi richiede strettamente la presenza di un atomo di ossigeno in posizione C-2 per essere attivo: la quantità di 6-fosfo-FDG accumulato dipende dalla velocità con cui viene assorbito e fosforilato, che è più elevata nelle cellule tumorali rispetto a quelle normali. Il decadimento del F¹⁸ genera positroni, che possono essere messi in evidenza mediante PET. La PET e quindi l’effetto Warburg viene utilizzato anche per evidenziare la stadiazione del tumore e anche un certo ruolo prognostico.

Difetti diagnostici e falsi positivi

Quale può essere il difetto diagnostico di uno strumento biochimico così sensibile? Quando ho uno strumento così sensibile che è in grado di monitorare quantitativi molto piccoli, un problema può essere rappresentato da falsi positivi. Devo essere in grado di capire quando quest’aumento abnorme di attività glicolitica è espressione di una trasformazione neoplastica e quando invece è espressione di attività glicolitica aumentata perché così deve essere fisiologicamente.

L’FDG, in quanto analogo del glucosio, viene assimilato in elevate quantità da cellule ad alto utilizzo di glucosio, come quelle del cervello e della vescica. Esempio: paziente affetto da linfoma di Hodgkin con linfonodi neoplastici distribuiti in tutto il corpo. Successivamente alla terapia nel paziente scompaiono i linfonodi che la PET aveva evidenziato come neoplastici, ovunque tranne in due organi particolari: il cervello che è positivo perché è l’organo che utilizza la maggior parte del glucosio dell’intero organismo e la vescica che elimina l’eccesso di FDG con le urine.

Utilizzo di enzimi in biochimica clinica

• Indicatori per la diagnosi e la prognosi di numerose malattie.
• Reagenti analitici (misura dell’attività di altri enzimi o di sostanze non enzimatiche-substrati) in fluidi biologici.
• Agenti terapeutici (per curare malattie metaboliche e non causate dalla carenza di particolari enzimi).

Classificazione

• Funzione biologica
• Classificazione internazionale
• Modalità di produzione (rilascio nel fluido biologico analizzato)
• Sede di produzione

Funzione biologica

Classificazione in base alla quale diversi enzimi liberati nel sangue da una stessa cellula sono distinti in relazione al meccanismo fisiopatologico che ne determina l’aumentata immissione in circolo.

Nel fegato:

• Trovare la fosfatasi alcalina (ALP) che viene prodotta dal fegato nel sangue è sintomo di Colestasi (ristagno della bile nella cistifellea).
• La aspartato amminotransferasi (AST) è una transaminasi sintomo di Citolisi (rottura degli epatociti)
• Alcuni enzimi come la colinesterasi (CHE) possono essere alterati nella loro biosintesi in diverse patologie a carico del fegato.
• Alcuni enzimi come la gammaglutammiltransferasi vengono sovraespressi per esempio in condizioni di sofferenza epatica come l’abuso di alcol.

Classificazione internazionale

Ogni enzima è classificato da 4 numeri che ne definiscono le caratteristiche biochimiche: EC number = Enzyme Commission number. La classificazione più utile e interessante è come viene prodotto l’enzima e da che tessuto viene rilasciato. Nei laboratori di diagnostica plasma e siero sono le fonti più comuni di materiale negli esperimenti di biochimica clinica. Ci sono molti marcatori di interesse diagnostico.

• Siero: fluido che appare in seguito alla coagulazione del sangue.
• Plasma: porzione liquida del sangue non coagulato.

Quando il sangue si separa nella parte corpuscolata e nella parte liquida (siero) possiamo separare attraverso centrifugazione, la parte corpuscolata contiene le cellule del sangue (GR, GB e piastrine). Non ci interessa dal punto di vista biochimico ma quello che ci interessa è il siero, che è una componente molto eterogenea: è prevalentemente una soluzione acquosa (90% di acqua) e nel 10% del residuo solido ci sono moltissime sostanze che possono essere dosate attraverso protocolli biochimici.

Componenti del siero

La maggior parte sono proteine plasmatiche:

• Albumine (che servono per trasportare grassi che sono solubili nel sangue)
• Globuline
• Fibrinogeno
• Ormoni
• Molti enzimi (come creatinchinasi e lattico deidrogenasi)

Sono presenti anche sostanze inorganiche, alcune sostanze organiche e infine i gas respiratori ed inerti.

Enzimi presenti nel plasma

Gli enzimi presenti nel plasma circolante si dividono in due categorie:

• Plasma-specifici
• Non-plasma specifici
  • Tessutali
  • Di secrezione

Enzimi plasma-specifici

• Sono normalmente presenti nel plasma
• Svolgono la loro funzione primaria nel sangue
• Hanno livelli di attività normalmente più alti nel plasma che nei tessuti

Esempi:

• Enzimi della coagulazione (trombina)
• Enzimi della fibrinolisi (plasmina)
• Enzimi per l’attivazione del complemento
• Colinesterasi (o pseudocolinesterasi)
• Ceruloplasmina

Colinesterasi (o pseudocolinesterasi)

È un enzima prodotto a livello epatico, della classe delle idrolasi, che catalizza la seguente reazione: l’assenza o mutazione della colinesterasi porta alla cosiddetta deficienza pseudocolinesterasica, una condizione silente che manifesta effetti solo quando alle persone affette sono somministrate miorilassanti (come la succinilcolina) a livello muscolare, di solito durante interventi chirurgici per facilitare le manovre di intubazione. La mancata azione dell’enzima rende il paziente più sensibile ai rilassanti (che non vengono inattivati per mancanza di enzima) tanto da portare a paralisi prolungata dei muscoli dell’apparato respiratorio, rendendo necessaria la ventilazione artificiale. Alte concentrazioni di colinesterasi nel plasma sono state associate nel 95% dei casi a infarto miocardico.

Ceruloplasmina

Proteina deputata al trasporto del rame nel sangue. Sintetizzata principalmente dal fegato, la ceruloplasmina redistribuisce il rame epatico ai tessuti. Si comporta inoltre come proteina di fase acuta nel processo flogistico, aumentando i propri livelli nel siero durante processi infiammatori, infezioni severe, alcuni tipi di tumore.

Enzimi non-plasma-specifici

Sono enzimi intracellulari presenti normalmente nel plasma a livelli minimi o a concentrazioni molto inferiori a quelle tessutali.