Biochimica

Prof. Mioletti: Contatti e introduzione alla biochimica

Prof. Mioletti 0116709112 silvia.mioletti@unito.it

La biochimica studia:

• Componenti chimici degli organismi viventi;
• Processi e modalità attraverso i quali i componenti vengono sintetizzati e demoliti.

Introduzione

L'energia libera → Energia necessaria per compiere un lavoro → di Gibbs → G. Se temperatura e pressione sono costanti la reazione è spontanea se si ha una diminuzione dell'energia libera del sistema.

Energia libera reagenti > Energia libera prodotti
G - G = ΔG , se:

• ΔG < 0 → Reazione spontanea, va da destra a sinistra;
• ΔG = 0 → Reazione di equilibrio;
• ΔG > 0 → Reazione non spontanea, va da sinistra a destra.

0ΔG → Kcal/mol → Calcolato con concentrazione uguale ad 1M sia dei reagenti che dei prodotti a 25°C e 1atm quindi in condizioni standard, se anche il pH è costante a 7 si indica ΔG' ed è caratteristico di ogni reazione.

Se:

• 0ΔG è negativo la reazione è detta esoergonica;
• 0ΔG è positivo la reazione è detta endoergonica, termodinamicamente non è spontanea perché necessita di energia, queste reazioni vengono accoppiate con reazioni che liberano energie.

Nel nostro organismo avvengono reazioni che termodinamicamente potrebbero avvenire ma sono cineticamente impossibili perché troppo lente, si sono sviluppati perciò dei catalizzatori per accelerarle, sono detti enzimi.

Enzimi

Devono essere:

• Efficienti, per aumentare la velocità di reazione;
• Specifici, accelerano una reazione su un substrato specifico;
• Regolabili, possono variare la loro capacità associandoli ad effettori o variazioni chimico fisiche.

In genere sono proteine globulari idrosolubili però possono essere:

• Proteine semplici;
• Glicoproteine;
• Lipoproteine;
• Proteine coniugate.

Concetti fondamentali

Enzima che viene sintetizzato in forma inattiva e poi attivato perché trasformato chimicamente:

• Zimogeno → determinati substrati, sono soprattutto quelli digestivi (pepsina-pepsinogeno)
• Porzione proteica di enzimi che sono proteine coniugate: Apoenzima → Molecole non proteiche o ioni indispensabili, Cofattore → affinché l'enzima possa agire.
• Coenzimi → Cofattori che siano solo di tipo organico, agiscono come trasportatori transitori di specifici gruppi funzionali.
• Gruppo Cofattore legato in modo stretto e stabile all'apoenzima, in genere con legami covalenti.
• Oloenzima = Apoenzima + Cofattore complesso catalicamente attivo.
• Complesso multienzimatico: costituito da più unità enzimatiche indipendenti che operano in modo sequenziale, la risposta è più veloce e coordinata.
• Enzima polifunzionale: sulla stessa molecola si possono avere diverse funzioni.
• Attività enzimatica: quantità di substrato convertito per minuto in condizioni standard → μmol/min.
• Unità enzimatica: attività enzimatica che in condizioni definite di reazione catalizza la trasformazione di una μmol di substrato al minuto.
• Attività specifica: attività enzimatica espressa per mg di proteina → μmol/min/mg di proteina.
• Efficienza catalitica: caratteristica per ogni enzima, numero di turnover, quindi attività catalitica per mole → μmol/min/mol di enzima.

Un enzima produce un ambiente ideale affinché una determinata reazione sia energeticamente favorita, avviene grazie alla presenza di una tasca detta sito attivo dell'enzima, ci possono essere anche altri siti in cui si attaccano i coenzimi o i cofattori.

Nomenclatura

In passato si teneva conto della natura proteica dell'enzima e quindi si dava la desinenza -ina ad ogni enzima (pepsina). Successivamente ci si riferiva al substrato e quindi si dava la desinenza -asi al nome di esso (ureasi).

Nel 1961 l'Unione Internazionale di Biochimica, IUB, determinò una nomenclatura basata su:

• Tipo di reazione catalizzata;
• Nome del substrato.

Si instaurano così sei classi in base alla reazione, l'ordine è importante:

1. Ossidoriduttasi, reazioni redox (idrogenasi, ossidasi, reduttasi, perossidasi), avvengono con dei cofattori che possono essere NAD⁺, NADP⁺, FAD. Esempio: Lattato deidrogenasi + Lattato + NAD⁺ ↔ Piruvato + NADP⁺ + H⁺
2. Transferasi, trasferimento di un raggruppamento chimico da una molecola all'altra, vi sono diverse sottoclassi:
   • Carbossile → Transcarbossilasi
   • Acile → Transacilasi
   • Glicosile → Transglicosilasi
   • Gruppo amminico → Transaminasi
   • Gruppo fosforico → Transfosforilasi
   Esempio: Alanina transaminasi, vi è il trasferimento di un gruppo amminico.
3. Idrolasi, scissione idrolitica, si ha l'aggiunta di acqua e la rottura dei legami covalenti, ci sono diverse sottoclassi:
   • Esterasi
   • Fosfatasi
   • Proteasi
   Esempio: Pirofosfatasi, Pirofosfato + Acqua ↔ 2 Fosfato (Tossico) (Non tossico)
4. Liasi, lisi di un substrato a livello di un doppio legame, si può avere:
   • Eliminazione, non idrolitica e non ossidativa quindi non si ha l'aggiunta di acqua;
   • Inverso, aggiunta al substrato di un doppio legame.
   Le addizioni sono dette sintasi. Esempio: Piruvato decarbossilasi + Piruvato + H⁺ → Acetaldeide + Anidride carbonica
5. Isomerasi, reazioni monomolecolari, il substrato viene trasformato nel suo isomero, si hanno diverse sottoclassi:
   • Isomerasi
   • Epimerasi
   • Racemasi
   • Mutasi
   Esempio: Ribosio 5 fosfato epimerasi Ribulosio ↔ Xifulosio, Ribosio 5 fosfato isomerasi Ribulosio ↔ Ribosio
6. Ligasi, si ha la formazione di legami covalenti, sono reazioni fortemente endoergoniche, possono avvenire grazie alla rottura di ATP o di un analogo. Esempio: Sintetasi, carbossilasi Piruvato + bicarbonato → Ossalacetato + Acqua

Ogni enzima è rilevato da quattro numeri:

• Classe;
• Sottoclasse;
• Sotto-sottoclasse;
• Numero progressivo nella sotto-sottoclasse a seconda della loro scoperta.

Esempio: Glucosio 6 fosfato fosfatasi = 3. → Idrolasi 1. → Esterasi 2. → Fosfatasi 9. → Perché nell'ambito di questa classe è il nono.

Sono detti isoenzimi gli enzimi che esistono in forme molecolari diverse anche se catalizzano la stessa reazione, sono composti da proteine oligomeriche che differiscono per:

• Diversa composizione delle subunità;
• Diverso organo, tessuto o compartimento cellulare;
• Diversa affinità per substrati.

Esempio: Lattato idrogenasi → LDH. Nel citosol è un tetramero che può essere composto da due catene polipeptidiche che si possono combinare in diversi modi:

• Catena H → Presenti nel cuore
• Catena M → Presenti nel muscolo

Si possono avere cinque combinazioni diverse:

1. HHHH → LDH1 → Solo nel cuore
2. MMMM → LDH5 → Solo nei muscoli scheletrici e nel fegato
3. HHHM → LDH2
4. HHMM → LDH3 Ibridi
5. HMMM → LDH4

Le diverse combinazioni sono un importante mezzo diagnostico, ad esempio si può identificare un infarto se dalle analisi l' LDH è presente anche nel plasma.

Enzimi costitutivi e induttivi

Gli enzimi costitutivi sono presenti in un certo tessuto, sono permanentemente presenti nelle cellule. Gli enzimi induttivi sono quelli presenti in quantità piccole o assenti, prodotti solo su richiesta. L'induzione enzimatica è l'attivazione della sintesi dell'enzima, mentre l'attivazione enzimatica è l'aumento dell'attività di un enzima.

Complesso E-S

Ogni reazione procede attraverso un complesso attivato la cui energia corrisponde all'enzima di attivazione. In presenza di un catalizzatore è minore:

• L'energia di attivazione;
• La temperatura alla quale la reazione procede in modo ottimale.

Il fattore critico non è il numero di stadi intermedi ma l'altezza dello stato intermedio più alto. Il ΔG non varia, l'enzima non modifica l'equilibrio.

Substrato + Residuo attivo del sito dell'enzima + Eventuali cofattori = Complesso enzima-substrato → E-S.

Teorie del complesso E-S

Ci sono due teorie che spiegano questo complesso:

1. Chiave-serratura, più vecchia, il sito attivo è esattamente configurato per un determinato substrato, infatti il E-S deve garantire:
   • La formazione dei legami;
   • La formazione degli isomeri, quindi riconosce la disposizione 3D.
2. Teoria dell'adattamento indotto, un enzima modifica, in modo dinamico e reversibile, il suo sito attivo in seguito alla combinazione con il substrato.

Fattori che influenzano il complesso E-S

I fattori che influenzano il complesso sono:

• pH, può modificare la struttura terziaria dell'enzima, può cambiare la geometria del sito attivo e la distribuzione delle cariche, è in grado di dissociare eventuali gruppi acidi o basici sul substrato. Il pH ottimale è l'intervallo di pH in cui la reazione viene catalizzata con la massima efficienza.
• Temperatura, gli enzimi sono termolabili, entro certi limiti un aumento della temperatura può velocizzare la reazione fino a quando la temperatura non arriva a quella di denaturazione. Gli enzimi a basse temperature non vengono denaturati, si può aumentare la loro attività aumentando la temperatura. Ci sono diverse applicazioni:
  • Temperatura per la pastorizzazione e la sterilizzazione;
  • Temperatura per la conservazione degli alimenti.
• Concentrazione enzima, velocità e concentrazione dell'enzima sono direttamente proporzionali.
• Concentrazione substrato, tenendo costante l'energia, in un primo momento ci sarà un aumento proporzionale del legame E-S, oltre una certa soglia però non si avrà più perché l'enzima sarà il fattore limitante, ci sarà allora uno stato stazionario dove l'enzima ha raggiunto la sua massima azione catalitica, Vmax. Si ha una curva iperbolica:

  Dove K_M è la concentrazione di substrato che satura metà dei siti attivi dell'enzima cioè la concentrazione alla quale l'enzima lavora alla velocità semimassimale, secondo l'equazione di Michaelis-Menten si ha che: V_max[S]/(K_M+[S]). Quanto è minore l'affinità dell'enzima per il suo substrato tanto maggiore sarà la K_M, questo valore è indipendente dalla quantità di enzima che abbiamo e caratteristico di ogni enzima per ogni substrato in condizioni definite.

Regolazione dell'attività enzimatica

L'attività enzimatica può essere regolata a seconda dei fabbisogni metabolici della cellula con diversi meccanismi:

• Modificazione covalente della molecola enzimatica, aggiunta o rimozione di legami chimici alle catene laterali di determinati residui amminoacidi, un esempio è la fosforilazione/defosforilazione. In genere gli enzimi catabolici sono attivati dalla fosforilazione e quelli anabolici inattivati.
• Associazione-dissociazione dei monomeri che costituiscono la molecola oligomerica dell'enzima.
• Azione su un sito secondario dell'enzima, allosterismo, gli enzimi allosterici possono modificare la loro attività tramite fattori allosterici che si legano al sito allosterico o regolatore. Quasi tutti gli enzimi di questo tipo sono formati da più subunità, il sito attivo e quello allosterico possono anche trovarsi su subunità diverse che vengono chiamate rispettivamente catalitiche e regolatrici. In questi casi si può verificare un effetto cooperativo tra i due siti, legando il substrato al sito attivo si modificano anche le altre subunità e si avrà più affinità per S da parte degli altri siti attivi. A basse concentrazioni di substrato si ha un aumento della velocità, a più elevate concentrazioni si ha un aumento progressivo fino al raggiungimento della Vmax. Nel grafico abbiamo un enzima non allosterico A e uno allosterico B. Se il modulatore dell'affinità è il substrato stesso si ha una modulazione omotropica altrimenti si ha una modulazione eterotropica. Esistono enzimi che possono essere regolati sia da fosforilazione sia da effettori allosterici, un esempio è la piruvato chinasi.
• Induzione o repressione genica della biosintesi della proteina enzimatica.

Inibitori dell'attività enzimatica

Gli inibitori dell'attività enzimatica sono composti capaci di rallentare o inibire la reazione enzimatica. Possono essere:

• Irreversibili o inattivatori, modificano chimicamente e irreversibilmente la catena laterale di un determinato amminoacido nel sito attivo dell'enzima formando un composto stabile E-I incapace di trasformarsi in un prodotto. Un tipo particolare sono gli inibitori suicidi che iniziano la reazione enzimatica normalmente ma invece di trasformarsi nel prodotto vengono convertiti in composti reattivi che si combinano in modo irreversibile con l'enzima.
• Reversibili, si combinano per mezzo di legami deboli all'enzima e possono essere allontanati. L'inibizione può seguire un meccanismo:
  • Competitivo, S e I sono simili e competono per il sito attivo, in questo caso l'enzima raggiunge in ritardo la Vmax perché si ha bisogno di più concentrazione del substrato per scacciare l'I dal sito, aumenta quindi la K_M.
  • Non competitivo, la molecola di I si può legare sia all'enzima libero oppure al complesso E-S in un sito diverso da quello attivo se è un enzima allosterico. In questo caso viene modificata la struttura in vicinanza del sito attivo rendendo meno efficace il legame E-S. In questo caso la K_M non varia perché indipendentemente dalla concentrazione di substrato l'enzima non riesce mai a raggiungere la Vmax.

Esiste una particolare inibizione detta incompetitiva dove l'I si lega solo con l'E-S e non con quello libero, in questo caso diminuiscono sia la Vmax che la K_M.

Vitamine e coenzimi

Le vitamine sono sostanze organiche necessarie all'organismo giornalmente perché è incapace di sintetizzarle. Agiscono in piccole dosi e quindi sono classificate come micronutrienti. A seconda delle caratteristiche di solubilità si dividono in:

• Idrosolubili;
• Liposolubili.

Possono essere degradate e perdere la loro attività durante la loro conservazione, la cottura o la manipolazione. Possono essere:

• Termolabili → B₁, B₂, B₆, C;
• Fotosensibili → E, K, B₂, B₁₂;
• Reagire facilmente con ossidanti → A, C, E.

Alcuni farmaci possono alterare la loro attività e i livelli intracellulari di alcune vitamine, ad esempio l'eparina interferisce sull'attività della vitamina E. Sono dette antivitamine quelle sostanze naturali o sintetiche che interferiscono con le normali funzioni biologiche o con la sintesi delle vitamine. Possono agire come antemetaboliti comportandosi come pseudo-vitamine o pseudo-provitamine inserendosi, con fattori inibitori, nei processi metabolici cellulari. Si ha un'alterazione del biochimismo cellulare con un quadro patologico riferibile alle specifiche carenze vitaminiche.

Liposolubili

Sono insolubili in mezzi acquosi, vengono assorbite insieme ai lipidi nel primo tratto intestinale e accumulate negli organi, possono dare fenomeni di iper-vitaminosi.

Vitamina A o Retinolo

È un alcol a 20 molecole di Carbonio, ha un grande numero di doppi legami che la rendono suscettibile alla perossidazione e quindi all'inattivazione. Presenta un'azione simile anche il 3-deidroretinolo o A₂ che ha un doppio legame anche tra il C₂ e il C₄ ed è presente nei pesci di acqua dolce. Si forma dai caroteni (carote, insalata, spinaci) tramite la β-carotene 15,15' monossigenasi o la retinale reduttasi. Il più diffuso è il β-carotene che trasformato dà due molecole di retinolo con intermedio il retinale tramite una reduttasi dipendente da NADH e NADHP, ha resa bassa perché:

• Si verificano un incompleto assorbimento intestinale;
• Minore conversione quantitativa da parte delle cellule intestinali e degli epatociti.

Il gatto non può convertire i caroteni in retinolo perché probabilmente non ha quell'enzima. Nell'intestino si ha un'esterasi tramite il retinolo e un esterificante, negli enterociti il β-carotene entra e viene trasformato. Gli esteri così formati entrano nei chilomicroni e poi trasportati nel fegato e nei tessuti extraepatici dove il retinolo è incorporato nella cellular retinol-binding protein o CRBP dove è trasformato prima in retinale e poi in modo irreversibile in acido retinoico. Se non è utilizzato a livello epatico viene esportato e legato al retinol binding protein o RBP e captato dai tessuti grazie a particolari recettori. Nel plasma quest'ultima proteina è legata alla transtiretina utilizzata anche per trasportare gli ormoni tiroidei.

È detta vitamina epitelio protettiva perché si deposita specialmente in fegato, nelle cellule stellate, e tessuto adiposo. È un cofattore dei fotorecettori della retina perché il retinale 1,1-cis si lega all'opsina formando la rodopsina, una proteina attivata dei bastoncelli della retina, il legame viene rotto dalla luce. L'acido retinoico è in grado di legare i recettori intracellulari per questo, una volta attivati traslocano nel nucleo e legano a specifiche sequenze regolatrici di DNA, modulando l'espressione genica e influenzando la differenziazione cellulare.