Biochimica

Biochimica

Analisi delle proprietà chimiche e spaziali delle molecole biologiche

• Analisi delle interazioni tra le molecole biologiche.
• Processi di sintesi e degradazione delle molecole biologiche.
• Meccanismi di conservazione ed utilizzazione dell'energia.
• Meccanismi di organizzazione e coordinamento delle attività delle molecole biologiche.
• Conservazione, trasmissione ed espressione dell'informazione genetica.

Le caratteristiche della vita provengono dall'interazione tra le biomolecole per mantenere e propagare la vita. L'interazione e le reazioni fanno sì che gli organismi abbiano proprietà speciali che li differenziano dalla materia organica. Sono in grado di utilizzare l'energia, l'unico fine è quello di perpetuare la vita. La chimica della vita si basa su composti del carbonio incorporati in enormi molecole polimeriche. Gli elementi chimici presenti nei viventi sono un numero limitato. L'acqua è fondamentale poiché è alla base di tutto. Secondo Talete da Mileto, l'origine di tutto è l'acqua, da cui tutto proviene, e a cui tutto ritorna. La vita è possibile affinché le strutture cellulari possono organizzarsi. Chi sopravvive in condizioni di assenza di acqua sopravvive in uno stato di dormienza. La chimica della vita è la chimica del carbonio.

Macromolecole

Si formano per condensazione dei monomeri attraverso un legame covalente con eliminazione di una molecola di acqua, reazioni energicamente sfavorevoli, ne hanno bisogno (endoergoniche). I lipidi non sono vere e proprie molecole polimeriche, non hanno la ripetitività. Le reazioni di idrolisi e scissione di macromolecole sono energicamente favorevoli, rilasciano energia. Le macromolecole che compongono gli organismi sono il 30%; ioni e piccole molecole (4%), fosfolipidi (2%), una piccola percentuale e il resto DNA, RNA proteine e polisaccardi (24%), il 70% acqua.

• Amminoacidi formano proteine, ormoni di natura peptidica, non sono sempre incorporati in catene ma fungono da neurotrasmettitori o alcaloidi tossici (piante). Le proteine si trovano nelle membrane formando il glicocalice ma anche nei microtuboli, nel nucleo a formare la cromatina, nel citoplasma.
• Basi azotate formano acidi nucleici, formano ATP oppure coenzimi. Possono produrre neurotrasmettitori come adenosina.
• Acido palmitico formano i fosfolipidi nelle membrane, nei grassi e nelle cere prodotte da piante e da insetti.
• Zuccheri formano la cellulosa, immagazzinati sotto forma di amido, presenti di piccoli saccaridi come saccarosio e mannosio. Molte funzioni di segnalazione, di protezione ed energetica. Possono funzionare in modo autonomo.

Amminoacidi

Gruppo amminico primario NH₂ legato a C direttamente legato al carbonio carbossilico, α-amminoacidi. Sono tutti acidi amminici tranne la prolina che ha un gruppo imminico legato al carbonio alfa, dovrebbe essere un imminoacido. Vanno incontro a ionizzazione, a pH fisiologico, il gruppo amminico è protonato e il carbossilico cede il protone (forma deprotonata), sono nella forma dipolare, chiamati zwitterione. Se posto in diversi pH può essere un acido o una base. Possono esistere sotto forma di stereoisomeri di tipo L (levogira) e di tipo D (destrogira); nelle proteine sono tutti in forma L perché nell'evoluzione sono stati selezionati enzimi che sono in grado di incorporare e di interagire solo amminoacidi di tipo L (gruppo amminico a sinistra). Tutti sono stereoisomeri tranne la glicina.

Gruppo R alifatici, non polari

• Glicina è il più semplice, si trova in particolare nei siti attivi degli enzimi.
• Alanina.
• Prolina ha una catena idrocarburica alla quale è attaccato un gruppo imminico legato al carbonio alfa, formando un composto ciclico, non aromatico. È un amminoacido molto rigido.
• Valina.
• Leucina due gruppi idrocarburi isomerici.
• Isoleucina.
• Metionina che contiene lo zolfo attraverso un gruppo tioetere. Si trovano nella parte più interna (core) della proteina poiché idrofobiche nella struttura ripiegata.

Gruppo R aromatici

• Fenilalanina, il più idrofobico.
• Tirosina con il gruppo -OH può ionizzarsi.
• Triptofano.

Hanno elettroni delocalizzati sull'anello, questi sono in grado di assorbire la luce per passare da stato basale ad uno stato eccitato 280 nm.

Gruppo R polari, non carichi

• Serina forma legami idrogeno e si ionizza.
• Treonina.
• Cisteina il gruppo polare è -SH, due residui, in condizioni ossidanti, formano un legame covalente creando un ponte disolfuro formando la cistina. Nel RER e nell'ambiente extracellulare si trovano in ambiente pro ossidante. Il citosol e il nucleo è un ambiente riducente.
• Asparagina.
• Glutamine.

Gruppi R carichi negativamente a pH fisiologico (7.2)

• Aspartato.
• Glutammato importante per la deamminazione.

Gruppi R carichi positivamente a pH fisiologico

• Lisina.
• Arginina.
• Istidina può avere una carica positiva o vicina alla neutralità. Il gruppo immidaziolio ha pKa 7, dunque a pH fisiologico può prendere o cedere protoni, viene usato come tampone.

I valori di pKa sono diversi da amminoacido ad amminoacido, il pKa del gruppo carbossilico è in media di 2,2 mentre il pKa del gruppo amminico ha un valore medio di 9,4. Il valore della costante di dissociazione dei protoni è influenzato dall'ambiente circostante come la catena laterale che provoca una diversità di valori di pKa. I composti con gruppi ionizzabili avranno anche quest’ultimi un proprio valore di pKa a pH fisiologico. Mentre la cisteina e tirosina a pH fisiologico non sono ionizzabili ma possono andare incontro a ionizzazione a determinati valori di pH, come per esempio la tirosina si ionizza a pH 10, raggiunto a livello locale come in un sito attivo durante una reazione enzimatica.

Glicina

Rappresenta gli amminoacidi non ionizzabili. Si ionizzano solo a livello del gruppo carbossilico e amminico e non nella catena laterale. Inizialmente, la glicina posta in ambiente acido a pH 1 è in forma completamente diprotica ovvero sia il gruppo amminico che carbossilico sono entrambi protonati. Man mano che si aggiungono equivalenti di basi, il gruppo carbossilico inizia a deprotonarsi (pKa 2,34, in cui 50% sarà completamente protonata e 50% sarà sotto forma di ione dipolare). Intorno al pKa della glicina, si ha il maggior potere tampone insieme all’intorno del pKa del gruppo amminico. Aggiungendo equivalenti di basi, la curva del pH (y) è bassa rispetto ad altri punti di titolazione, ovvero intorno a un valore di pH 2,34 la glicina è in grado di assorbire i protoni e funzionare da tampone lasciando invariato il valore del pH. Superato questo pH, il pH subisce un'impennata fino a raggiungere un valore di 9,6, valore di deprotonazione del gruppo amminico. La variazione del pH in base all’aggiunta di OH- è scarsa, è un’altra zona tamponante, fino a quando non si raggiungono valori molto basici in cui la glicina si trova in forma deprotonata e carica negativamente. Il valore medio tra i due valori di pKa è uguale al punto isoelettrico (circa 6), è il valore di pH in cui la glicina si trova con una carica netta pari a zero.

Glutammato

Presenta un altro gruppo carbossilico, un terzo gruppo ionizzabile. Aggiungendo equivalenti di OH- si raggiungerà il valore di pKa del gruppo carbossilico legato al carbonio alfa circa di 2,19. All’aumentare del valore del pH, si raggiunge la pKa della catena laterale che è di 4,25 dove il 50% sarà nella forma dipolare e 50% con una carica netta pari a -1. In questo caso la pendenza della curva indica che il composto ha capacità di tampone. Aggiungendo OH-, fino a raggiungere il valore di pKa del gruppo amminico che è 9.77, anch’essa regione tamponante. A pH molto basici si ottiene tutto il glutammato deprotonato con una carica totale pari a -2. Il punto isoelettrico si trova con la media dei due primi valori di pKa (pKa1 e pKa2) con un valore di 3.22.

Istidina

Presenta un terzo gruppo ionizzabile della catena laterale che corrisponde all’atomo di azoto che fa parte dell’anello immidaziolico. A pH acidi tende ad assumere protoni e a mano a mano che il pH diventa basico, questo azoto può cedere protoni. I tre punti di cessione corrispondono quindi ai tre valori di pKa. La differenza in questo caso sta nel fatto che il pKa della catena laterale dell’istidina è pari a 6, ovvero a pH 6 un 50% di istidina ha una carica netta +1 mentre 50% avrà una carica netta pari a 0, quando ha ceduto il primo protone. Questo comporta che a pH 7.2 (fisiologico), la reazione è spostata verso destra, sarà preponderante la forma deprotonata dell’istidina ma una piccola parte si troverà in forma protonata, per cui potrà accettare o cedere protoni a seconda della concentrazione degli stessi anche a livelli locali. Per questo si dice che l’istidina ha un forte potere tampone a pH fisiologico. Il suo punto isoelettrico è il valore medio dei due valori di pKa2 (gruppo amminico) e pKa3 (catena laterale), i quali comprendono la forma dipolare ionica, è di circa 7,59.

Effetto dell'intorno chimico sul pKa

Nell’acido acetico il valore della pKa è pari a 4,8, quello della glicina è molto più basso. Il motivo è che poiché è presente un gruppo amminico carico positivamente questo tende a promuovere il rilascio del protone del gruppo carbossilico in modo da caricarsi negativamente e va a stabilizzare la molecola. Il gruppo amminico legato al gruppo metilico (pKa 10.6) o alla glicina (pKa 9.6), il motivo è che gli atomi di ossigeno che sono elettronegativi, tendono a sottrarre elettroni al gruppo amminico abbassando il valore della pKa. Il valore della pKa è assolutamente dipendente dall’intorno chimico.

Modificazioni post-traduzionali degli amminoacidi

• Aggiunta covalente di gruppi come ad esempio amminoacidi fosforilati, quelli che presentano un gruppo OH (treonina, serina e tirosina) quindi i 3 amminoacidi fosforilati sono la fosfotreonina, la fosfoserina e la fosfotirosina. La fosforilazione delle proteine è un meccanismo molto utilizzato dalla cellula per spegnere le proteine (enzimi) coinvolte nella trasduzione del segnale o nel processo metabolico.
• Aggiunta di gruppi metilici come nel caso della metilarginina o nel caso della metil lisina.
• Aggiunta di gruppi ossidrilici come nel caso dell’idrossi prolina o idrossilisina.
• Aggiunta dei gruppi acetilici a carico delle proteine istoniche, a seconda di questi gruppi hanno la capacità di compattare o meno il DNA nella cromatina.
• Aggiunta di gruppi carbossilici come nel caso del carbossiglutammato.
• La desmosina è un amminoacido che deriva da 4 residui di lisina uniti tra di loro, si trova nell’elastina (proteina strutturale).
• La seleniocisteina invece di avere un atomo di zolfo ha il selenio, viene codificata da un codone di stop. Quando codifica questo codone per la seleniocisteina, deve essere seguito da una sequenza di basi che va a formare una struttura tridimensionale a forcina che viene riconosciuta dal ribosoma.

Queste modifiche non cambiano nulla a livello genetico, avvengono post-traduzione.

Amminoacidi non proteici

Esistono anche amminoacidi che non fanno parte di una proteina, ma funzionano come amminoacidi stessi come l'ornitina e la citrullina presenti nel ciclo dell’urea che serve per l’eliminazione degli ioni ammonio. Altri amminoacidi che non sono di natura proteica ma funzionano da sé sono:

• La glicina e glutammato che funzionano da neurotrasmettitore eccitatorio generando un segnale neuronale.
• GABA non è amminoacido poiché manca il gruppo COOH e deriva dal glutammato, anche questo un neurotrasmettitore inibitorio.
• Istamina manca di un gruppo COOH, deriva dalla biosintesi di un amminoacido che è l’istidina, viene utilizzata dai mastociti ed è un forte mediatore delle reazioni allergiche.
• La dopamina manca di COOH e deriva dalla tirosina ed è un neurotrasmettitore di neuroni dopaminergici, quelli che degenerano nel morbo di Parkinson.
• Tiroxina che deriva dalla tirosina ed è un importante ormone tiroideo.

Struttura delle proteine

• Primaria: rappresenta la sequenza della proteina, gli amminoacidi presenti e come sono legati.
• Secondaria: le due principali tipiche sono l’alfa elica e i foglietti beta.
• Terziaria: avvolgimenti nello spazio.
• Quaternaria: più catene polipeptidiche interagiscono tra di loro in una struttura abbastanza stabile che va a formare la conformazione funzionale della proteina.

Come si ripiega la proteina nello spazio dando origine ai domini funzionali della proteina stessa. La struttura tridimensionale è ascrivibile alla struttura primaria, si può predire come una proteina si ripiegherà sullo spazio in base alla sequenza amminoacidica. Proteine che hanno funzioni simili, hanno anche un ripiegamento molto simile. Quando una proteina raggiunge la sua conformazione nativa cioè quella conformazione alla quale quella proteina è funzionale, lo fa in modo costante; se ho un pool di proteine che sono in forma nativa queste avranno una struttura tridimensionale regolare. Quando si purifica una proteina attraverso la cristallografia, i cristalli presentano una regolarità notevole, questo significa che la struttura proteica è regolare.

Esistono 20 amminoacidi diversi e se non ci fossero dei limiti di lunghezza, esisterebbero infinite proteine. Se fissiamo un numero di amminoacidi pari a 100 per una proteina, le combinazioni possibili sono 20¹⁰⁰. È un numero superiore degli atomi stimati che compongono l’universo, le cellule ne hanno selezionate solo alcune e questa selezione è stata fatta su una serie di criteri. Rispetto al numero di geni (20/25 mila), il numero di proteine risulta essere ampliato grazie a fenomeni di splicing alternativo e di uso di promotori alternativi. Con le modifiche post-traduzionali, il proteoma va a contare più di un milione di proteine.

Per una cellula non è vantaggioso che le proteine siano molto grandi, per un motivo legato alla possibilità di queste di incorporare più mutazioni, a livello di trascrizione del messaggero o a livello della traduzione. La strategia di utilizzare strutture quaternarie, che equivale a proteine piuttosto complesse ma attraverso più catene peptidiche è stata una strategia vincente. La maggior parte delle proteine è compresa tra 100 e 1000 residui amminoacidici, con una media di 335 residui. La titina è una delle più grandi proteine del nostro corpo, usata a livello dei sarcomeri come proteina scaffold, impalcatura su cui si vanno a legare l’actina e la miosina, tutte le proteine accessorie affinché possa avvenire la contrazione in maniera efficace. Non tutte le proteine, nella loro conformazione nativa, si basano sulla presenza di amminoacidi, molte contano la presenza di gruppi non amminoacidici. Quando questi gruppi sono stabili o covalente legati alle proteine stesse, si parla di proteine coniugate, e questi gruppi sono gruppi prostetici: un esempio sono i coenzimi che sono gruppi non amminoacidici che però non sono legati in maniera stabile ma si possono attaccare o staccare. Nelle proteine coniugate, i gruppi prostetici invece sono permanentemente legati. Tra le classi di proteine coniugate abbiamo le lipoproteine, glicoproteine (presenti in membrana), fosfoproteine, emoproteine (emoglobina con un gruppo eme a cui è legato il ferro), avoproteine (contengono nucleotidi flavinici come la succinato deidrogenasi), metalloproteine (legano alcuni metalli come ferro, molibdeno, rame, zinco e calcio).

Le interazioni idrofobiche, che si basano su legami non covalenti, sono predominanti nel determinare la struttura e la stabilità delle proteine, dato che permettono il ripiegamento della proteina nello spazio. Questi legami non covalenti sono le interazioni idrofobiche che si hanno tra residui laterali degli amminoacidi che tendono a raggrupparsi nel core (nucleo della proteina) interagendo tra loro escludono le molecole d’acqua; lasciando esposti i residui polari e carichi che interagiscono con il mezzo acquoso o tra di loro formando altri tipi di legame (idrogeno). Le interazioni idrofobiche possono essere interazioni dipolo-dipolo o interazioni dipolo indotto. Le interazioni di tipo covalente sono i ponti disolfuro.

La struttura primaria

Il legame peptidico è una reazione di condensazione tra il gruppo carbossilico di un amminoacido e il gruppo amminico di un altro amminoacido adiacente, avviene l’eliminazione di acqua. Ha bisogno di energia fornita dal meccanismo di sintesi proteica che avviene a carico di ribosomi, energia che è contenuta nell’amminoacido legato al tRNA che viene rilasciata al momento in cui questo amminoacido viene legato al polipeptide nascente. Avviene a carico di un’attività enzimatica non proteica, ma a livello del RNA 28S che compone una subunità ribosomiale. Il gruppo amminico, N-terminale a sinistra, il gruppo carbossilico C-terminale a destra. I peptidi hanno caratteristiche acido-base: gruppo ammino-terminale e carbossi-terminale. Esistono però anche le catene laterali in grado di acquistare o cedere un protone e di conseguenza le proprietà acido-base saranno conferite da queste. Il legame peptidico va a determinare la struttura della proteina stessa. Ha delle caratteristiche intermedie tra legame singolo e doppio, data la rotazione intorno ad essi.