Biochimica applicata

Biochimica applicata

Negli ultimi anni le proteine hanno acquistato sempre più importanza. Dal progetto Genoma Umano grazie al quale l’intero genoma è stato sequenziato, si è scoperta una discrepanza tra il numero di geni (circa 40mila) e quello delle proteine (tra 100 mila e 1 milione). Questo fenomeno si spiega con le modificazioni post-traduzionali e le interazioni intermolecolari. Si parla quindi di proteomica.

Ricordiamo che molte proteine sono enzimi che sono in grado di catalizzare reazioni termodinamicamente favorevoli e renderle compatibili con i tempi biologici. Si parla dunque di metabolomica.

Dosaggio enzimatico

Vedremo come i metodi di dosaggio enzimatico saranno fondamentali nel diagnosticare eventuali enzimopatie e tramite queste si possa intervenire prima che avvengano condizioni patologiche (es. nell’infarto si ha liberazione di troponina-I e se noi somministriamo un anticorpo che la riconosca possiamo prevedere l’infarto).

Studio delle proteine

Studiare una proteina significa individuarne la struttura primaria cioè conoscere l’esatta sequenza di AA dal N terminale al C terminale con metodi di sequenziamento (si lavora poi in HPLC). La composizione di AA ci dirà quali sono ma non come sono legati l’uno con l’altro e la loro posizione (16 alanine, 13 triptofani ecc..).

Per conoscere la composizione di AA si effettua: idrolisi, derivatizzazione e separazione. L’idrolisi richiederà del tempo in quanto il legame peptidico è alla base della vita proprio perché è molto stabile e servirà HCl 6N a 110° per 48h. Occorre poi derivatizzare, ossia addizionare delle molecole in modo da avere diverso spettro d’assorbimento dei composti che si sono formati (molecola + AA). Infine si avrà la scomposizione in HPLC di affinità e si valuta ad esempio la capacità di formare ponti disolfuro e in quel caso avremo cisteine.

Il taglio di una proteina è effettuato con distacco di 50-60 AA per volta dal N terminale, ma risultano ancora unità troppo complesse e dunque si effettua frammentazione con enzimi proteolitici (pepsina, tripsina) così che poi dai frammenti più corti si possa fare il sequenziamento.

N.B. quando formiamo la proteina a partire dai frammenti devo seguire la corretta sequenza e allora effettuerò tagli a più livelli su due proteine uguali di modo da fare combaciare perfettamente i pezzi.

Proteomica

Definiamo proteoma come “rappresentazione qualitativa e quantitativa dell’intero pattern di espressione proteica della cellula, organismo o fluido corporeo in condizioni esattamente definite e controllate”.

È importante considerare le condizioni perché queste influenzano la natura e l’espressione delle proteine: basti pensare alla loro suscettibilità a temperatura e pH. La proteomica e lo studio delle proteine determinano importanti implicazioni in campi terapeutico e diagnostico!

Dobbiamo evidenziare che genoma e proteoma non abbiano una diretta correlazione. Mentre il genoma è costante e identico per tutte le cellule di un organismo, il proteoma è dinamico nel tempo e in risposta a fattori esterni (come le chaperonine che sono espresse con innalzamento della temperatura). Dunque differisce in maniera sostanziale tra i diversi citotipi (glucosio-6-P fosfatasi non è espressa nel muscolo anche se il suo gene è presente).

Il proteoma è il complemento tempo e cellulo-specifico del genoma, cioè è la risultante delle proteine espresse in quella cellula, in quel momento e in quella particolare condizione fisio-patologica. Si valutano così tutte le proteine, incluse le isoforme e le risultanti modifiche post-traduzionali (acetilazione, metilazione, fosforilazione, nitrazione e clivaggio cioè taglio come per pepsinogeno che diventa pepsina se tagliato).

Ecco dunque che alla fine dei 40mila geni arrivo a 1 milione di proteine.

Strategia della proteomica

• Individuare pattern proteico così da confrontare soggetto sano e malato
• Descrivere la struttura 3D per conoscere eventuali siti d’azione per i farmaci

La proteomica è divisa in strutturale (o classica) e funzionale.

La strutturale dà una definizione quali-quantitativa dell’aumento o diminuzione dell’espressione in diverse condizioni cellulari (valuteremo la presenza di macchie cioè proteine e la loro intensità di colore così da capire le diverse condizioni cellulari anche patologiche che ne alterano l’espressione).

La funzionale consente di comprendere la funzione biologica e l’associazione proteica (proteina-proteina) in vivo che porta al riconoscimento del meccanismo cellulare. La proteomica strutturale studia il proteoma completo mentre la funzionale studia gruppi più limitati di proteine.

Approccio classico o strutturale

1. Solubilizzazione del campione: si svuota la cellula del suo contenuto e lo si porta in soluzione.
2. Isoelettrofocalizzazione: si ha separazione per carica. Migrazione di molecole cariche in un campo elettrico in cui si dispone un gel tra anodo e catodo e in cui c’è un gradiente di pH (dato dagli acidi poliammino-policarbossilici). Se le proteine sono in un pH al di sotto del loro PI (punto isoelettrico) saranno protonate e andranno al catodo, se sono ad un pH al di sopra del PI andranno verso l’anodo. Nel loro viaggio verso l’anodo/catodo arriveranno ad un pH che è il loro PI dove saranno neutre come carica e quindi non si muoveranno più. Così le ho divise per carica.
3. SDS-PAGE: si ha separazione per PM. Si utilizza un detergente anionico (SDS sodio-dodecil-solfato) che avvolge le proteine di cariche negative annullando così la carica intrinseca di ogni proteina proveniente dai gruppi R. Ora le proteine cariche negativamente migreranno verso l’anodo e lo faranno attraversando un gel poroso (PAGE poli-acriammide-gel-elettroforesi) e quelle con PM più basso lo attraverseranno più velocemente. Il gel è formato per polimerizzazione di un liquido tra due lastre e costituito da legami crociati che ne conferiscono caratteristiche intermedie tra solido e liquido.

Quindi avremo una prima separazione per il PI e poi le varie proteine sono separate per PM. Successivamente si utilizza un colorante che si lega alla trama del gel e alle proteine, una successiva decolorazione farà sì che il colorante resti attaccato alle sole proteine. Questo metodo si chiama elettroforesi bidimensionale ed è il metodo più efficace per separare le proteine. La riproducibilità del pattern proteico e il confronto con dati computerizzati ne dimostrano l'affidabilità di questa procedura. Sarà dunque possibile confrontare proteoma di un soggetto sano con quello di uno malato o di uno in cura con un determinato farmaco.

Approccio funzionale

L’approccio funzionale prevede l’utilizzo di una esca che interagisca con la proteina in esame (dopo che sia stata purificata). Si immerge la proteina legata ad un marker (glutatione-s-transferasi) nel contesto cellulare solubilizzato e si attende che la proteina interagisca con il proprio target. Sottopongo il tutto alla cromatografia di affinità e fermo il marker e così blocco anche la proteina in esame con il suo target legatovi, poi separo il marker e analizzo il substrato al quale si è legata la proteina. Tale tecnica è detta fishing for partner.

Ad ogni modo prima di determinare la struttura 1°, 2° o 3° e la sua funzionalità è essenziale effettuare la purificazione della proteina. Si sceglie un metodo basandosi su criteri:

• Risoluzione e capacità: il miglior potere di separazione (risoluzione) e la dose maggiore che si può separare (capacità). Esistono metodo molto risolutivi ma poco capaci (discriminano benissimo tra poche proteine) e viceversa (discriminano tra molte sostanze ma non al massimo della purezza).
• Proprietà fisiche del composto.
• Stabilità del composto: lavoro sulla proteina ma senza modificarne la stabilità.
• Visione bibliografia.
• Esperienza costi e procedura.

Identificata la proteina si sceglie il tessuto da cui prelevarla in modo che dia la massima espressione. Quindi si sceglie la fonte migliore (G6P fosfatasi dal mitocondrio per esempio) e poi ne induco iper-espressione in un sistema opportuno (con vettori di clonaggio). Per prelevare la proteina di interesse occorre rompere la cellula e si va incontro alla omogenizzazione. Alla tecnica di distruzione cellulare vengo aggiunti:

• Antiossidanti
• Sodio azide
• Inibitori degli enzimi proteolitici (liberati dai lisosomi)
• Substrati enzimatici e cofattori che servono a formare dei complessi con la proteina al fine di renderla più resistente.

Metodi di rottura cellulare

A seconda del tessuto (si usa quello più ricco della nostra proteina) si useranno differenti metodi di rottura:

• Shock osmotico: gli eritrociti si lisano in soluzioni iper/iposmotic
• Congelamento/scongelamento: il leucocita ne è sensibile
• Digestione della parete con enzimi: per cellule vegetali con lisozima
• Solubilizzazione chimica: si usa acetone e altri detergenti organici ma non si usa perché potrebbero denaturare le proteine e perderne fino all’80%
• Forze frizionali: si usa mortaio o agitatore di Michael che dà agitazione vigorosa, si usa anche un frullatore o un Potter ma visto che sviluppano calore si usano col ghiaccio per evitare che il calore denaturi le proteine.
• Bombardamento con ultrasuoni della membrana: si usa il sonicatore
• Alta pressione: si utilizza la pressa francese per piccole quantità di materiale mentre per le grandi la presa di Manton-Gaulin. In entrambe si spinge la soluzione in un orifizio e si applica pressione fino a 1200 atm con conseguente lisi cellulare.

Ottenuto il materiale di partenza dal tessuto migliore si passa alla procedura di purificazione che viene fatta per tentativi. Tutte le tecniche di purificazione sfruttano le proprietà che rendono le proteine diverse tra di loro. Si ricava un protocollo dopo molte prove, per questo è importante la bibliografia.

Generalmente all’inizio si procede con metodi ad elevata capacità ma poco risolutivi, come ad esempio dialisi, adsorbimento, precipitazione e cromatografia liquido-liquido. Poi si introducono metodi ad alta risoluzione ma bassa capacità come la cromatografia a scambio ionico, di esclusione, di affinità e ultimamente anche quella ad interazioni idrofobiche. La purificazione dunque dipende dall’estrazione dalla matrice biologica prima e poi dall’allontanamento delle altre proteine. Solo a questo punto poi si faranno studi di attività (funzionale) e di struttura (in questo caso la proteina può essere anche denaturata, basta ridurre e carbossi-metilare così la svolgo come anche i ponti disolfuro).

N.B. se la proteina è in un organello si aggiungono:

• Mg se è in nucleo o mitocondri²⁺
• Agenti chelanti per metalli bivalenti che fanno da cofattori per enzimi che così non funzioneranno
• Inibitori delle proteasi
• Agenti riducenti come glutatione e mercaptoetanolo che si opporranno al danno ossidativo.

Prevenire la degradazione proteica

Importante è dunque prevenire la degradazione proteica da parte di enzimi proteolitici. Si procede con il dosaggio di questi enzimi che sono sospesi in soluzione dopo la rottura dei lisosomi. Questi possono essere o endopeptidasi (taglio all’interno della catena) o esopeptidasi (attacca il legame peptidico sulle estremità).

È possibile conoscere la quantità di questi enzimi proteolitici:

• Si può usare azeocaseina che se tagliata libera componenti che danno un colore specifico
• Si possono usare dei radioisotopi che marcano il substrato

Una volta conosciuta la dose di proteasi si fa sì che non completino la loro azione. Ad esempio alcune metallo-proteasi hanno bisogno di metalli bivalenti per funzionare e noi possiamo complessarli con EDTA per esempio, oppure l’esochinasi ha bisogno di Mg²⁺ per funzionare e se noi glielo togliamo non funzionerà più. Si possono inoltre usare degli inibitori delle proteasi.

Chiaramente nella purificazione della mia proteina non devo avere interferenti:

• Nella cromatografia a gel di filtrazione gli inibitori delle proteasi rimangono in colonna perché si perdono nei vari percorsi
• Nella precipitazione con solfato d’ammonio avremo la precipitazione delle sole proteine mentre gli inibitori rimarranno in soluzione. Quindi una volta risolubilizzato il precipitato andranno rimessi gli inibitori delle proteasi.

Ricorda che la presenza di un sale determina precipitazione della proteina, ma essa una volta messa di nuovo in sospensione mantiene intatta la sua attività biologica (così verranno vendute sotto forma di precipitato).

Nel percorso di diluizione di una proteina può avvenire che le sub-unità di cui era formata si dissocino e allora aggiungerò materiale addensante.

Passo fondamentale rimane comunque l’estrazione della proteina e si deve considerare la sua localizzazione cellulare:

• Per la cellula vegetale devo rompere la parete (peptidasi cellulari)
• Se sono proteine estrinseche di membrana (come i recettori) avranno con questa un legame ionico e posso usare la competizione ionica aggiungendo semplice NaCl e agendo con cicli di congelamento/scongelamento.
• Se sono proteine intrinseche di membrana (come le 7tm) aggiungo degli emulsionanti come l’SDS (sodio dodecil solfato) che deterge la proteina annullandone la carica intrinseca perché la avvolge di cariche negative, rendendola molto idrofila e facendola staccare dalla membrana.
• Se la proteina è in un organello subcellulare si utilizza la CENTRIFUGAZIONE ANALITICA (tecnica che con la spettrofotometria di massa riesce a determinare il corretto PM. Si può usare anche la cromatografia ad esclusione molecolare dove le molecole più grandi vengono eluite prima e se aggiungo delle proteine a PM noto, posso usarle come campione per misurare un PM relativo cioè se ho proteine note di 35 e 55 kDa e la mia proteina viene eluita in mezzo avrà un peso intermedio vicino a 45).

La centrifuga analitica è una tecnica preparativa: separa ed isola organelli subcellulari così da avere poi a che fare solo con le proteine di quell’organello. OMOGENIZZATO DI FEGATO = si rompe la membrana dell’epatocita senza intaccare gli organelli e metto tutta la sospensione in centrifuga che imposto a diverse velocità:

• 1000 gravità separa un sovratante e il precipitato è la frazione nucleare
• 3300 gravità il precipitato è la frazione mitocondriale
• 16300 gravità il precipitato è la frazione lisosomiale
• 100000 gravità il precipitato è la frazione microsomiale

Così facendo con una centrifugazione differenziale sono riuscito a isolare i vari organelli come tali e ho operato una notevole semplificazione della procedura di partenza, senza cui mi sarei dovuto occupare di tutto il contenuto cellulare! Ma oltre a separare organelli subcellulari si possono anche separare intere popolazioni cellulari. Infatti si possono creare delle stratificazioni a concentrazione diversa e aggiungendo degli eritrociti si osserva come essa si distribuisca secondo un gradiente osmotico perché si depositano dove trovano la tessa osmolarità.

Lavorando con proteine devo sempre lavorare a condizioni controllate però per ovviare alla denaturazione e lavorare con materiali inerti come il cloruro di cesio che è usato per isolare plasmidi e DNA. Una volta estratte le proteine si procede alla loro separazione in funzione alle varie differenze:

• Stabilità in un dato ambiente
• Solubilità e precipitazione
• Carica: le proteine possono essere più o meno cariche, gli AA hanno un pH che è il PI in cui sono sotto forma di zwitterione. La carica delle proteine però dipenderà dai gruppi R perché COO^- e NH³⁺ formano il legame peptidico e l’alfa-elica o il foglietto-beta con legami ad idrogeno
• Esclusione molecolare: in base al PM
• Affinità: le proteine riconoscono altre molecole in maniera specifica (es. i loro substrati)
• Idrofobicità: separazione in base a sequenze idrofobiche.

Abbiamo già visto come l’analisi delle proteine richieda una metodica ben precisa:

• Occorre scegliere il tessuto in cui la proteina di interesse sia maggiormente espressa
• Procedere alla rottura cellulare e formazione dell’omogenizzato ponendo tutto in soluzione
• Si può fare una preselezione scegliendo il solo organello in cui è localizzata la proteina (centrifuga).

Occorre porre molta attenzione ai valori che ricaviamo:

• Resa: rapporto tra unità enzimatiche nella frazione/unità enzimatiche nella preparazione originale
• Indice di purificazione: rapporto tra attività specifica della frazione/attività specifica preparazione originale
• Attività specifica: rapporto tra unità totali enzima nella frazione/quantità totale di proteine nella frazione.

È fondamentale individuare l’attività specifica così che la quantità di proteina o enzima di interesse sia confrontata con un valore costante (proteine totali) altrimenti se ci accontentiamo della concentrazione basterebbe una diluizione per alterare il valore! Nella misura delle proteine totali uso una misurazione relativa fatta cioè tramite il confronto con uno standard (in genere l’albumina sierica detta BSA). Di fatto si costruisce una retta di taratura dove a concentrazioni note e crescenti di BSA corrisponderà un aumento di un parametro.