Biochimica 2: enzimi; regolazione enzimatica e delle vie metaboliche

ES

• una k₁ che riguarda la reazione E + S → ES, pari a ;

[ ][ ]

E S [ ][ ]

E S

• ₋₁

una k che riguarda la reazione inversa, ovvero ES → E + S, pari a ;

[ ]

ES

[ ][ ]

E P

• ₂

una k che riguarda la reazione ES → E + P, pari a ;

[ ]

ES [ ]

ES

• ₋₂

una k che riguarda la reazione inversa, ovvero E + P → ES, pari a .

[ ][ ]

E P

All’inizio della reazione, dato che la quantità di prodotto è così piccola da poter essere trascurata,

si può trascurare la k₋₂. Le tre costanti di equilibrio rimanenti sono tenute insieme dall’equazione

di Michaelis-Menten, il quale enunciato è:

La cinetica di Michaelis-Menten descrive la variazione di velocità di una reazione enzimatica

al variare della concentrazione di substrato. Questo modello spiega come, a concentrazione

di enzima supposta costante, all’aumentare della concentrazione di substrato, anche di poco,

la velocità di reazione aumenti vertiginosamente. La velocità di reazione raggiunge un picco,

chiamato Vmax, al di sopra del quale non può più andare, poiché a questo punto tutti gli enzimi

presenti in soluzione sono stati saturati da quella concentrazione di substrato. Tuttavia, il livello

Vmax non viene mai raggiunto, ma soltanto sfiorato, poiché ci sono sempre delle molecole che

non riescono a partecipare alla reazione.

Una volta raggiunta la Vmax, e dunque saturati gli enzimi, un aggiunta di substrato

determinerebbe un suo eccesso; è proprio la quantità di quest’eccesso a rappresentare la

concentrazione di substrato libero risultante.

La costante di Michaelis-Menten rappresenta la concentrazione di substrato alla quale la

velocità di reazione è pari alla metà di Vmax.

Numero di turnover - Il numero di turnover è il numero di substrati che l’enzima trasforma in

prodotti nell’unità di tempo.

Coenzimi - I coenzimi sono molecole organiche non proteiche (o molecole inorganiche come

ioni metallici nel caso dei cofattori) che aiutano l’attività catalitica di un enzima. Essi, spesso,

possono andare a formare proprio il sito attivo catalitico, oppure possono fungere da donatori e

accettori di gruppi atomici, elettroni o protoni per i substrati.

I coenzimi sono, spesso, derivati delle vitamine,

ovvero composti non prodotti dall’organismo e

quindi da introdurre necessariamente tramite la

dieta.

I coenzimi più importanti sono:

• il NAD⁺, ovvero nicotinammide-adenin-

dinucleotide, e il NADP⁺, ossia

nicotinammide-adenin-dinucleotide-

fosfato. Essi collaborano con enzimi

deidrogenasi, facenti parte della categoria

delle ossidoreduttasi. NAD e NADP

fungono da accettori e donatori di protoni

ed elettroni, oscillando fra lo stato ossidato e ridotto secondo le reazioni:

⁺ ⁺ ⇄

NAD(P) + H + 2eˉ NAD(P)H

Il NAD, in genere, partecipa a reazioni redox del catabolismo, mentre il NADP predilige

reazioni redox di biosintesi;

• il FAD, ovvero flavin-adenin-dinucleotide, che partecipa anch’esso a reazioni redox,

accettando e donando uno o due elettroni secondo la reazione:

⁺ ⇄

FAD + H + eˉ FADH (radicale semichinonico)

⁺ ⇄ ₂

FAD + 2H + 2eˉ FADH (radicale chinonico)

Il FAD è formato da adenina e flavina, a sua volta formata da uno zucchero chiamato

ribitolo, un gruppo fosfato e un anello isoallossoazolico;

Un altro importante coenzima flavinico è il FMN, ossia il flavin-mononucleotide.

• la tiamina-pirofosfato, ossia la forma coenzimatica della vitamina B1, in grado di

trasportare un gruppo aldeidico. La tiamina-pirofosfato partecipa alla catalisi della

piruvato deidrogenasi, attraverso la quale il piruvato viene decarbossilato ad acetil-

CoA (vedi documenti successivi);

• il coenzima-A, o CoA, contenente adenina, ribosio, fosfato e acido pantotenico;

• la biotina, che partecipa a reazioni di carbossilazione; essa si lega ad una molecola di

bicarbonato per formare la carbossibiotina. Nella biosintesi degli acidi grassi una

parte di questa molecola cede un gruppo carbossilico all’acetil-CoA trasformandolo il

malonil-CoA;

• il coenzima-B12, o CoB12, derivato dalla vitamina B12, che aiuta alcune isomerasi a

trasportare un atomo di idrogeno da un gruppo ad un altro nell’ambito della stessa

molecola;

• il tetraidrofolato, trasportatore di gruppi formilici, molto importante nelle reazioni di

biosintesi delle basi azotate.

Diagramma di Lineweaver-Burk - Il diagramma di Lineweaver-Burk, più semplicemente noto

come grafico dei doppi reciproci, è un altro metodo grafico di rappresentazione dell’equazione

di Michaelis-Menten.

Esso non rappresenta, come il primo, i valori [S],

Vmax e Km, bensì i loro reciproci: 1/[S], 1/Vmax e

1/Km.

La pendenza della retta è rappresentata dal

rapporto fra Km e Vmax.

Regolazione enzimatica - L’attività enzimatica è

regolata e influenzata, cioè attivata o inibita, da

molti fattori:

• temperatura, che aumentando incrementa

l’attività enzimatica;

• pH; ciascun enzima ha un range prediletto di valori di pH ai quali funziona

ottimalmente;

• concentrazione di sali, dunque forze ioniche: i sali, in soluzione, si scindono nei loro

ioni e le cariche degli ioni influiscono sull’attività enzimatica;

• modificazioni covalenti dell’enzima stesso;

• presenza di attivatori e inibitori, cioè modulatori degli enzimi.

REGOLAZIONE ENZIMATICA E DELLE VIE METABOLICHE

La regolazione enzimatica sta alla base della regolazione delle vie metaboliche a cui gli enzimi

in questione partecipano. La regolazione avviene in diversi modi.

Compartimentalizzazione - Il primo metodo di regolazione enzimatica e quindi metabolica è

quello della compartimentalizzazione. Essa consiste, semplicemente, nel confinare gli enzimi e/o

i substrati necessari a diverse vie metaboliche in diversi compartimenti cellulari. Ciò che

regola il tutto è, dunque, la disponibilità di substrato, poiché gli enzimi ci sono e sono attivi.

Un esempio di compartimentalizzazione è la maniera con la quale la biosintesi degli acidi

grassi e la degradazione di essi (β-ossidazione) sono regolate in modo da avvenire sempre in

momenti separati, poiché la loro contemporaneità produrrebbe cicli futili.

In effetti, gli enzimi della biosintesi degli acidi grassi si trovano nel citosol, mentre quelli della

β-ossidazione si trovano nei mitocondri. Essi sono sempre attivi, ma dato che la membrana

mitocondriale interna è molto selettiva e consente il passaggio di molecole solo sotto il rigoroso

controllo di un trasporto, i substrati vi entrano solo in precisi momenti che, come vedremo,

dipendono dalla biosintesi degli acidi grassi.

Il substrato iniziale della β-ossidazione non è l’acido grasso libero, bensì l’acil-CoA, cioè

l’acido grasso legato dal coenzima-A ancor prima di entrare nel mitocondrio. Tuttavia, l’acil-

CoA non è in grado di passare attraverso la membrana mitocondriale esterna, e per farlo deve

essere trasformato in acil-carnitina. L’enzima che stacca il CoA dal gruppo acile e vi lega in

seguito la carnitina prende il nome di carnitina-acil-trasferasi-1; il trasporto specifico dell’acil-

carnitina prevede l’ingresso di quest’ultima e la fuoriuscita di carnitina libera con un rapporto di

1:1. In seguito all’ingresso dell’acido grasso nel mitocondrio, sotto forma di acil-carnitina,

quest’ultima viene ritrasformata in acil-CoA dall’enzima carnitina-acil-trasferasi-2, con

liberazione di una molecola di carnitina libera, che andrà a prendere un’altra molecola di acido

grasso.

Il controllo sta nel fatto che il primo intermedio della biosintesi degli acidi grassi, il malonil-

CoA, è un potente inibitore della carnitina-acil-trasferasi-1, inibendo così l’ingresso di acil-

carnitina nel mitocondrio e, dunque, tutta la β-ossidazione.

Inibizione competitiva - L’inibizione competitiva di un enzima consiste nel legame di un inibitore

molecolare dell’enzima stesso in corrispondenza del suo sito attivo, impedendo all’enzima di

legare il substrato per catalizzare la reazione. L’inibizione competitiva porta alla formazione del

complesso enzima-inibitore ed è un processo reversibile. La maniera attraverso cui si può

spiazzare un’inibizione competitiva è, semplicemente, incrementare la concentrazione di

substrato; il valore della Vmax della reazione enzimatica resta invariato: ciò che cambia è,

ovviamente, la concentrazione di substrato alla quale si raggiunge la Vmax. Dato che ce ne

vuole di più, aumenta anche la concentrazione di substrato necessaria per raggiungere Vmax/2,

cioè la costante di Michaelis.

Dunque, nel grafico dei doppi reciproci l’inibizione competitiva si traduce in un aumento della

Km (diminuzione di 1/Km), mentre la Vmax resta invariata; la pendenza della retta aumenta.

Inibizione incompetitiva - L’inibizione incompetitiva di un enzima consiste nel legame di un

inibitore molecolare dell’enzima stesso al complesso enzima-substrato, e non all’enzima

libero. È un’inibizione reversibile. Il sito di legame, ovviamente, non è il sito attivo dell’enzima,

in quanto già occupato dal substrato. In questo caso, i parametri del grafico dei doppi reciproci

diminuiscono in maniera proporzionale: Km diminuisce, quindi 1/Km aumenta, Vmax

diminuisce, quindi 1/Vmax aumenta, e la pendenza della retta rimane invariata. Le rette

appaiono parallele fra loro e intersecano l’asse y in punti diversi, contrariamente al primo caso.

Inibizione mista - Nel caso dell’inibizione

mista, l’inibitore può legarsi sia all’enzima libero che al complesso enzima-substrato, ma

sempre in un sito diverso dal sito attivo. Anche questo tipo di inibizione è reversibile. Ciò si

traduce, nel grafico dei doppi reciproci, in un aumento della Km, quindi una diminuzione di

1/Km, in una diminuzione della Vmax, quindi in un aumento di 1/Vmax, e in un aumento della

pendenza della retta.

Inibizione irreversibile - L’inibizione irreversibile di un enzima avviene quando un inibitore si

lega in corrispondenza del suo sito attivo in maniera covalente, modificando fatalmente le

interazioni intrinseche dell’enzima, rendendo impossibile il suo riutilizzo. In questo caso, la

costante di Michaelis di quell’enzima resta invariata, ma prende il nome di Km apparente,

appunto perché assume una valenza prettamente teorica dato che l’enzima non può più svolgere

la sua funzione. Ciò che cambia è la Vmax della reazione, che di