Biochimica applicata

BIOCHIMICA APPLICATA

Tecniche di purificazione proteine: introduzione amminoacidi e proteine.

Le proteine sono sostanze organiche, in generale le definiamo come polimeri di

amminoacidi. Un amminoacido ha un centro chiamato carbonio alfa, che può fare 4

legami ed è impegnato con 4 gruppi differenti, che sono il gruppo amminico, il gruppo

carbossilico, un atomo di idrogeno e l'ultimo legame può essere un idrogeno o

qualsiasi altro gruppo chimico che da specificità all'amminoacido. Questi sono i

monomeri delle proteine e quindi più amminoacidi si legano insieme e danno origine

alle proteine.

Gli amminoacidi possono esistere in 2 forme: forma ionica o zwitteronica e non ionica.

La ionizzazione è dei 2 gruppi (amminico e carbossilico) e possono ionizzare a PH

differenti. Il gruppo amminico può essere in forma dissociata o protonata. Il gruppo

carbossilico anche lui può essere in forma dissociata, ed essendo un acido può perdere

un H e trasformarsi nella forma protonata.

20 sono gli amminoacidi proteici che costituiscono le proteine.

I 20 amminoacidi sono classificati in base al gruppo R, se esso sia carico non carico,

alifatico o non alifatico, polare o non polare. Questo gruppo da una proprietà differenti

ai vari amminoacidi.

Ci sono gli amminoacidi alifatici polari (gruppi alcolici o solfonici) non carichi che

riescono a reagire con le molecole d'acqua. Ci sono quelli alifatici non polari. Ci sono

quelli aromatici, in cui il gruppo R è formato da un anello aromatico. Ci sono quelli

carichi che possono avere un radicale carico negativo o positivo. Di solito le proteine

sono fatti da un buon mix di amminoacidi polari e non polari, carichi e non carichi. Se

una proteina è fatto da 10 cariche positive e 11 negative la proteine è carica

negativamente. Quando invece in una proteina il numero delle cariche positive è

uguale a quelle negative, allora la proteina sarà neutra.

LEGAME PEPTIDICO: è fatto tra il gruppo carbossile di un amminoacido e il gruppo

amminico di un altro, è un legame covalente molto forte, con la perdita di una

molecola di H2O. Il gruppo OH del carbossile si stacca e anche l'H del gruppo

amminico, staccandosi viene espulsa una molecola di H2O. Vari amminoacidi formano i

PEPTIDI, OLIGOPEPTIDI e sopra i 100 amminoacidi si parla di PROTEINA.

La struttura tridimensionale delle proteine è molto complessa per cui per semplicità si

individuano quattro diversi livelli in ordine di complessità: struttura primaria,

secondaria, terziaria e quaternaria.

La proteina in generale ha una struttura non lineare e ciascuna di essa ha una

funzione biologica che è garantita dalla sua tridimensionalità. Se la proteina è

srotolata, denaturata quindi, perde anche la sua funzione biologica. Se vogliamo

studiare la proprietà biologica di una proteina essa deve rimanere nel suo stato nativo,

conformazionalmente compatto.

PURIFICARE UNA PROTEINA: La purificazione di una proteina consiste nell’estrarre una

molecola di mio interesse dalla matrice biologica eterogena in cui si trova, quindi

isolarla da una miscela eterogenea contenente altre proteine, o anche acidi nucleici,

polisaccaridi o lipidi, riuscendo ad eliminare tutte le proteine che non sono di mio

interesse per arrivare alla fine ad ottenere una soluzione pura della proteina che voglio

studiare.

Tolgo tutto ciò che non mi interessa, andando ad esclusione, fino a che non rimane la

classe di quelle proteine che voglio studiare.

SCHEMA PURIFICAZIONE ENZIMA:

1. ESTRAZIONE GREZZO: ottenere un estratto grezzo, che è un estratto totale delle

proteine contenute nella matrice biologica.

2. PRECIPITAZIONE FRAZIONATA: elimino una grossa fetta di proteine che non mi

interessano, esse così diminuiscono ma ciò che aumenta è l'attività dell'enzima,

come se l'avessimo concentrato.

3. GEL FILTRAZIONE

4. CROMATOGRAFIA DI AFFINITA'

Quello che mi serve sapere per la purificazione di una è la proprietà chimico fisica

della proteina che mi interessa: ciò che fa, che dimensioni ha ,che PH ha, qual è la sua

struttura (alfa o beta).

Dove le cerco le proteine? In una matrice biologica. I metodi utilizzati per ottenere

l’estratto grezzo si differenziano in funzione della localizzazione subcellulare della

proteina da purificare:

quindi devo sapere se la proteina è extracellulare o intracellulare. Le proteine

extracellulari (presenti nel plasma umano o secrete in un brodo di coltura batterico),

vengono separate dall’eventuale materiale insolubile semplicemente per

centrifugazione o filtrazione, in cui ottengo una parte al di sotto fatta da tutta la parte

corpuscolare (frazione più pesante) e una parte superiore fatta dal plasma che è la

parte liquida e più leggera. La parte sotto si chiama PELLET quella superiore

SURNATANTE.

L'altra possibilità è la filtrazione, dove il filtro trattiene la parte corpuscolare e lascia

passare la parte liquida.

Le proteine intracellulari (citoplasmatiche o quelle presenti negli organuli subcellulari)

devono essere estratte con metodi che provocano la rottura delle cellule, ovvero la

rottura della membrana delle cellule e liberare il contenuto delle cellule.

Come si rompono le cellule? Con la lisi.

LISARE una cellula: esistono tanti metodi per lisare le cellule. Si dividono i 2 categorie:

metodi non meccanici e metodi meccanici. I metodi non meccanici non prevede

nessuna strumentazione per far avvenire la lisi, mentre quelli meccanici serve una

strumentazione meccanica.

Ciascuno di questi metodi deve mantenere inalterata la struttura biologica della

proteina.

Se faccio bollire una cellula la rompo, ma denaturo anche la proteina. Tutti i metodi

devono preservare l'attività biologica.

METODI NON MECCANICI:

A) Nel caso di cellule animali sia la membrana plasmatica che il citoscheletro

rappresentano strutture relativamente deboli. Lo shock osmotico o termico,

seguito dalla solubilizzazione con detergenti (SDS o Triton X100) sono sufficienti

per rompere le cellule. Questo metodo metodo viene definito GENTILE, il quale

utilizza detergenti, un sapone disgrega la membrana cellulare e butta fuori così

il suo contenuto citoplasmatico.

B) Le cellule vegetali sono caratterizzate dalla presenza della parete cellulare di

cellulosa, e vengono prima trattate con miscele di pectinasi e cellulasi (enzimi

digestivi che degradano pectina e cellulosa-> DIGESTIONE ENZIMATICA) seguita

dagli stessi trattamenti del punto (A).

C) Le cellule batteriche per la presenza della parete cellulare di peptidoglicano

vengono prima trattate con lisozima (enzima digestivo che degrada il

peptidoglicano) seguita dagli stessi trattamenti del punto (A).

METODI MECCANICI:

1) Omogenizzazione (tessuti e cellule)

2) Estrusione liquida (cellule)

3) Utilizzo di sferette di vetro (cellule)

4) Sonicazione (cellule)

Di solito si prediligono i metodi meccanici, ma tutti i metodi meccanici generano calore

che denatura le proteine con perdita dell’attività biologica. Perciò è molto importante

raffreddare per tutto il processo il campione (a circa 4°C) e condurre il metodo per

periodi brevi.

In un OMOGENIZZATORE A LAME, la sua parete è mantenuta fredda in quanto le lame

girano a velocità elevatissima e generano calore, e si potrebbe andare a denaturare le

proteine.

OMOGENEIZZATORI A PESTELLO sono manuali, il campione inserito nel cilindro di

vetro, c'è un pestello, il campione vien schiacciato dal pestello.

DISPOSITIVI A ESTRUSIONE LIQUIDA: uno stantuffo schiaccia la sospensione cellulare

verso il basso ad elevate pressioni, in fondo al contenitore c'è una valvola che quando

raggiunge la massima pressione viene aperta e la sospensione può uscire, la

differenza di pressione che si è generata rompe le cellule.

La French press riesce a rompere anche le cellule batteriche e quelle vegetali.

SFERETTE DI VETRO: sfere delle stesse dimensioni delle cellule, qui quelle batteriche

non vengono rotte, quindi si utilizza per le cellule eucariote. La sospensione viene

messa nel contenitore, la provetta viene vorticata, le sferette si muovono e l'attrito

che si forma rompe le membrane.

SONICATORE: una sonda attaccata ad un generatore di onde ultrasoniche, la sonda

viene immessa nella sospensione, è un metodo aggressivo, utilizzato per le cellule

batteriche. Si genera un notevole surriscaldamento e occorre generare cicli on e off,

le onde inoltre sono dannose per l'udito e l'operatore deve avere delle cuffie. IN

DEFINITIVA Devo utilizzare dei metodi adeguati in base alle cellule che devo analizzare

per ottenere l'estratto grezzo. Dall'estratto grezzo devo poi eliminare tutti i frammenti

della membrana che non si sono rotti. Per eliminarli li centrifugo e ottengo il pellet

fatto con i residui, e il surnatante con le proteine di interesse e continuo a lavorare con

esso.

Le proteine devono mantenere sempre l'attività biologica!

TAMPONI DI ESTRAZIONE

Prima della lisi, le cellule vengono messe all'interno di un tampone fisiologico ad un

certo PH che contiene una certa concentrazione di sale. La sospensione cellulare viene

risospesa all'interno di uno di questi tamponi che devono avere un certo PH che è

quello fisiologico, tra 6 e 7.5 e contenere una certa concentrazione di sale fisiologica di

solito tra 150-200 mM. Quando si rompe la cellula e le proteine escono fuori dobbiamo

comunque mantenere le condizioni nelle quali si trovavano. E' importante mantenere il

PH corretto in quanto influisce sulla cariche delle proteine, se vengono messe ad un

PH uguale al loro punto isoelettrico le proteine non hanno carica. Anche la

concentrazione di sale è importante in quanto influenza la loro solubilità.

PRECIPITAZIONE FRAZIONATA:

Il processo di purificazione inizia con la purificazione primaria oppure chiamata anche

precipitazione frazionata: dove precipitazione significa rendere insolubili alcune

molecole che tendono poi a precipitare, mentre frazionata significa che non le faccio

precipitare tutte. E' un processo selettivo, nel quale vario la solubilità di alcune in

modo che ne precipitino altre. Questo dipende sempre dalle proprietà chimico fisiche

che ho davanti. Se vario il PH della soluzione, varia la solubilità di una fetta di

proteine.

Si lavora su 4 parametri: la concentrazione del sale, il PH, la temperatura o la polarità

del solvente. Lavorando su uno o più di questi parametri faccio precipitare ciò che non

mi interessa. Per allontanare il precipitato faccio la solita centrifugazione. La

precipitazione può essere reversibile e irreversibile! Ci sono delle tecniche che fanno sì

che la proteina precipita in modo irreversibile, ovvero quando la proteina finita nel

pellet non la recupero più. Se la proteina precipita invece in modo reversibile, la

proteina nel pellet la posso rinaturare togliendo l'agente che ha causato la sua

denaturizzazione.

PRECIPITAZIONE MEDIANTE UN SALE: la concentrazione di sale influenza la

solubilità delle proteine. Le proteine hanno degli amminoacidi carichi sulla superfice

che possono interagire con le molecole di sale, così si forma un guscio di solvatazione

che maschera le cariche di superficie della proteina. La presenza però di modeste

concentrazioni di sale. Se non ci fosse il sale le cariche di segno opposto delle proteine

si legherebbero e precipiterebbero.

SALTING IN: a basse concentrazioni di sale si ha un aumento della solubilità delle

proteine, il sale circonda le proteine ed evita che si formino aggregati proteici. Se

continuo ad aumentare la concentrazione del sale, il fenomeno opposto che accade è

chiamato SALTING OUT: nel quale ad alte concentrazioni la solubilità diminuisce

drasticamente fino a far precipitare le proteine. A seconda delle proprietà delle

proteine, il sale può influenzare positivamente o negativamente le proteine fino ad un

certo intervallo di concentrazione di sale in base alla densità di carica delle proteine.

Quindi nel SALTING IN: il sale influenza positivamente la solubilità delle proteine,

aumentando la concentrazione del sale aumenta la solubilità, fino ad un certo livello

perché poi diminuisce drasticamente e accade il SALTING OUT: fenomeno opposto,

sarebbe la quota di sale che fa precipitare le proteine.

Ciò che determina la quota di precipitazione dipende dalle proprietà chimico fisiche

delle proteine.

Le proteine che hanno una superficie idrofobica precipitano a basse concentrazione,

quelle che hanno una contrazione idrofila precipitano ad concentrazioni più elevate di

sale. Come mai si assiste al salting out? Abbiamo detto che esistono delle cariche

esposte sulle proteine che sono mascherate dal sale che è disciolto e impedisce alle

cariche vicine di interagire tra loro e precipitare, però sulla superficie delle proteine

esistono amminoacidi idrofobici, che cercano di sfuggire dalle molecole di H20 e

tendono a destabilizzare la struttura della proteina. Per ricoprire queste zone

idrofobiche, l'acqua forma dei reticoli cristallini attorno a queste strutture idrofobiche,

le molecole di acqua si mettono attorno ai residui idrofobici, la formazione di queste

strutture si chiama CLARATI, e termodinamicamente la proteina è stabile. Cosa

succede se aumento la concentrazione di sale? Il sale per sciogliersi ha bisogno di

molecole di H20,ma quando all'estratto continuo ad aggiungere sale, ad un certo

punto le molecole di acqua finiscono e le ultime che rimangono per far sciogliere il

sale sono quelle disposte attorno ai domini idrofobici, e mi rappresentano l'ultima

possibilità che il sale ha di prendere acqua. Esiste una sorta di competizione tra il sale

e la soluzione, che diventa talmente tanto che ruba le molecole di acqua dai clarati e

si liberano queste zone idrofobiche delle proteine. Queste zone sono parecchio

appiccicose che incontrano altre zone idrofobiche e interagiscono tra loro, formano

aggregati e precipitano.

La concentrazione a cui una proteina precipita dipende sempre dalle caratteristiche

chimico fisiche delle proteine. Conoscendole decido qual è la quantità di sale da

aggiungere all'estratto grezzo e far precipitare così le proteine che non mi interessano.

ALBUMINA E FIBRINOGENO: immaginiamo che queste due proteine siano entrambe

nell'estratto grezzo, hanno proprietà differenti e quindi posso decidere quale delle due

far precipitare. In questo modo, centrifugando la provetta ottengo la separazione delle

2 proteine. Prima era una soluzione eterogena, grazie alla precipitazione frazionata le

posso dividere. La precipitazione è sempre reversibile grazie alle giuste quantità di

sale, se tolgo il sale la proteina può rinaturare. Il solfato di ammonio è il sale che si

usa maggiormente in laboratorio per far precipitare le proteine.

Come si toglie il sale da un precipitato? Posso utilizzare il processo di DIALISI: si basa

sulla pressione osmotica e sulla differenza di variazione osmotica che vi è tra un

compartimento e l'altro. Esistono in commercio dei sacchetti, dei tubi di materiale

plastico aperti sia sopra che sotto. Questo materiale poroso ha dei pori che

permettono il passaggio delle molecole molto piccole del sale ma impediscono il

passaggio di molecole più grandi delle proteine. Se questo tubo lo chiudo alle due

estremità con all'interno il precipitato e lo butto in un tampone pulito di una soluzione

priva di sale, la pressione osmotica fa sì che il sale passi nel compartimento meno

concentrato e va in direzione esterna e si stabilisce un equilibrio.

Posso variare la solubilità delle proteine anche variando il PH della soluzione

dell'estratto grezzo. È una modalità meno usata e si chiama PRECIPITAZIONE AL

PUNTO ISOELTTRICO: le proteine hanno una certa carica e un punto isoelettrico,

ossia il valore di PH dove le proteine non hanno alcuna carica. Ma se la proteina non

ha carica non rimane in soluzione e non interagisce col sale. Quindi se conosco il

punto isoelettrico della proteina, porto il PH ad un certo livello in modo che le proteine

che non mi interessano precipitano, lavorando così a PH superiori o inferiori rispetto al

PH della proteina che mi interessa. Anche questa precipitazione è reversibile.

Un'altra precipitazione è PRECIPITAZIONE A TEMPERATURE ELEVATE. L'uovo ne è

un esempio, è una precipitazione irreversibile. Una volta che essa precipita per mezzo

del calore essa non può rinaturare. La proteina che voglio studiare non la farò

precipitare alla sua temperatura di precipitazione, ma farò precipitare a temperature

maggiori o minori della proteina di interesse e far precipitare tutte quelle che non mi

interessano.

PRECIPITAZIONE CON SOLVENTI ORGANICI: è una precipitazione reversibile. Non è

molto utilizzata. Si basa sulla diversa solubilità delle diverse proteine in soluzioni

acquose di solventi organici (soprattutto alcoli).

Il solvente abbassa la costante dielettrica (D) del mezzo, favorendo le interazioni

elettrostatiche proteina-proteina. La costante dielettrica dell'acqua ad esempio è

maggiore rispetto a quella dell'alcol (DH2O = 80; Dsolvente = 4.) Il processo è spesso

condotto a –20°C per evitare la denaturazione. La forza di attrazione tra molecole

diverse è uguale al prodotto di cariche di segno opposto delle proteine che si

attraggono fratto la costante dielettrica per raggio al quadrato-> Forza di attrazione =

e1 x e2/ D x r2. La costante dielettrica è inversamente proporzionale all'attrazione

delle cariche. Il solvente fa variare la costante dielettrica diminuendola e far

aumentare le interazioni elettrostatiche.

SPETTROFOTOMETRIA: Il passo successivo al frazionamento è procedere con la

purificazione in modo da ottenere la proteina che mi interessa. L'evento successivo

alla precipitazione frazionata