Biochimica applicata

CROMATOGRAFIA AD ESCLUSIONE MOLECOLARE

Sfrutta il principio in base al quale le molecole ad elevato PM hanno una maggiore velocità di eluizione perché non si perdono nelle sfere (che sono la FS) e dunque vengono eluite prima di proteine piccole che si intercalano nelle sfere. È utilizzata per:

• purificazione di enzimi, proteine, ormoni ecc
• determinazione della massa relativa di una proteina (tramite inserimento di proteine a PM noto posso costruire una retta di taratura e determinare se ha PM maggiore o minore della nostra proteina nota in base al tempo di eluizione)
• conoscenza meccanismo d'azione (valutare ad esempio se è una proteina monomerica o dimerica e in tal caso vedrò che ci mette il doppio del tempo)
• concentrare la soluzione (raccolgo la proteina in un volume di solvente più piccolo)
• dissalazione (per allontanare il solfato d'ammonio infatti questo ha PM più basso e verrà eluito per ultimo rispetto alle proteine)

proteine).

CROMATOGRAFIA AD INTERAZIONE IDROFOBICA

Sfrutta la capacità di AA idrofobici di interagire con una FS apolare; successivamente si aggiunge una FM via via meno polare così da consentire il rilascio dapprima degli AA meno idrofobici e infine di quelli più idrofobici che quindi avranno fatto più legami con la FS e saranno più saldamente legati (come prima nello scambio ionico).

Le interazioni idrofobiche infatti, tramite residui apolari, danno vita a forze di Van Der Waals che sommate tra loro possono essere anche molto stabili ma che di per sé sono interazioni molto deboli.

CROMATOGRAFIA AD AFFINITÀ

Sfrutta le interazioni specifiche tra FS e particolare proteina. Un esempio è lo studio della glicogeno fosforilasi che si assocerà al glucosio (adeso alla FS). Questo dava però un problema di ingombro sterico (l'enzima per agirà deve arrivare facilmente al suo substrato e la matrice impediva ciò).

facendo da ingombro sterico). Allora si decise di distanziare il glucosio dalla matrice con una catena carboniosa di 4 atomi e si vide che l'interazione con l'enzima era facilitata. Allora si provò con una catena di 8 atomi e si vide che il complesso enzima-glucosio era talmente stabile che non si riusciva più a staccarli per competizione con una FM e dunque capirono che ciò avveniva perché l'enzima dava un ulteriore legame di tipo idrofobico con lo spaziatore ad 8 atomi di carbonio e così nacque la cromatografia ad interazione idrofobica. Abbiamo definito la cromatografia di affinità come metodo che garantisce il più alto grado di purificazione (infatti è usata alla fine di solito). Usata per la prima volta nel 1910 per misurare l'amilasi usando l'amido come ligando nella FS. Nel 1967 si usa una matrice polisaccaridica (agarosio o destrosio) attivata con bromuro di cianogeno (CNBr) e associata con un ligando checi interagiva grazie alla presenza di un gruppo amminicoprimario. Nel 1972 fu introdotto il SEPHAROSE 4B (matrice di agarosio). Stocchi la sfruttò per associarvi la glucosammina (con gr. Amminico 1° che quindi si legava alla matrice) che presentava il glucosio che è il substrato dell’esochinasi che dunque poteva associarvisi selettivamente. Si ottiene così una purificazione che va da 1000 a 300000 volte. Si ottiene una PURIFICAZIONE all’OMOGENITA’. Ricordiamo che l’agarosio è un polimero fatto da galattosio e galattosio anidro che produce un materiale gelatinoso che è caratterizzato da regolarità di porosità. Quindi lo schema è matrice + ligando (che formano la FS) a cui si legherà la proteina di interesse. Dunque, la matrice deve: - avere gruppi chimici adatti e in numero sufficiente per legare covalentemente il ligando (glucosio) - essere stabile al legame con la macromolecola sua successiva eluizione (per

evitare che la FM interagisca e modifichi la matrice)- non deve dare interazioni con altre molecole (deve essere inerte)- buone proprietà di flusso (essere compatta senza creare percorsipreferenziali, dunque particelle uniformi nella porosità).

Il ligando deve- esibire una affinità di legame specifica e reversibile- avere gruppi modificabili chimicamente per venire legato alla matricesenza alterare la sua capacità di legare la proteina (il glucosio devepoter legame il gr. Amminico diventando glucosammina che interagiscecomunque con l’esochinasi).

N.B. ricorda il problema sterico che si verificava: glucosammina può associarsiall’esochinasi solo se c’è un distanziatore formato da una catena carboniosase no ci sono fenomeni di ingombro sterico per l’attacco dell’enzima dovuti dallapresenza della matrice e all’alto impacchettamento della glucosammina.

Quindi una volta che si è associato il ligando alla

matrice e che c'è stata interazione tra ligando e proteina dobbiamo effettuare l'eluizione della proteina di interesse e avremo 3 modi per farlo: 1) Si adopera un TAMPONE DEFORMANTE (cambio della FM) che incida in maniera definitiva sulla struttura della proteina così che perda l'affinità con il ligando e si distacchi da esso; una volta eluita si riporta in un tampone ottimale così che ristabilisca la propria struttura originaria. 2) Si sfrutta la COMPETIZIONE TRA LIGANDI: si fa passare in colonna un ligando rispetto al quale la proteina di interesse abbia una affinità maggiore del ligando a cui è legata così che si distacchi da esso, si leghia questo secondo ligando e venga eluita così. 3) Si sfrutta la COMPETIZIONE TRA PROTEINE: si fa passare in colonna una proteina che sia più affine al ligando legato alla matrice della mia proteina di interesse la quale si staccherà e verrà così eluita. Quindiassociano proteine leganti al DNA- metalli che si legano a proteine metallo-leganti- ligandi sintetici che si legano a proteine specifiche

associano acidi nucleici- LECTINE cui si associano GLICOCONIUGATI

Vediamo alcuni esempi:

• PURIFICARE ACIDI NUCLEICI: si possono riconoscere mRNA che hanno coda poli-adeninica (AAAA) se nella matrice abbiamo come ligando una coda poli-timidinica (TTTT) sfruttando l'interazione tra basi complementari. Si può usare anche l'interazione con gli istoni per il DNA.
• come legando può essere usato anche un METALLO e garantisce selettività nei confronti di molte molecole (interferone, albumina, ribonucleasi) per interagire con i gruppi IMIDAZOLICI dell'istidina, quelli TIOLICI della cisteina o quelli INDOLICI del triptofano.
• si possono usare anche gli anticorpi monoclonali marcati con un elemento paramagnetico che poi saranno riconosciuti con una calamita e porterà con sé l'antigene cui si è legato.
• SELEZIONARE POPOLAZIONI CELLULARI: immaginiamo di avere cellule che legano una glicoproteina di membrana e altre no. Queste si legano con le LECTINE.

Se pongo in FS come ligando un anticorpo per le lectine (antilectina) quest'ultime saranno fermate e con loro le cellule con le glicoproteine cui sono attaccate; poi per l'eluizione utilizzo uno zucchero competitivo che si lega alla lectina così che la cellula sia rilasciata. Le LECTINE sono proteine prodotte da animali, piante e muffe che legano carboidrati (glicoproteine). Sono utili nella purificazione di recettori proteici di membrana. Il loro utilizzo può essere condotto in presenza di un sale (quindi è ottimo se prima ho fatto il salting in/out col solfato d'ammonio). A questo punto possiamo procedere con lo studio della proteina. Si effettua con metodica precisa: 1) Scelta tessuto: quello che esprima la massima quantità di proteina incognita 2) Omogenazione: si fa l'omogenizzato della cellula tenendo conto delle condizioni che possono denaturare la proteina (aggiungo potere riducente per esempio) 3) Purificazione: insieme di pratiche cheabbiamo visto per ottenere solo la proteina di interesse: Studio proteina strutturale: Se è costituita da più catene, queste devono essere prima separate. Si effettua riduzione e carbossi-metilazione dei ponti disolfuro se presenti. Una aliquota di proteina è usata per studiare gli AA N e C-terminali, un'altra per studiare la composizione, cioè il numero di AA e quali sono, senza però saperne la posizione (si usa idrolisi, derivatizzazione e separazione). L'ultima aliquota è usata per lo studio della sequenza di AA (si sfrutta la frammentazione differenziata, cioè si effettuano più metodi di frammentazione differenti, in modo da poter effettuare poi un ri-allineamento e tornare alla corretta sequenza di AA quando vado a ricomporre la proteina). A) Neutralizzo i ponti disolfuro con urea e mercaptoetanolo (ora la struttura è lineare perché ho rotto i -S-S-) e poi aggiungo iodio-acetato che interagisce con gli -SH.in modo che siano stabili e di non riformare più–S-S-. Vengono aggiunti sotto forma di sali che sono rimossi in HPLCB) Effettua una serie di reazioni sfruttando la reattività dei gruppi ammidici,carbossilici e gr. R dei vari AA così da identificare la sequenza degli AA. Adesempio posso ridurre COOH del C-terminale con litio alluminio (LiAlH4) adalcol che sarà quindi facilmente visualizzabile.Quindi agisco direttamente al C-terminale:uso delle carbossi-peptidasi (esopeptidasi che staccano AA dal c-terminale),ce ne sono 3 isoforme:- la A stacca facilmente AA alifatici e aromatici ma si blocca su LISINA eARGININA- la B stacca velocemente LISINA e ARGININA ma si blocca con AA neutri- la C e la gamma rimuovono tuttoSi ottiene così una curva di rilascio molto complessa che