Biochimica applicata

Biochimica applicata

Tecniche di purificazione proteine: introduzione amminoacidi e proteine

Le proteine sono sostanze organiche, in generale le definiamo come polimeri diamminoacidi. Un amminoacido ha un centro chiamato carbonio alfa, che può fare quattro legami ed è impegnato con quattro gruppi differenti: il gruppo amminico, il gruppo carbossilico, un atomo di idrogeno e l'ultimo legame che può essere un idrogeno o qualsiasi altro gruppo chimico che dà specificità all'amminoacido. Questi sono i monomeri delle proteine e quindi più amminoacidi si legano insieme e danno origine alle proteine.

Gli amminoacidi possono esistere in due forme: forma ionica o zwitteronica e non ionica. La ionizzazione è dei due gruppi (amminico e carbossilico) e possono ionizzare a pH differenti. Il gruppo amminico può essere in forma dissociata o protonata. Il gruppo carbossilico anche lui può essere in forma dissociata, ed essendo un acido può perdere un H e trasformarsi nella forma protonata.

I 20 amminoacidi proteici che costituiscono le proteine sono classificati in base al gruppo R, se esso sia carico o non carico, alifatico o non alifatico, polare o non polare. Questo gruppo dà una proprietà differenti ai vari amminoacidi. Ci sono gli amminoacidi alifatici polari (gruppi alcolici o solfonici) non carichi che riescono a reagire con le molecole d'acqua. Ci sono quelli alifatici non polari. Ci sono quelli aromatici, in cui il gruppo R è formato da un anello aromatico. Ci sono quelli carichi che possono avere un radicale carico negativo o positivo. Di solito le proteine sono fatte da un buon mix di amminoacidi polari e non polari, carichi e non carichi. Se una proteina è fatta da 10 cariche positive e 11 negative, la proteina è carica negativamente. Quando invece in una proteina il numero delle cariche positive è uguale a quelle negative, allora la proteina sarà neutra.

Legame peptidico

Il legame peptidico è fatto tra il gruppo carbossile di un amminoacido e il gruppo amminico di un altro, è un legame covalente molto forte, con la perdita di una molecola di H₂O. Il gruppo OH del carbossile si stacca e anche l'H del gruppo amminico, staccandosi viene espulsa una molecola di H₂O. Vari amminoacidi formano i peptidi, oligopeptidi e sopra i 100 amminoacidi si parla di proteina.

La struttura tridimensionale delle proteine è molto complessa, per cui, per semplicità, si individuano quattro diversi livelli in ordine di complessità: struttura primaria, secondaria, terziaria e quaternaria. La proteina in generale ha una struttura non lineare e ciascuna di essa ha una funzione biologica che è garantita dalla sua tridimensionalità. Se la proteina è srotolata, denaturata quindi, perde anche la sua funzione biologica. Se vogliamo studiare la proprietà biologica di una proteina essa deve rimanere nel suo stato nativo, conformazionalmente compatto.

Purificazione di una proteina

La purificazione di una proteina consiste nell’estrarre una molecola di mio interesse dalla matrice biologica eterogena in cui si trova, quindi isolarla da una miscela eterogenea contenente altre proteine, o anche acidi nucleici, polisaccaridi o lipidi, riuscendo ad eliminare tutte le proteine che non sono di mio interesse per arrivare alla fine ad ottenere una soluzione pura della proteina che voglio studiare. Tolgo tutto ciò che non mi interessa, andando ad esclusione, fino a che non rimane la classe di quelle proteine che voglio studiare.

Schema purificazione enzima

• Estrazione grezzo: ottenere un estratto grezzo, che è un estratto totale delle proteine contenute nella matrice biologica.
• Precipitazione frazionata: elimino una grossa fetta di proteine che non mi interessano, esse così diminuiscono ma ciò che aumenta è l'attività dell'enzima, come se l'avessimo concentrato.
• Gel filtrazione
• Cromatografia di affinità

Quello che mi serve sapere per la purificazione di una proteina è la proprietà chimico-fisica della proteina che mi interessa: ciò che fa, che dimensioni ha, che pH ha, qual è la sua struttura (alfa o beta).

Estratto grezzo e localizzazione subcellulare

Dove le cerco le proteine? In una matrice biologica. I metodi utilizzati per ottenere l’estratto grezzo si differenziano in funzione della localizzazione subcellulare della proteina da purificare: quindi devo sapere se la proteina è extracellulare o intracellulare. Le proteine extracellulari (presenti nel plasma umano o secrete in un brodo di coltura batterico), vengono separate dall’eventuale materiale insolubile semplicemente per centrifugazione o filtrazione, in cui ottengo una parte al di sotto fatta da tutta la parte corpuscolare (frazione più pesante) e una parte superiore fatta dal plasma che è la parte liquida e più leggera. La parte sotto si chiama pellet, quella superiore surnatante. L'altra possibilità è la filtrazione, dove il filtro trattiene la parte corpuscolare e lascia passare la parte liquida.

Le proteine intracellulari (citoplasmatiche o quelle presenti negli organuli subcellulari) devono essere estratte con metodi che provocano la rottura delle cellule, ovvero la rottura della membrana delle cellule e liberare il contenuto delle cellule. Come si rompono le cellule? Con la lisi.

Lisi delle cellule

Lisare una cellula: esistono tanti metodi per lisare le cellule. Si dividono in due categorie: metodi non meccanici e metodi meccanici. I metodi non meccanici non prevedono nessuna strumentazione per far avvenire la lisi, mentre quelli meccanici serve una strumentazione meccanica. Ciascuno di questi metodi deve mantenere inalterata la struttura biologica della proteina. Se faccio bollire una cellula la rompo, ma denaturo anche la proteina. Tutti i metodi devono preservare l'attività biologica.

Metodi non meccanici

• A) Nel caso di cellule animali, sia la membrana plasmatica che il citoscheletro rappresentano strutture relativamente deboli. Lo shock osmotico o termico, seguito dalla solubilizzazione con detergenti (SDS o Triton X100) sono sufficienti per rompere le cellule. Questo metodo viene definito gentile, il quale utilizza detergenti, un sapone disgrega la membrana cellulare e butta fuori così il suo contenuto citoplasmatico.
• B) Le cellule vegetali sono caratterizzate dalla presenza della parete cellulare di cellulosa, e vengono prima trattate con miscele di pectinasi e cellulasi (enzimi digestivi che degradano pectina e cellulosa -> digestione enzimatica) seguita dagli stessi trattamenti del punto (A).
• C) Le cellule batteriche per la presenza della parete cellulare di peptidoglicano vengono prima trattate con lisozima (enzima digestivo che degrada il peptidoglicano) seguita dagli stessi trattamenti del punto (A).

Metodi meccanici

• Omogenizzazione (tessuti e cellule)
• Estrusione liquida (cellule)
• Utilizzo di sferette di vetro (cellule)
• Sonicazione (cellule)

Di solito si prediligono i metodi meccanici, ma tutti i metodi meccanici generano calore che denatura le proteine con perdita dell’attività biologica. Perciò è molto importante raffreddare per tutto il processo il campione (a circa 4°C) e condurre il metodo per periodi brevi.

Omogeneizzatori

In un omogeneizzatore a lame, la sua parete è mantenuta fredda in quanto le lame girano a velocità elevatissima e generano calore, e si potrebbe andare a denaturare le proteine. Omogeneizzatori a pestello sono manuali: il campione inserito nel cilindro di vetro, c'è un pestello, il campione viene schiacciato dal pestello. Dispositivi a estrusione liquida: uno stantuffo schiaccia la sospensione cellulare verso il basso ad elevate pressioni, in fondo al contenitore c'è una valvola che quando raggiunge la massima pressione viene aperta e la sospensione può uscire, la differenza di pressione che si è generata rompe le cellule. La French press riesce a rompere anche le cellule batteriche e quelle vegetali.

Altri metodi di lisi

Sferette di vetro: sfere delle stesse dimensioni delle cellule, qui quelle batteriche non vengono rotte, quindi si utilizza per le cellule eucariote. La sospensione viene messa nel contenitore, la provetta viene vorticata, le sferette si muovono e l'attrito che si forma rompe le membrane. Sonicatore: una sonda attaccata ad un generatore di onde ultrasoniche, la sonda viene immessa nella sospensione, è un metodo aggressivo, utilizzato per le cellule batteriche. Si genera un notevole surriscaldamento e occorre generare cicli on e off, le onde inoltre sono dannose per l'udito e l'operatore deve avere delle cuffie. In definitiva, devo utilizzare dei metodi adeguati in base alle cellule che devo analizzare per ottenere l'estratto grezzo. Dall'estratto grezzo devo poi eliminare tutti i frammenti della membrana che non si sono rotti. Per eliminarli li centrifugo e ottengo il pellet fatto con i residui, e il surnatante con le proteine di interesse e continuo a lavorare con esso. Le proteine devono mantenere sempre l'attività biologica!

Tamponi di estrazione

Prima della lisi, le cellule vengono messe all'interno di un tampone fisiologico ad un certo pH che contiene una certa concentrazione di sale. La sospensione cellulare viene risospesa all'interno di uno di questi tamponi che devono avere un certo pH che è quello fisiologico, tra 6 e 7.5, e contenere una certa concentrazione di sale fisiologica di solito tra 150-200 mM. Quando si rompe la cellula e le proteine escono fuori dobbiamo comunque mantenere le condizioni nelle quali si trovavano. È importante mantenere il pH corretto in quanto influisce sulla cariche delle proteine, se vengono messe ad un pH uguale al loro punto isoelettrico le proteine non hanno carica. Anche la concentrazione di sale è importante in quanto influenza la loro solubilità.

Precipitazione frazionata

Il processo di purificazione inizia con la purificazione primaria oppure chiamata anche precipitazione frazionata: dove precipitazione significa rendere insolubili alcune molecole che tendono poi a precipitare, mentre frazionata significa che non le faccio precipitare tutte. È un processo selettivo, nel quale vario la solubilità di alcune in modo che ne precipitino altre. Questo dipende sempre dalle proprietà chimico-fisiche che ho davanti. Se vario il pH della soluzione, varia la solubilità di una fetta di proteine. Si lavora su quattro parametri: la concentrazione del sale, il pH, la temperatura o la polarità del solvente. Lavorando su uno o più di questi parametri faccio precipitare ciò che non mi interessa. Per allontanare il precipitato faccio la solita centrifugazione. La precipitazione può essere reversibile e irreversibile! Ci sono delle tecniche che fanno sì che la proteina precipiti in modo irreversibile, ovvero quando la proteina finita nel pellet non la recupero più. Se la proteina precipita invece in modo reversibile, la proteina nel pellet la posso rinaturare togliendo l'agente che ha causato la sua denaturizzazione.

Precipitazione mediante un sale

La concentrazione di sale influenza la solubilità delle proteine. Le proteine hanno degli amminoacidi carichi sulla superficie che possono interagire con le molecole di sale, così si forma un guscio di solvatazione che maschera le cariche di superficie della proteina. La presenza però di modeste concentrazioni di sale. Se non ci fosse il sale le cariche di segno opposto delle proteine si legherebbero e precipiterebbero.

Salting in: a basse concentrazioni di sale si ha un aumento della solubilità delle proteine, il sale circonda le proteine ed evita che si formino aggregati proteici. Se continuo ad aumentare la concentrazione del sale, il fenomeno opposto che accade è chiamato salting out: nel quale ad alte concentrazioni la solubilità diminuisce drammaticamente fino a far precipitare le proteine. A seconda delle proprietà delle proteine, il sale può influenzare positivamente o negativamente le proteine fino ad un certo intervallo di concentrazione di sale in base alla densità di carica delle proteine.

Quindi nel salting in: il sale influenza positivamente la solubilità delle proteine, aumentando la concentrazione del sale aumenta la solubilità, fino ad un certo livello perché poi diminuisce drasticamente e accade il salting out: fenomeno opposto, sarebbe la quota di sale che fa precipitare le proteine. Ciò che determina la quota di precipitazione dipende dalle proprietà chimico-fisiche delle proteine. Le proteine che hanno una superficie idrofobica precipitano a basse concentrazioni, quelle che hanno una contrazione idrofila precipitano ad alte concentrazioni di sale. Come mai si assiste al salting out? Abbiamo detto che esistono delle cariche esposte sulle proteine che sono mascherate dal sale che è disciolto e impedisce alle cariche vicine di interagire tra loro e precipitare, però sulla superficie delle proteine esistono amminoacidi idrofobici, che cercano di sfuggire dalle molecole di H₂O e tendono a destabilizzare la struttura della proteina. Per ricoprire queste zone idrofobiche, l'acqua forma dei reticoli cristallini attorno a queste strutture idrofobiche, le molecole di acqua si mettono attorno ai residui idrofobici, la formazione di queste strutture si chiama clarati, e termodinamicamente la proteina è stabile.

Cosa succede se aumento la concentrazione di sale? Il sale per sciogliersi ha bisogno di molecole di H₂O, ma quando all'estratto continuo ad aggiungere sale, ad un certo punto le molecole di acqua finiscono e le ultime che rimangono per far sciogliere il sale sono quelle disposte attorno ai domini idrofobici, e mi rappresentano l'ultima possibilità che il sale ha di prendere acqua. Esiste una sorta di competizione tra il sale e la soluzione, che diventa talmente tanto che ruba le molecole di acqua dai clarati e si liberano queste zone idrofobiche delle proteine. Queste zone sono parecchio appiccicose che incontrano altre zone idrofobiche e interagiscono tra loro, formano aggregati e precipitano. La concentrazione a cui una proteina precipita dipende sempre dalle caratteristiche chimico-fisiche delle proteine. Conoscendole decido qual è la quantità di sale da aggiungere all'estratto grezzo e far precipitare così le proteine che non mi interessano.

Albumina e fibrinogeno: immaginiamo che queste due proteine siano entrambe nell'estratto grezzo, hanno proprietà differenti e quindi posso decidere quale delle due far precipitare. In questo modo, centrifugando la provetta ottengo la separazione delle due proteine. Prima era una soluzione eterogena, grazie alla precipitazione frazionata le posso dividere. La precipitazione è sempre reversibile grazie alle giuste quantità di sale, se tolgo il sale la proteina può rinaturare. Il solfato di ammonio è il sale che si usa maggiormente in laboratorio per far precipitare le proteine.

Dialisi

Come si toglie il sale da un precipitato? Posso utilizzare il processo di dialisi: si basa sulla pressione osmotica e sulla differenza di variazione osmotica che vi è tra un compartimento e l'altro. Esistono in commercio dei sacchetti, dei tubi di materiale plastico aperti sia sopra che sotto. Questo materiale poroso ha dei pori che permettono il passaggio delle molecole molto piccole del sale ma impediscono il passaggio di molecole più grandi delle proteine. Se questo tubo lo chiudo alle due estremità con all'interno il precipitato e lo butto in un tampone pulito di una soluzione priva di sale, la pressione osmotica fa sì che il sale passi nel compartimento meno concentrato e va in direzione esterna e si stabilisce un equilibrio.

Posso variare la solubilità delle proteine anche variando il pH della soluzione dell'estratto grezzo. È una modalità meno usata e si chiama precipitazione al punto isoelettrico: le proteine hanno una certa carica e un punto isoelettrico, ossia il valore di pH dove le proteine non hanno alcuna carica. Ma se la proteina non ha carica non rimane in soluzione e non interagisce col sale. Quindi se conosco il punto isoelettrico della proteina, porto il pH ad un certo livello in modo che le proteine che non mi interessano precipitano, lavorando così a pH superiori o inferiori rispetto al pH della proteina che mi interessa. Anche questa precipitazione è reversibile.

Precipitazione a temperature elevate

L'uovo ne è un esempio, è una precipitazione irreversibile. Una volta che essa precipita per mezzo del calore essa non può rinaturare. La proteina che voglio studiare non la farò precipitare alla sua temperatura di precipitazione, ma farò precipitare a temperature maggiori o minori della proteina di interesse e far precipitare tutte quelle che non mi interessano.

Precipitazione con solventi organici

È una precipitazione reversibile. Non è molto utilizzata. Si basa sulla diversa solubilità delle diverse proteine in soluzioni acquose di solventi organici (soprattutto alcoli). Il solvente abbassa la costante dielettrica (D) del mezzo, favorendo le interazioni elettrostatiche proteina-proteina. La costante dielettrica dell'acqua ad esempio è maggiore rispetto a quella dell'alcol (DH₂O = 80; D_solvente = 4). Il processo è spesso condotto a –20°C per evitare la denaturazione. La forza di attrazione tra molecole diverse è uguale al prodotto di cariche di segno opposto delle proteine che si attraggono fratto la costante dielettrica per raggio al quadrato -> Forza di attrazione = e1 x e2/ D x r². La costante dielettrica è inversamente proporzionale all'attrazione delle cariche. Il solvente fa variare la costante dielettrica diminuendola e far aumentare le interazioni elettrostatiche.

Spettrofotometria

Il passo successivo al frazionamento è procedere con la purificazione in modo da ottenere la proteina che mi interessa. L'evento successivo alla precipitazione frazionata...