Biochimica applicata

CROMATOGRAFIA:

SIAMO SEMPRE NELL'AMBITO DELLA PURIFICAZIONE DELLE PROTEINE. La

cromatografia è lo step successivo quello che ci permette di ottenere una proteina

pura. È una tecnica largamente utilizzata. Ce ne sono di vari tipi ma il principio

generale vale per tutte le cromatografie. In generale la cromatografia è una tecnica di

separazione basata sulla differente ripartizione tra due fasi immiscibili delle molecole

che si vogliono separare. In ogni tecnica cromatografica esistono due fasi immiscibili

tra loro: una fase stazionaria, che può essere solida o liquida, e una fase mobile che

può essere liquida o gassosa che fluisce in continuo attraverso la fase stazionaria, le

due fasi sono sempre unite tra di loro, immiscibili ma sono una in presenza dell'altra.

Nella cromatografia per la separazione di proteine si impiega sempre una

cromatografia su colonna, dove la fase stazionaria è immobilizzata su un supporto

inerte ed insolubile ‘impaccato’ dentro una colonna di vetro, plastica o metallo. La fase

mobile fluisce in continuo attraverso la fase stazionaria.

1) Il campione è introdotto nella fase mobile (eluente);

2) La fase mobile viene fatta eluire in continuo attraverso la fase stazionaria

impaccata all’interno di una colonna cromatografica;

3) Lo spostamento degli analiti lungo la colonna è dovuto all’azione dinamica della

fase mobile;

4) La fase mobile e la fase stazionaria sono scelte in modo che i componenti della

miscela da separare si distribuiscano tra le due fasi: i componenti più affini alla fase

stazionaria passeranno più tempo in questa fase, quindi si sposteranno più

lentamente attraverso il sistema i componenti più affini alla fase mobile si

sposteranno invece più velocemente . Nell'ideale le molecole devono essere un po'

affini a entrambe le fasi altrimenti se fosse completamente affine alla fase

stazionaria, resterebbe dentro il tubo.

La separazione dei componenti avviene in quanto ogni sostanza ha una distribuzione

caratteristica tra le due fasi immiscibili (coefficiente di ripartizione)

Kr = (concentrazione nella fase stazionaria) / (concentrazione nella fase mobile)

ed è il rapporto tra la concentrazione della sostanza della fase stazionaria, fratto la

concentrazione della sostanza nella fase mobile. Posto che la molecola da separare è

affine sia all'una che all'altra fase. Se il coefficiente di ripartizione fosse uguale a 1

significherebbe che abbiamo un uguale concentrazione della sostanza sia nella fase

mobile che nella stazionaria. Se il coefficiente di ripartizione è maggiore di 1 la

concentrazione della sostanza è più affine alla fase stazionaria, e analogamente se

fosse minore di 1 la sostanza è più affine per la fase mobile. Se è affine in

concentrazioni diverse eluiscono dalla colonna in tempi diversi. Il campione formato da

due molecole (A+B) scende per gravità, al tempo zero le 2 molecole sono ancora

unite, coesistono, al tempo 1 la fase mobile trascina verso il basso i campioni e A è già

separata da B, in quanto A è più affine per la mobile e B verrà più trattenuto. Al tempo

due A e B sono molto più separate, al tempo 3 avviene la ELUIZIONE, dove la molecola

A sta eluendo prima e poi in tempo differente al tempo 4 eluisce poi la molecola B. Al

che la proteina può essere rivelata: LO SPETTOFOTOMETRO può rivelare la proteina, in

quanto sul fondo c'è un rivelatore che è sempre uno spettrofotometro. Un raggio

registra costantemente la presenza di proteine se le proteine stanno eluendo. Il

CROMATOGRAMMA: è quello che viene disegnato mettendo in ordinata il segnale dello

spettrofotometro (assorbanza) e in ascissa il tempo o il volume.

TEMPO DI RITENZIONE: il tempo che ci mette una molecola ad uscire dalla colonna,

a eluire quindi.

Tm: rappresenta il tempo morto, se il tempo di ritenzione è il tempo che la molecola

impiega ad uscire, il tempo morto è una molecola che non ha subito il processo

cromatografico, perché non ha affinità per la fase stazionaria, escono praticamente

subito in quanto non viene frenata nella colonna. Le molecole che escono nel tempo

morto non hanno subito cromatografia, non si sono separate quindi non purificate e

vengono scartate. Normalmente si sa qual è il suo tempo morto di ogni colonna in

base alla sua lunghezza e volume.

PIATTI TEORICI: immaginiamo la colonna fatta da sottili fette che si chiamano piatti

teorici, essi sono lo spazio più piccolo nel quale la molecola stabilisce un equilibrio tra

la fase mobile e la stazionaria. In ciascuno di questi piatti la molecola interagisce un

po' con la fase mobile e un po' con quella stazionaria. Continue interazioni tra le due

fasi per tutta la colonna in queste piccole regioni, una proteina che si sta separando

stabilisce numerosissime interazioni all'interno di questi piatti e nel frattempo scende.

Numero di piatti teorici: numero di equilibramento che la molecola stabilisce tra le 2

fasi. Il numero di piatti teorici è in funzione dell'efficienza del processo cromatografico.

RISOLUZIONE: La risoluzione è la capacità del sistema cromatografico di eluire

sostanze in tempi diversi. È la differenza tra i tempi di ritenzione al numeratore, fratto

a larghezza della base dei picchi. Se la larghezza dei due picchi è uguale, ne

deduciamo che più alta è la differenza tra i tempi di ritenzione A e B maggiore sarà la

risoluzione. La risoluzione dipende: dalla selettività, capacità e efficienza. La

selettività: è la capacità del sistema di eluire le sostanze a due velocità differenti

quindi in tempi sufficientemente diversi, quindi se si sovrappongono la selettività è

bassa.

La capacità del sistema: misura il tempo che un composto impiega ad attraversare la

colonna. È uguale al tempo di ritenzione di una sostanza meno il tempo morto, fratto il

tempo morto. Una buona capacità deve essere compresa tra 1 e 5. il tempo di

ritenzione è il tempo con il quale una molecola esce ed è sempre maggiore al tempo

morto e ha una buona capacità se il tempo di ritenzione almeno il doppio del tempo

morto. Tanto più vicino il tempo di ritenzione è vicino al tempo morto minore il sistema

ha una capacità pessima. L'efficienza: tanto più i picchi sono stretti tanto più è

efficiente la colonna. È la capacità del sistema di eluire una molecola nel tempo più

breve possibile.

Le interazioni tra l'analita e la fase stazionaria deve essere sempre di natura

reversibile. Le interazioni sono: legami H, interazioni elettrostatiche, dipolo-dipolo,

dipolo-dipolo indotto, forze di VDW, statiche.

MECCANISMI DELLA SEPARAZIONE: possiamo suddividere i meccanismi di

separazione impiegati in cromatografia in:

RIPARTIZIONE: in realtà esiste in 2 fasi liquide non miscibili tra loro (acqua e alcool). La

fase stazionaria e fase mobile sono entrambe liquide e la molecola ripartisce tra le 2

fasi.

ADSORBIMENTO: c'è il solido (superficie di supporto) che trattiene una sostanza senza

penetrazione come nell'assorbimento. La fase stazionaria è sempre solida, quella

mobile è liquida o gassosa.

SCAMBIO IONICO: la fase stazionaria è costituita da un polimero inerte che porta legati

dei gruppi ionizzabili, dei siti ionizzabili, dove i contro ioni sono molecole di segno

opposto alla fase stazionaria che appartengono alla fase mobile. Essi sono ioni di

segno opposto che agiscono con la fase stazionaria

ESCLUSIONE DIMENSIONALE: la fase stazionaria è sempre un solido, fatta da della

sfere bucate al loro interno, la fase mobile interagisce con la fase stazionaria entrando

nei fori o può passare tra le sfere tra gli spazi interstiziali senza interagire con la fase

stazionaria ed uscirà nel tempo morto.

AFFINITA': fase stazionaria porta legato un gruppo funzionale che viene riconosciuto

dalla molecola che voglio separare.

DIFFERENTI TIPI DI CROMATOGRAFIA:

ABBIAMO DETTO CHE ESISTONO DIFFERENTI TIPI DI CROMATOGRAFIE:

-Cromatografia per adborbimento

-Cromatografia di ripartizione: la fase stazionaria è un liquido, e la fase mobile idem.

La fase stazionaria liquida sta su un supporto inerte solido (carta trattiene un 5% di

acqua). La fase mobile deve essere immiscibile con una polarità differente della fase

stazionaria.

-Cromatografia di esclusione: o gel filtrazione.

-Cromatografia a scambio ionico

-Cromatografia di affinità isocratica:

Le cromatografie si distinguono in la fase mobile durante tutto il processo

cromatografico non cambia. La composizione chimica della fase mobile rimane

invariata per tutto il processo cromatografico

a gradiente,

Esistono anche le cromatografie quando la fase mobile cambia in

composizione chimica durante il processo cromatografico. In questa cromatografia ci

binding,

sono almeno 2 tipi di fase mobile: la prima chiamata fase di la seconda

elution. La prima è la fase che permette alle molecole di soluto di interagire con la

fase stazionaria, la seconda la composizione chimica della fase mobile cambia e si

annulla l'interazione tra soluto e la fase stazionaria.

CROMATOGRAFIA AD ESCLUSIONE: isocratica, sono sempre cromatografie fatte su

colonna che contiene una fase mobile che è liquida in questo caso e una fase

stazionaria che è sempre solida. La fase stazionaria sono delle sfere una attaccata

all'altra con una superficie increspata, come un gomitolo di lana ha che degli spazi al

suo interno che permettono il passaggio e sono permeate dalla fase mobile. Si chiama

gel filtrazione perché queste sferette di materiale inerte viene venduto come polvere

bianca, e se idratata, quindi a contatto con la fase mobile di rigonfiano. Le

increspature sono punti di ingresso per la fase mobile che scorre sia all'esterno della

sferetta che all'interno. La fase stazionaria è un polisaccaride insolubile, quindi

zuccheri. Come fa un polisaccaride a diventare sferico?

molecole di Si di un

polisaccaride lineare che attraverso un trattamento chimico questa lunga catena viene

arrotolata su sé stessa e si forma una sfera, assolutamente permeabile alla fase

Per cosa la usiamo questa

mobile. I pori non sono regolari ma di dimensioni variabili.

cromatografia? Quando dobbiamo separare molecole in base al loro peso molecolare,

quindi in base alla differenza del loro peso molecolare. La fase mobile entra nella

colonna e permea la fase stazionaria. Esistono quindi 2 spazi: quello interstiziale (tra

una sfera e l'altra) e poi c'è un volume che occupa l'interno delle sfere. Una molecola

che occupa lo spazio interstiziale non ha alcun contatto con la fase staz