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L’immagine raffigura la struttura di una schiuma: al centro ho la bolla d’aria e tutt’intorno la

fase continua, costituita nel caso della meringa dall’albume, fatto da acqua e proteine,

l’ovalbumina. Questa proteina è disposta in modo tale che le parti idrofobiche sono verso l’aria,

mentre le zone idrofiliche sono all’interno della fase continua acquosa. All’interno della

schiuma abbiamo dei punti nodali, i punti d’incontro tra le diverse bolle d’aria presenti. La

schiuma si forma bene solo con certe proteine perché la struttura che viene generata da questi

sistemi è in grado di non far collassare immediatamente la schiuma. Nel collassamento di una

schiuma sono 3 i fattori importanti:

l’aria presente nella bolla evapora o fuoriesce e una schiuma collassa

▪ l’acqua può fuoriuscire ed evaporare

▪ l’acqua presente nel sistema tende a scorrere verso i punti nodali; raggiungendo i punti

▪ nodali, fa collassare la struttura.

Per stabilizzare i primi 2 fattori posso fare molto poco, mentre posso rallentare il terzo

parametro. Per rendere lo scorrimento più lento devo fare in modo che il sistema continuo sia

il più viscoso possibile, in modo da rallentare il fluire dell’acqua. L’albume è un sistema viscoso,

anche il glutine è un sistema viscoso. In molti altri casi si formano delle schiume, che collassano

subito. Il sistema deve essere viscoso, ma solubile. Posso anche aiutare una struttura a essere

più viscosa, per esempio aggiungendo lo zucchero a velo nella meringa. A questo punto devo

fissare il sistema con la cottura, in cui denaturo le proteine e l’aria se ne va, ma la struttura

rimane.

Una conferma del ruolo dello zucchero per rendere viscosizzante un sistema è nella diversità di

schiuma persistente che si nota in alcuni vini in dipendenza dal contenuto di zuccheri. La

schiuma di un vino bianco dolce è molto più piccola, regolare e persistente, da una schiuma

ottenuta da un vino secco, che ha una schiuma molto meno regolare e persistente.

Le caratteristiche delle proteine per la stabilizzazione di una schiuma sono:

devono avere una composizione bilanciata

o dopo che sono state denaturate devono essere viscose

o devono essere solubili nella fase continua (non devono essere presenti in maniera

o dispersa o in sospensione)

Come una proteina interagisce con un’interfaccia e come cambia la sua struttura

La prima cosa che devo considerare è se l’interazione fra la fase apolare è un’emulsione (olio e

la proteina) e in questo caso ho una penetrazione (la proteina si apre e ingloba l’olio), oppure

se ho un adsorbimento, ed è il caso in cui vado a interagire fra il sistema acquoso e una fase

solida. In questo caso si ha un’interazione diversa, ovvero la coesione di 2 fasi. Quidi questi 2

sistemi vengono stabilizzati, ma hanno molecolamente un effetto diverso.

© Laila Pansera - 58

Il modello presentato per mostrare la differenza di una stessa proteina nella modificazione

all’interfaccia è l’emulsione confrontata con la proteina che si assorbe su una superficie solida

idrofobica, una nanoparticella di stirene. Lo schema quindi rappresenta la BLG in uno spetto di

fluorescenza intrinseca. I 2 andamenti contrassegnati con native sono gli stessi (cambiano le

scale), mentre a destra abbiamo la BLG legata all’olio nell’emulsione, e a sinistra abbiamo la

BLG che ha interagito con una nanoparticella (fase solida). I 2 spettri dicono che le

modificazioni che ha subito la proteina in seguito all’interazione con in 2 sistemi idrofobici,

sono profondamente diverse. Riguardo il primo grafico per prima cosa vedo che non hanno lo

steso spettro della forma nativa, poi noto che cambia l’intensità, e che anche il massimo di

emissione è spostato, indice del fatto che la proteina ha una struttura diversa. Osservando BLG

in emulsione noto che lo spettro anche qui è diverso rispetto alla nativa, in termini di intensità

(350 contro i 250) e anche in termini di massimo di emissione. Quindi la proteina stabilizzando

questo sistema ha modificato la sua struttura.

Per notare che la proteina ha cambiato la sua struttura lo noto con la fluorescenza intrinseca,

ma anche guardando l’accessibilità dei tioli (SH liberi) della cisteina. Notiamo nella tabella

che nella BLG nativa a 25°C gli SH accessibili sono 0, mentre nella BLG associata a NP a 25°C gli

SH accessibili sono tutti. Questo mi dice che la proteina quando stabilizza la NP cambia la sua

struttura.

© Laila Pansera - 59

Da tutti questi dati è stato fatto un modellino per calcolare come la proteina si posiziona nei

confronti della NP (quella sotto in grigio).

Da qui ne deriva che se io presento la mia proteina adsorbita a una NP avrò delle conseguenze

nelle sue funzioni.

Una proteina cambia la sua organizzazione strutturale anche in dipendenza dalle dimensioni

della NP idrofobica che io metto, perché cambiano le dimensioni della superficie idrofobica che

devo esporre. Per esempio nella digestione l’aggredibilità delle proteasi è diversa in

dipendenza dal fatto che la proteina sia libera o assorbita. Nello schema vediamo i vari peptidi

generati dall’azione della tripsina; l’enzima è sempre quello, la proteina anche, e a parità di

tempo ho diversi risultati. Quello che è cambiato è l’accessibilità dei siti. Quella verde è nativa,

quella blu è impattata sulla NP, e ha reso più accessibili i residui bersaglio, che vengono

aggrediti più in fretta perché la struttura che si viene a generare ha esposto le zone idrofobiche

verso la NP e tutto ciò fa sì che la proteina sia più facilmente aggredibile. La differenza tra il

tracciato rosso e quello blu sono le dimensioni della particella di stirene associata alla proteina.

Infatti quella rossa è 46 nm mentre quella blu è 200 nm. La proteina adsorbita sulla NP più

piccola è meno aggredibile dalle proteasi, e lo si nota sia da picchi più bassi, che dalla

numerosità di peptidi aggredibili (numero di picchi).

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Nel caso dell’emulsione, abbiamo una fase idrofobica liquida e quindi ho una penetrazione (non

è attaccata alla superficie). Per avere più informazioni sulle modificazioni strutturali vado a

vedere se la BLG in presenza di olio (emulsione) ha la stessa suscettibilità alla tripsina rispetto

a una proteina nativa (nera) e rispetto a una NP a 200 nm. La proteina si modifica in maniera

diversa sia dalla nativa, che da quella adsorbita.

Questi sistemi vengono riconosciuti dalle nostre cellule in maniera diversa. Il seguente è

l’assorbimento da parte di monociti umani (cellule spazzino del nostro sistema immunitario)

da parte della stessa proteina nei 3 sistemi precedenti:

la prima è la proteina emulsionata, l’ultima è la

proteina nativa. Questo vuole dire che la mia

proteina emulsionata viene assorbita molto più

facilmente, quindi molecolarmente le

modificazioni strutturali espongono delle zone

che vengono riconosciute subito. Questa cosa

può essere positiva o negativa: negativa perché

se un allergene è emulsionato entra più

facilmente, mentre positivo se la proteina mi

serve per un intervento mirato in un farmaco, entra più facilmente. Quella in mezzo è la

proteina adsorbita.

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Le denaturazioni condizionano notevolmente le funzioni delle proteine, perché molte volte la

presenza di emulsioni può causare competizione tra le proteine.

Stabilizzazione di emulsioni da parte delle proteine della soia

Le proteine della soia stabilizzano le emulsioni con il vantaggio che creano meno fase

dispersa, quindi posso usare meno olio e creare per esempio una maionese alleggerita, perché

ho messo meno tuorlo, più soia e mono olio. Faccio l’emulsione con gli isolati di soia e vado a

vedere la fluorescenza. La struttura della proteina è notevolmente cambiata, e lo vedo

dall’intensità e dal picco. La proteina quindi all’interno dell’emulsione assume una struttura

diversa da quella nativa. Ma l’aspetto importante è che aggiungendo un denaturante, come

l’urea (che espone le zone idrofobiche), cambia ancora lo spettro e quindi la proteina assume

una struttura consona all’ambiente.

Faccio l’emulsione e vado a vedere separandola quella che è legata all’olio, da quella che non si

è legata all’olio. Posso dire che vedendo la fase legata alla fase lipidica, la struttura dello spettro

è diversa (dal massimo di emissione spostato), invece nella fase acquosa lo spettro è

perfettamente uguale. Questo discorso mi dice che quando faccio un’emulsione la proteina che

si modifica è solo quella che serve a stabilizzare la fase idrofobica, e se io ne ho messo un

eccesso, il resto non si è affatto modificato, e questo lo devo considerare; infatti se quella

emulsionata è più stabile, quella nativa magari è meno stabile e può precipitare.

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Denaturazione meccanica

Sono denaturazioni indotte principalmente (non c’è mai un solo agente) da un agente

meccanico. I seguenti sono 4 tipi di processi in cui c’è denaturazione meccanica.

Affronteremo la formazione dell’impasto e le trasformazioni a carico del latte

(omogeneizzazione e filatura a caldo).

Per azione meccanica si intende un’azione legata a impastatrici, miscelatori, passaggio del

prodotto attraverso un ugello con variazione di pressione, oppure un pompaggio.

Una proteina sottoposta ad azione meccanica subisce una denaturazione con le stesse regole

del trattamento termico, cambia solo l’agente (vedi pag 32). L’entità del fatto che la

modificazione sia reversibile o meno è dipendente dall’intensità e dalla durata del trattamento

e anche dall’eventuale presenza e interazione con altri componenti degli alimenti (proteine,

lipidi, trigliceridi, polisaccaridi). Analogamente l’effetto sulla struttura di un trattamento

meccanico ha gli stessi bersagli del trattamento termico, quindi le interazioni deboli (a

idrogeno, elettrostatico, idrofobico) che stabilizzano la struttura secondaria, terziaria e

quaternaria delle proteine. Anche per il trattamento meccanico si verificano gli scambi di

disolfuro.

Modificazioni che si verificano ai principali componenti della matrice alimentare

in cui abbiamo una denaturazione meccanica

L’esempio più importante è la formazione di impasti. Presenteremo l’impasto della pasta e

quello del pane.

Impasto da pasta secca: semola, acqua e azione meccanica. Si parte dalla semola, che è

costituita da una certa quantità di acqua 10/12%, un 10/15% di proteine, e il resto è frazione

polisaccaridica (amido). Le proteine principali presenti nella semola sono il complesso del

glutine. Il glutine è fatto da gliadine (solubili in soluzioni alcoliche) e glutenine (solubili in

soluzioni debolmente acide). Gliadine e glutenine sono responsabili di 2 parametri importanti

dell’impasto: la sua estensibilità e la sua tenacità. Le altre proteine (circa il 20% della

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frazione proteica della semola), che sono le albumine e le globuline, sono interferenti dal punto

di vista della formazione dell’impasto, e nel frumento sono molto basse. Gli impasti senza

glutine hanno invece molto alte albumine e globuline.

Nel momento in cui vado a fare l’impasto aggiungo alla semola acqua e svolgo un’azione

meccanica di impastamento. L’amido (se non è stato danneggiato) durante il trattamento si

idrata in maniera molto superficiale e minima; invece le proteine per prima cosa si trovano in

un ambiente con molta più acqua, e quindi cambia la polarità dell’ambiente, e come primo

effetto le proteine subiscono un cambiamento di struttura (denaturazione), alimentato ancor

di più dal fatto che è in corso un’azione meccanica. Questo si traduce in un’esposizione dei siti

idrofobici, quindi le proteine tendono ad associarsi, e si traduce anche in uno scambio di

disolfuri se le proteine sono ricche di SH. Gliadine e glutenine sono ricche di ponti disolfuro

(ricche di cisteine) quindi formano ponti disolfuro intercatena. Tutto questo porta alla

formazione di un reticolo proteico, molto ordinato, con delle maglie ben precise e piccole, al

cui interno viene trattenuto il granulo di amido. Per avere un reticolo perfetto la prima cosa è la

qualità delle proteine, in grado di formare legami intercatena. Ovviamente la formazione del

reticolo avviene solo grazie all’azione meccanica.

La fase successiva della preparazione della pasta è la formatura, quindi creo maccheroni etc.

La fase successiva è l’essicazione, in cui viene gradatamente allontanata l’acqua senza rompere

il reticolo proteico. Questa è la fase più costosa e delicata del processo. Un altro aspetto

importante è che la fase di essicamento consolida il reticolo e lo stabilizza. È importante la

scelta delle temperature di essicamento, essicco a temperature più elevate se la semola ha fatto

un reticolo poco tenace.

Un reticolo più tenace e più piccolo possibile è importante per la fase di cottura; in questa fase

cuocio in acqua la pasta, e avviene la gelatinizzazione dell’amido: il granulo si rigonfia,

gelatinizza e diventa più solubile. Se il reticolo proteico non riesce a trattenere l’amido che si è

gonfiato, la pasta diventa colla, perché l’amido forma uno strato superficiale e appiccica. Se

faccio scottare la pasta delle lasagne aggiungo dell’olio così forma uno strato sopra la pasta e

non permette all’amido di fare uno strato sulla superficie. In tutti gli impasti senza glutine devo

aggiungere degli amidi modificati che mimano il comportamento dell’amido.

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Per aiutare a formare un reticolo devo aggiungere un agente reticolante. Per esempio il grano

tenero formava un reticolo non così tenace e compatto, quindi si è deciso di aggiungere l’uovo,

perché l’albume è in grado di formare un reticolo con interazioni S-S. L’uovo non è molto usato,

ma è fattibile anche per fare impasti gluten-free. La definizione delle caratteristiche intrinseche

del glutine non è semplice, perché molte semole sono molto simili, ma cambia la loro qualità

nel fare l’impasto; quello che cambia è la posizione dei residui di cisteina all’interno delle

gliadine e delle glutenine. Da qui ne derivano i diversi costi delle semole, in base alla qualità

della semola. Ogni pastificio ha una miscela tipica su cui basa tutta la produzione.

Come posso vedere sulle semole la diversa strutturazione delle proteine che ne influenzano la

qualità. Ci sono una serie di metodi per definire la qualità e le caratteristiche del prodotto:

• metodi reologici (quanto si estende, quando perde cottura…)

• metodo basato su come il reticolo è strutturato

• sistema molto sofisticato basato su una valutazione prima e dopo cottura all’interno della

pasta, della mobilità dell’acqua che rimane nei confronti sia dell’amido che delle proteine.

In una pasta di buona qualità il reticolo è regolare e definito, in una pasta di cattiva qualità il

reticolo non è regolare e ha dimensioni maggiori, e ciò si traduce in un rilascio dell’amido

durante la cottura. Ovviamente per avere un reticolo buono occorre la qualità della semola e si

può intervenire in modo modesto anche durante l’essicamento.

Per capire come sono organizzate le proteine del glutine posso usare diversi metodi:

Posso andare a vedere sia

sull’impasto che sulla pasta essiccata

da quali interazioni sono stabilizzate

le proteine che partecipano alla

formazione dell’impasto. Quando io

vado a fare il reticolo del glutine, vado

ad esporre dei gruppi SH presenti,

un’eventuale esposizione di regioni

idrofobiche che poi si traducono nella

creazione del reticolo interproteico,

stabilizzato o da interazioni

idrofobiche, o da interazioni S-S. Se le

interazioni che stabilizzano un buon

reticolo sono uguali a quelle che

stabilizzano un cattivo reticolo, non posso

dire che la qualità dell’impasto dipenda

dalle interazioni del reticolo. Se invece noto

che le interazioni sono diverse, posso

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affermare che il reticolo è strutturato in maniera diversa.

Come posso andare a vedere la natura delle interazioni che costituiscono un reticolo proteico.

Il sistema che utilizzo è fare una solubilizzazione frazionata del reticolo proteico. Prendo il

prodotto, lo macino e lo tratto con un caotropo, come l’urea 8-molare (condizioni denaturanti).

L’urea rompe le interazioni tra proteine associate non covalentemente, quindi legate da

interazioni prevalentemente idrofobiche all’interno di una proteina, perché disorganizza

l’acqua. Quindi non rompe le interazioni S-S. Quindi se solubilizzo il campione in urea, noto

quante proteine si sono solubilizzate (perché il reticolo di per sé non solubilizza), ho un’idea di

quante proteine in questo reticolo formano associazioni prevalentemente idrofobiche. Le

proteine che non si solubilizzano sono associate mediante interazioni S-S. Se voglio sapere

quante proteine sono stabilizzate da interazioni S-S, devo solubilizzare utilizzando un agente

che rompe il ponte disolfuro, ovvero devo aggiungere un riducente, come il DDT (reattivo con

un gruppo SH e rompe il ponte disolfuro, ossidandosi). Posso aggiungere un riducente solo in

presenza di urea, perché in ambiente acquoso non solubilizzo niente. Quindi per sapere quante

proteine sono associate mediante S-S devo fare la differenza.

Un caso pratico è il seguente: abbiamo un’applicazione del metodo di solubilizzazione in cui ho

fatto la pasta con 2 semole: A e B, con caratteristiche diverse. Sono stati fatti 3 spaghetti con

ogni semola, e ogni spaghetto ha subito 3 diverse essicazioni a diverse temperature: bassa

temperatura significa tempi più lunghi, ma reazioni Maillard molto ridotte. Vediamo la

solubilizzazione a livello del fosfato, e con un tampone fosfato solubilizzo fondamentalmente le

albumine e le globuline, che è una frazione che non ci interessa più di tanto. Tuttavia noto che

in base alle temperature di essicamento, solubilizzo una diversa quantità di quelle proteine: la

temperatura nera solubilizza la minore quantità, quindi presuppongo che ci sia la maggior

polimerizzazione della frazione albuminica e globulinica; deduco che le altre 2 temperature

abbiano provocato una minore polimerizzazione di queste 2 proteine. Quello che interessa di

più è il ruolo dell’urea: anche in questo caso la quantità di proteine che solubilizza è maggiore

meno è intenso è il trattamento di essiccamento. Applicando l’urea/DDT raggiungo valori

molto alti ma anche qui noto che sono più alti nei trattamenti a basse temperature. Quindi

concludo che i trattamenti ad alte temperature formano un gran numero di polimeri, ma questo

è un aspetto prevedibile. Importanti da vedere sono i salti, che fanno notare quante proteine

sono stabilizzate dai vari tipi di interazioni. Vedo che l’interazione fra legami S-S è maggiore nel

prodotto che è stato trattato ad alta temperatura, mentre nei prodotto trattati a basse

temperature sono inferiori. Le strutture sono altrettanto compatte, ma quelle a basse

temperature sono associate da interazioni prevalentemente idrofobiche. Questo è legato alla

velocità di allontanamento dell’acqua. Tempi di essiccazione più lunghi semola grossa.

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Un altro parametro utilizzato per avere informazioni sul ruolo degli SH nel reticolo formato è

quello di andare a vedere la posizione degli SH all’interno del network proteico. Questi SH

possono essere più o meno accessibili al marcatore. Se gli SH sono tutti accessibili, il network

sarà meno compatto, perché se il network è compatto i marcatori non riescono a entrare. Poi

all’interno del network posso vedere se gli SH sono accessibili in presenza di tampone fosfato,

quindi sono esterni, oppure in presenza del caotropo (urea) e quindi significa che ho dissociato.

Ricordiamo che gli SH ci sono per forza, perché derivano da uno scambio di disolfuri e quindi

non vengono creati o distrutti. Questo schema mostra l’accessibilità degli SH negli spaghetti di

prima in presenza di fosfato e di urea. Notiamo che gli SH superficiali sono gli stessi, ma

aggiungendo l’urea ho un grosso incremento solo nel caso del network ottenuto con la bassa

temperatura. Ciò è coerente con ciò detto precedentemente, perché se tratto a basse

temperature ho molte interazioni idrofobiche, quindi aggiungendo l’urea le dissocio e ho molti

più tioli liberi segnati dal marcatore.

È stato visto che gli scambi di disolfuro sono legati a

come sono strutturate le proteine nella materia prima

di partenza.

Un sistema per vedere la struttura del reticolo è la

fluorescenza intrinseca, andando a veder come il

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triptofano è posizionato. Devo vedere lo spettro di fluorescenza, e lo faccio direttamente sul

solido. I 2 spettri rappresentano spaghetti trattati a temperature diverse, e sono diversi: hanno

un massimo e un’intensità diversa, quindi i triptofani sono strutturati in modo diverso in base

alle temperature di essiccamento. E questa strutturazione permane anche dopo la cottura.

Posso anche misurare l’idrofobicità superficiale: gli spaghetti trattati a diverse temperature

sono caratterizzati da diverse idrofobicità superficiali.

Tornando indietro, possiamo applicare queste misure anche alla

materia prima. Le proteine presenti hanno una diversa

strutturazione. Questa è la modificazione degli spettri della

semola e della farina man mano che si aggiunge acqua fino alla

quantità sufficiente.

Invece il grafico seguente raffigura il massimo di emissione (del

triptofano che viene esposto) in funzione della percentuale di

acqua, sia sulle semole che

sulle farine.

Nel caso delle farine

osservo aggiungendo acqua uno spostamento notevole,

che significa che le proteine sono state molto modificate.

Nel caso della semola invece noto che la partenza è già

diversa, quindi ho 3 semole e 3 partenze diverse, quindi

3 organizzazioni diverse. In più noto che aggiungendo

acqua non ho lo stesso salto che noto nella farina, ma è

molto minore, e in più le proteine della semola si sono

modificate molto poco. Quindi quando lavoro le semole

ho una modificazione strutturale molto ridotta, quindi è

molto importante la semola di partenza.

Le diverse modificazioni strutturali si traducono in una diversa idrofobicità superficiale. Essa è

correlabile ad un parametro W, un sistema che dà l’elasticità di un reticolo, e dice come

l’organizzazione strutturale si correla con il parametro di estensibilità della farina. Da qui

decido quale prodotto una farina è più adatta a fare.

Il pane: nella produzione del pane abbiamo la formazione di un impasto. Ho la farina (o

semola) a cui aggiungo acqua, e si forma un impasto leggermente diverso a quello della pasta.

La sua principale caratteristica è il reticolo proteico stabilizzato dalle stesse interazioni della

pasta, ma la differenza sostanziale è che l’impasto da pane è soggetto a lievitazione, in cui

l’agente lievitante produce una alveolatura all’interno dell’impasto. L’impasto quindi deve

sopportare la lievitazione, quindi deve estendersi, ma non troppo, occorre perciò un

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compromesso tra tenacità ed estensibilità. Quindi già la scelta della farina è diversa rispetto

alla semola per fare la pasta, e ovviamente si tiene conto anche della lievitazione che si deve

fare. Se io voglio un reticolo non tenace, se voglio fare la pasta frolla, devo formare un reticolo

destrutturato, quindi aggiungo dei grassi (burro), che interferiscono ed evitano la

strutturazione del reticolo. Infatti la pasta frolla richiede un impastamento rapido e si

utilizzano farine a bassa forza, ovvero con del glutine che non tendono a formare un reticolo

compatto.

Nella cottura della pasta abbiamo visto la gelatinizzazione dell’amido, che prende acqua e si

ingrossa. Invece nella cottura del pane avviene comunque la gelatinizzazione dell’amido, ma la

cottura non avviene in acqua, quindi l’unico modo è prendere l’acqua dalle proteine. Quindi

quando cuocio il pane ho una sottrazione di acqua dalle proteine e quindi ottengo una

consolidazione del reticolo proteico formato in fase di impasto e della lievitazione. La

migrazione di acqua dalle proteine può essere aiutata da coadiuvanti tecnologici. La migrazione

dell’acqua alle proteine è alla base dell’ultima fase, quella di raffermimento. Le caratteristiche

di un raffermimento di un pane sono 2: il pane diventa molle e poi diventa sbriciolabile. Infatti

l’amido gelatinizzato nel tempo va incontro dal punto di vista termodinamico a una

retrogradazione, ovvero diventa una struttura geometrica più ordinata. Questa struttura lega

meno acqua e quest’acqua torna sulle proteine. Le proteine presenti in questo reticolo

cambiano la struttura, che si traduce in un rammollimento del prodotto. Col tempo quest’acqua

evapora e con il tempo l’alimento diventa duro. Per rallentare l’evaporazione ci sono i vari

packaging, per esempio aggiungo dei lipidi, oppure lo conservo nella carta, oppure faccio il

pane integrale, che ha la fibra che assorbe acqua, oppure aggiungo dei polisaccaridi particolari

che sono avidi di acqua. Questo gioco dei polisaccaridi del facilitare la ritenzione di acqua, è alla

base dell’utilizzo di certi enzimi termostabili (tipo amilasi) che idrolizzano specificatamente

quando sono in fase di gelatinizzazione dell’amido e rendono più lenta la migrazione

dell’acqua. Invece un’accelerazione di questi fenomeni si ha sul pane precongelato, perché il

congelamento porta a una veloce migrazione dell’acqua verso le proteine e quindi si sbriciola

subito.

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Omogeneizzazione

Perché si omogeneizza? Perché le macrostrutture (nel caso del latte globuli di grasso o micelle

di caseina) che tendono spontaneamente ad associarsi e separarsi dalla matrice acquosa in cui

si trovano, e quindi a formare 2 fasi, aspetto non gradito al consumatore. Con

l’omogeneizzazione si è visto che questo evento fisico spontaneo può essere ritardato facendo

sì che tute queste macrostrutture diventino più piccole e tutte uguali. L’omogeneizzazione

avviene facendo passare il prodotto in un ugello sotto pressione a temperature controllate, e in

questo modo ottengo globuli di grasso e micelle di caseina con dimensioni uguali e molto

piccole, che evitano durante il periodo di conservazione separazioni di fase. Questo

trattamento lo posso fare sul latte intero e anche sulla panna, che avendo più grassi è a più alto

rischio di separazione. Questo processo viene fatto normalmente prima del trattamento

termico.

Effetti dell’omogeneizzazione sul globulo di grasso

Il globulo di grasso è costituito da un centro fatto da

componente lipidica (idrofobica), e intorno ha una membrana

monostrato, fatta esattamente come una membrana biologica:

fosfolipidi on la parte idrofobica verso l’interno e parte

idrofilica verso l’esterno; in più ha delle proteine integre di

membrana, oppure transmembrana, oppure glicoproteine.

Se io ho un globulo di grasso con una certa circonferenza e lo divido in 4 aumento la

circonferenza, eppure questi globuli di grasso sono perfettamente in emulsione con la mia fase

acquosa, perché per azione meccanica e per variazione della pressione a cui viene mandata

attraverso l’ugello si formano 4 globuli più piccoli formano una membrana mista costituita da

pezzi della membrana e da caseine. Per questo motivo questi globuli sono perfettamente

emulsionati. Ovviamente il processo è aiutato dalla temperatura, che facilita la formazione

della membrana.

Un esempio è il seguente: è una SDS

(separazione elettroforetica) delle

proteine presenti. Il campione 3 è una

panna cruda (né omogeneizzata né

trattata termicamente): noto che ho

solo degli alti pesi molecolari, e ho le

proteine 3, 12 e 15, che sono le tipiche

proteine presenti nel globulo di

grasso. Noto che non ci sono né

caseine, né sieroproteine, perché se ci

fossero avrebbero la separazione

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elettroforetica indicata nel campione 4 o nel 5. Il campione 4 è la stessa panna che è stata

omogeneizzata. Rispetto al campione 3 ho ancora le proteine della membrana dei globuli di

grasso, ma ho anche una quantità considerevole di caseina. Il campione 5 è il campione 4 che è

stato pastorizzato. In più oltre al campione 4 ci sono delle sieroproteine, perché il trattamento

termico ha fatto sì che sulle caseine presenti sulla membrana del globulo di grasso, potessero

associarsi delle proteine, in particolare la BLG, che fa gli scambi di disolfuro. Ma le

sieroproteine sono meno presenti delle caseine, perché queste ultime rispondono meglio al

fatto di proteggere il centro idrofobico dei globuli di grasso. Il campione 2 è la panna venduta

come pastorizzata; essa ha molte caseine e poche sieroproteine, quindi si può dire che è

omogeneizzata. Il campione 3/4/5 è seguito nella sua stoia e quindi più comprensibile.

Un altro aspetto interessante è che il globulo di grasso è organizzato diversamente e un

esempio per vedere ciò, lo si può vedere studiando la suscettibilità del globulo di grasso agli

enzimi che normalmente agiscono sui globuli di grasso: le lipasi. Per vederlo aggiungo l’enzima

e poi misuro la variazione di pH (derivante dalla liberazione di un acido grasso dovuta

all’azione della lipasi). Questo schema rappresenta la

suscettibilità del globulo di grasso a una quantità fissa di

enzima. Entro un certo limite di pressione a cui agisco non

ho una variazione sostanziale, poi ho un aumento, quindi

vuol dire che il globulo di grasso è cambiato nella sua

struttura intrinseca, infatti è più aggredibile dalla lipolisi.

L’effetto pratico che ne deriva è duplice: il cambio della

shelf life e anche durante il processo di omogeneizzazione,

in cui se non tengo perfettamente conto di tutto, può

partire la liberazione di acidi grassi e quindi

all’irrancidimento.

Concludendo si può dire che il globulo di grasso a seguito di una omogeneizzazione è diverso

sia da come è composta la sua membrana, sia da come è organizzato strutturalmente.

Effetti dell’omogeneizzazione sulla micella di caseina

Per azione meccanica le micelle diventano tutte uguali e

tutte più piccole.

In un prodotto omogeneizzato ho una minor distribuzione

delle dimensioni delle micelle.

Se utilizzo il latte omogeneizzato per la caseificazione, esso

si comporta in maniera totalmente differente rispetto a un

latte non omogeneizzato. Lo schema rappresenta la

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variazione di luminosità che segue la formazione del coagulo di uno stesso latte. Il pallino vuoto

è latte crudo senza un trattamento di omogeneizzazione. Notiamo un graduale aumento di

luminosità, fino alla presa del coagulo, dove linearizza l’andamento. I pallini neri

rappresentano latte trattato a 50/55°C senza omogeneizzazione. Ha un andamento simile ma

meno luminoso, e anche il punto di coagulazione è uguale. I quadratini trattano latte

omogeneizzato, uno a 55°C e uno a 75°C. l’andamento dei quadratini è diverso, non tanto nel

raggiungimento, ma nell’andamento stesso. In più i tempi di coagulazione sono leggermente

spostati. Quindi nel caso della omogeneizzazione non riesco ad avere un coagulo che diventerà

formaggio. Questo è un altro esempio del latte coagulato, in cui

viene misurata l’idrofobicità superficiale durante il

tempo di coagulazione. I tracciati quadrati hanno un

andamento particolare: arrivano fino alla coagulazione

quasi stazionari, poi hanno un brusco aumento di

idrofobicità superficiale. Invece i pallini sono più

lineari. Anche qui notiamo che il coagulo è molto

diverso. E questo si traduce in una diversa capacità di

trattenere i globuli di grasso e un diverso reticolo, e ho

la conferma che il latte omogeneizzato non è adatto a

formare un coagulo che diventerà formaggio.

Ricordiamoci che durante la omogeneizzazione abbiamo solo assistito a un cambiamento di

struttura del grasso e della caseina, non ho aggiunto né tolto niente.

Un ultimo aspetto è legato a come lo stesso trattamento meccanico fatto su una stessa matrice

variando i parametri operativi, possa produrre un prodotto rispetto ad un altro. Per esempio la

panna: posso omogeneizzarla o meno, ma di solito la omogeneizzo. Se faccio lo stesso

trattamento meccanico, ma lo faccio a pressione ambiente e a bassa temperatura (4°C), non

ottengo la panna omogeneizzata, ma ottengo il burro. Infatti rompo il globulo di grasso, ed

esso espone tutte le sue zone idrofobiche e tende ad associarsi idrofobicamente con le altre

diverse parti idrofobiche, quindi forma associazioni legate da interazioni idrofobiche. E l’acqua

viene confinata, ovvero si forma una micella inversa, fatta da una fase continua lipidica e una

fase inversa, che è l’acqua. Ovviamente per fare il burro devo partire dalla panna, e non dal

latte, perché devo avere molti grassi. Per ottenere il burro concentrato lo sciolgo e lo

riconcentro. Se voglio un burro più ricco d’acqua però devo salarlo, perché altrimenti avrei

troppa acqua libera per la crescita microbica.

© Laila Pansera - 72

Denaturazione enzimatica

Il primo esempio è il ruolo di alcuni enzimi in alcune fasi di trasformazione che portano alla

produzione del formaggio. Il processo tradizionale è la caseificazione, a cui segue la

maturazione del formaggio, poi ho altri interventi tradizionali in cui intervengono i coadiuvanti

di processo, altri in cui produco e rilascio gli aromi e infine la stabilizzazione delle bevande.

Nella produzione del formaggio la prima fase è la caseificazione, ovvero tutte le modificazioni

a carico della micella caseinica che portano alla formazione del coagulo, una rete proteica al cui

interno viene tenuta acqua, sali minerali e la frazione lipidica. Un ruolo fondamentale nella

formazione del coagulo che dà origine al formaggio è svolto dalle proteasi coagulanti, ovvero

le proteasi specifiche che vengono impiegate per idrolizzare specificatamente la caseina.

Queste proteasi sono 3 gruppi: la rennina (di origine naturale o ricombinante), le proteasi da

muffe e alcune proteasi vegetali. È importante che queste proteasi agiscano sul residuo 105-

106 del residuo di k-caseina, perché facendo questa idrolisi parziale crea il presupposto perché

la micella caseinica si destabilizzi e formi un reticolo proteico preciso che forma il coagulo. La

rennina ha una alta specificità per questo residuo, per questo è la prima usata. Se uso un’altra

proteasi, per esempio se uso la tripsina, che agisce su tutti i residui basici, essa agisce in diversi

punti e non forma il coagulo, ma diversi peptidi. Le altre proteasi citate hanno la caratteristica

di avere una peculiarità di azione limitata solo su alcuni residui di caseina, e quindi possono

formare il gel desiderato, che se non si forma, ho un’idrolisi molto spinta e non formo il

coagulo. La rennina è famiglia di 2 proteasi, che sono normalmente presenti nello stomaco dei

mammiferi. Esse sono la chimosina (aspartico proteasi) e pepsina (aspartico proteasi).

Mentre la pepsina ha un’azione su tutti i residui di aspartico e ha la stessa affinità sui 3 tipi di

caseina, la chimosina presenta una diversa affinità per le diverse caseine, in particolare ha

un’altissima affinità con la k-caseina, che deriva dalla sua specificità sul residuo 105-106.

Quindi solo la chimosina crea i presupposti per il coagulo, la pepsina no.

La rennina che solitamente viene usata è quella presente nello stomaco dei vitelli e on dei

bovini. Questo perché in un caglio da stomaco di vitello il rapporto tra chimosina e pepsina è

ideale, mentre con la crescita dell’animale viene selezionata la pepsina e quindi ne abbiamo in

quantità maggiori. Alternativamente, se non voglio prenderla dagli animali, devo usare la

rennina ricombinante, ottenuta da microrganismi. La scelta della rennina dipende dalle

caratteristiche del prodotto che voglio ottenere. Queste diverse affinità fanno sì che questo

enzima sia stato pensato per fare tutta la filiera del formaggio, perché ha una fortissima affinità

con la k-caseina, quindi serve per la coagulazione, e una bassa affinità con le due fasi che

rimangono, e questo viene sfruttato per la fase successiva.

In alcune realtà, per produrre soprattutto formaggi tipici, vengono utilizzate delle proteasi

sostitutive, che fanno un coagulo con delle peculiarità caratteristiche, diverse da quelle del

coagulo ottenuto con la chimosina. Qui posso fare 2 scelte: utilizzare le proteasi da muffe, che

fanno un coagulo molto simile a quello fatto dalla chimosina; esse vengono usate quando non

© Laila Pansera - 73

viene ritenuto etico utilizzare un enzima da animali. Ovviamente non creo un prodotto

identico, ma che si avvicina a quello che ottengo con la rennina. Oppure posso utilizzare delle

proteasi vegetali, estratte dal cardo o dal carciofo (e molto meno da ficina e papaina), e con

questi si producono formaggi tipici dell’area mediterranea. In conclusione l’utilizzo sostitutivo

della chimosina viene fatto per ragioni di tipicità e per questioni etiche.

Come posso seguire la formazione del coagulo e perché si forma un coagulo con determinate

caratteristiche

L’azione della chimosina è specifica sulla k-caseina, e solo nella struttura della micella e solo

idrolizzando le zone specifiche mi comportano all’interno della micella una serie di

modificazioni della sua struttura quaternaria che vanno verso la formazione del coagulo. In

latti in cui la k-caseina è assente ma molto poca, l’azione enzimatica può avvenire, ma non

porta a tutte le modificazioni a carico della micella che mi portano alla formazione del coagulo.

Un esempio è che i latti dei monogastrici (che non hanno k-caseina) non sono coagulabili.

Questa è una rappresentazione di quello che avviene durante l’azione della chimosina.

Idrolizzando specificatamente sul residuo 105-106 della k-caseina, ho una destabilizzazione

della micella che favorisce 2 aspetti: l’associazione fra le diverse micelle, e quindi cominciano a

formarsi degli aggregati, che all’inizio sono perfettamente solubili (e quindi

macroscopicamente non si vedono, ma si vedono misurando la luminosità), e poi la gelazione o

coagulo, ovvero la formazione di una fase compatta solida che vedo macroscopicamente. La

gelazione è la fase più importante per condizionare tutto il processo successivo. Durante la

gelazione si forma il reticolo, che deve trattenere all’interno tutti gli altri componenti,

soprattutto la fase lipidica e l’acqua. Chiaramene il reticolo deve essere stabilizzato, perché

altrimenti le micelle di caseina continuerebbero ad aggregarsi fra di loro e la rete diventerebbe

sempre più compatta, si creerebbe un’associazione fortissima di caseine che provocherebbe

l’espulsione degli altri componenti (sineresi).

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Quando sono al punto ottimale di gelazione per evitare la sineresi devo fare la rottura della

cagliata, ovvero rompo il reticolo per evitare che diventi più fitto. Poi devo procedere con la

formatura etc.

È difficile stabilire con parametri oggettivi il punto di gelazione ottimale, che viene stabilito a

occhio da un esperto.

Chiaramente l’azione dell’enzima e quindi la formazione del coagulo dipende da come è

accessibile il substrato. E abbiamo già visto che la micella di caseina se sottoposta a

trattamento termico o di omogeneizzazione viene modificata, pur essendo perfettamente

stabile. Nel caso del trattamento termico la micella di caseina contiene la k-caseina che è

glicosilata e ha un residuo di cisteina, che può fare scambio di disolfuro con chi ha residui SH,

come la BLG, quindi la k-caseina può legare piccole quantità di BLG. Un altro effetto è che il

trattamento termico prolungato può distruggere alcuni residui –R, oppure far avvenire reazioni

di Maillard o glicazione.

In questo grafico già visto è rappresentata

la variazione di luminosità che viene

seguita per vedere l’azione dell’enzima e

quindi la formazione del coagulo (croce).

Prima della formazione del coagulo ho una

serie di variazioni di luminosità che

dimostrano l’attività dell’enzima, e sono

diverse se si parla di latte crudo o latte

trattato termicamente. In questi 2 casi il

tempo di coagulazione è uguale, ma il tipo

di coagulazione è diverso. Un trattamento

termico in caldaia è positivo per la formazione del coagulo, perché dà stabilità al latte e

aumenta le rese: infatti le sieroproteine se ne vanno quando si forma il coagulo, però se esse

sono legate alla k-caseina (tipo BLG con S-S con k-caseina), rimangono nel coagulo. Ovviamente

è positivo questo fatto se non è esasperato. Infatti se sterilizzo il latte e creo troppi legami tra

sieroproteine e k-caseina, precludo i siti di azione della chimosina, perché le SH sono vicine al

residuo 105-106, e non formo il coagulo. Nel latte omogeneizzato la formazione del coagulo ha

un andamento molto diverso rispetto a quello osservato nel latte trattato termicamente o nel

latte crudo. Lo si vede nell’andamento della curva. A parte il fatto che la curva è più bassa e che

il punto di coagulazione è più spostato, ciò che fa sì che il coagulo non abbia le caratteristiche

ottimali è la prima fase. Notiamo che prima che avvenga un’associazione deve essere

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idrolizzata una certa quantità di caseina, e quindi l’associazione tra micelle che si va a formare

è diversa rispetto al latte non omogeneizzato, e questo fa sì che io non abbia il coagulo che mi

serve per i formaggi. Una conferma della diversità nella prima fase

(di associazione) l’abbiamo anche in questo

grafico in cui sono rapportate le variazioni di

idrofobicità fatte con il metodo di fluorescenza

estrinseca nel tempo di coagulazione. Nei 2

tracciati omogeneizzati ho un’idrofobicità

costante e un salto al momento della

coagulazione. Invece il latte non omogeneizzato

ha una graduale variazione di idrofobicità,

caratteristica della formazione di una specie associativa particolare.

I latti si differenziano per la struttura delle diverse caseine, e quindi ho diverse strutture

quaternarie che mi fanno ottenere diversi coaguli.

Per alcuni formaggi c’è la cosiddetta fase di maturazione, che può avere diverse durate in

dipendenza dai diversi prodotti. Durante la maturazione del formaggio avvengono

fondamentalmente eventi idrolitici, ovvero eventi di idrolisi a carico delle 2 principali frazioni

di macromolecole presenti: la frazione proteica, quindi avrò proteolisi, e la frazione lipidica,

quindi avrò lipolisi. Di lattosio ne ho pochissimo, perché se ne va nel momento in cui rompo il

coagulo e tolgo la fase acquosa. I formaggi a lunga maturazione vanno bene per gli intolleranti

al lattosio, non perché esso viene idrolizzato durante la lavorazione del formaggio, ma perché

lo tolgo prima: più un formaggio va in maturazione, più siero ho tolto e quindi più lattosio ho

tolto. Gli eventi idrolitici avvengono a carico della caseina e dei trigliceridi, che vanno a creare

la texture del prodotto. Ovviamente l’idrolisi non deve essere totale, altrimenti otterrei una

sospensione e una eccessiva liberazione di acidi grassi con annessi odori tipici (es: acido

capronico) e irrancidimento.

In una maturazione del formaggio abbiamo 3 fasi:

• Idrolisi parziale da parte della rennina nei confronti della caseina; infatti abbiamo visto che

la rennina ha un’alta affinità con la k-caseina, e una molto più bassa verso la αs1-caseina e

la β-caseina. Il substrato di k-caseina non c’è più, quindi la rennina agisce in maniera

limitata sulle altre caseine, formando peptidi ad alto peso molecolare.

• Idrolisi dei peptidi da parte delle proteasi presenti nei batteri, che possono essere

microrganismi autoctoni (che si sono selezionati nel latte), oppure batteri starter che si

sono aggiunti per facilitare la maturazione. Posso per esempio aggiungere il pellicillum per

ottenere formaggi erborinati.

• Ulteriore idrolisi fino ad arrivare ai singoli amminoacidi, oppure ai derivati dei singoli

amminoacidi (ammine biogeniche presenti in alcuni formaggi a lunga maturazione).

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Questi eventi si verificano interamente se il formaggio è a lunga maturazione, oppure

parzialmente in base alla lunghezza della maturazione.

Qui abbiamo i tracciati elettroforetici

relativi a un taleggio e un quartirolo. Per il

taleggio devo confrontare il 6, l’8 e il 9. Il

campione 6 è il taleggio che entra in

maturazione, il campione 8 il taleggio in vita

commerciale, il 9 è supermaturato. Nel 6 la

frazione α e β caseina è presente, sotto

abbiamo la massa nera che sono frammenti

peptidici, tra cui la BLG (il taleggio è stato

fatto con latte scaldato in caldaia). Il

campione 8 presenta una α-caseina quasi sparita, mentre la β c’è ancora. Se avessi un’idrolisi

totale delle caseine, come nel 9, avremmo un prodotto non apprezzato molto dai consumatori,

che si disfa. nel 9 noto anche che il macchione sotto è aumentato, ovvero ho molti composti a

basso PM, e si sono formati peptidi molto piccoli che non si vedono in questa SDS. Il quartirolo:

il campione 2 è prima della maturazione, il 3 è a vita commerciale ottimale, il 4 è

overmaturazione. Nel 3 le frazioni caseiniche non sono drammaticamente cambiate, ma noto

un aumento dell’intensità delle bande sotto, per cui ho avuto una proteolisi. A overmaturazione

ho un idrolisi dell’ α-caseina, che è quella che viene sempre idrolizzata prevalentemente. Tutto

questo per dire che l’idrolisi è sempre limitata, ovvero non tuta la caseina viene idrolizzata

(vedi schema qui sotto: αs1 cala, β non cala fino a un certo punto, i peptidi aumentano).

Un altro aspetto importante è la variazione dell’idrofobicità superficiale che attesta le

modificazioni strutturali che avvengono nelle proteine del formaggio durante la maturazione.

Guardando il PSH partiamo da 0.5 e poi abbiamo un crollo d idrofobicità superficiale nei primi

7 giorni, poi abbiamo un aumento e n successivo crollo, questo dimostra che accanto a questi

eventi che liberano peptidi abbiamo modificazioni strutturali. Questo è importante per

standardizzare le produzioni e offrire al consumatore un prodotto sempre uguale.

I seguenti sono peptidi che vengono generati nella maturazione di un Parmigiano Reggiano:

molti derivano dalla β, molti dall’αs1 e molti dall’αs2. Quelli derivanti dalla β sono quelli più

lunghi, perché la β è quella che viene idrolizzata meno.

© Laila Pansera - 77

Questi peptidi vengono cercati per 2 scopi:

Standardizzare;

o se anche solo uno di questi peptidi si formasse durante un tipo di produzione, la presenza

o di questo peptide sarebbe il parametro che identifica l’avvenuto processo.

Il problema è che non è un peptide che identifica il formaggio, ma l’insieme di peptidi.

Ora vediamo l’azione di enzimi nel caso di coadiuvanti di processo. Sono sempre enzimi

idrolitici, ma si cambia substrato. Quindi gli enzimi possono essere una miscela di proteasi e

enzimi che agiscono su matrici polisaccaridiche per risolvere ad esempio delle emulsioni.

Questo lo abbiamo già visto: nell’estrazione dell’olio dai semi otteniamo una fase acquosa,

una fase lipidica e una fase all’interfaccia. Per risolvere questa fase o si aggiungono solventi,

oppure taglio chi intrappola l’olio. Un altro esempio dell’utilizzo dei coadiuvanti è per

l’estrazione di alcuni componenti dalle matrici vegetali: spesso i polifenoli sono legati a

una frazione proteica o polisaccaridica, quindi se voglio aggiungere polifenoli a un prodotto

devo prima liberarli dalle fasi a cui sono legati, e lo faccio con i coadiuvanti. Un’ultima

applicazione dei coadiuvanti è quella per facilitare la solubilizzazione di bevande,

soprattutto per prodotti che subiscono istantaneizzazione.

Se voglio ottenere un succo da un frutto, in Italia ottengo succhi torbidi, mentre per esempio in

Germania ho succhi limpidi. Per ottenere un succo limpido devo idrolizzare la parete cellulare

del frutto, in modo tale che quando vado a filtrare ottengo un succo limpido.

Questi sono tutti gli enzimi normalmente impiegati per far sì che nel

momento in cui faccio un succo, venga limpido, perché essi agiscono

sulla fibra/matrice non amido (parete cellulare del frutto). Se non

voglio il succo limpido, non ho bisogno di questi enzimi.

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Eventi determinati dalla presenza di alcuni enzimi nell’alimento

Questi possono avvenire naturalmente, ma poi se studiati possono essere pilotati. Questi eventi

sono molteplici ma noi studieremo principalmente quelli a carico delle proteine. Gli eventi sono

fondamentalmente 2 e sono spiegati in questo schema.

Le proteine possono essere attaccate dalle proteasi, che rompono il legame peptidico. Le

proteasi possono essere costitutive dell’alimento, oppure nell’alimento possono essere

avvenute trasformazioni volute o meno ad opera di microrganismi che hanno un patrimonio

enzimatico, tra cui le proteasi. Questo può avere conseguenze positive, come l’aumento della

biodisponibilità degli amminoacidi, che sono immediatamente assorbibili, oppure come la

diminuzione dell’allergenicità del prodotto. Inoltre può aumentare la biodisponibilità dei

micronutrienti, e molto spesso comporta la produzione di biopeptidi, ovvero peptidi con azione

funzionale, in questo caso che intervengono nella regolazione di parecchi metabolismi, oppure

facilitano l’assorbimento di alcuni oligoelementi. Ci sono anche effetti negativi dell’azione

proteolitica, come la comparsa di sapore amaro: se ho come c-terminale un residuo idrofobico,

esso viene percepito come amaro.

In più ho un’azione sugli amminoacidi, che può essere collegata all’azione precedente. La

presenza di singoli amminoacidi può costituire il substrato per altri enzimi che possono essere

presenti nell’alimento, di cui quelli che ci interessano maggiormente sono gli enzimi con azione

di decarbossilazione. Essi tolgono il gruppo carbossilico dall’amminoacido, ma questo ha la

conseguenza della formazione delle ammine biogeniche, composti usati soprattutto dalle

cellule del sistema nervoso per tradurre un certo segnale. L’assunzione di ammine biogeniche

può portare ad alterazioni del metabolismo, con effetti più o meno gravi. Un altro effetto a cui

vanno incontro è l’imbrunimento enzimatico, che macroscopicamente è uguale a Maillard, ma

l’origine è diversa; infatti nel caso dell’imbrunimento enzimatico abbiamo delle ossidasi che

formano dei composti bruni che dal punto di vista chimico sono polifenoli e hanno una capacità

chelante nel confronto dei micronutrienti. L’imbrunimento enzimatico interessa soprattutto gli

alimenti vegetali.

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Peptidi bioattivi

Essi si originano dalle proteine per azione proteolitica. La proteasi (enzima):

• può essere presente nell’alimento come costituente dell’alimento, oppure può essere

derivante dall’azione di microrganismi, oppure può essere stata aggiunta nella

trasformazione dell’alimento (nella coagulazione del formaggio per esempio).

• Può trovarsi anche nel tratto gastro-intestinale, quindi quando digerisco o assorbo

l’alimento genero peptidi bioattivi.

Questi peptidi hanno molte funzioni:

- Immunomodulatoria, ovvero intervengono positivamente sulla regolazione del

sistema immunitario, per esempio facilitano la risposta da parte del sistema

immunitario nei confronti di qualcosa considerato avverso.

- Agonista o antagonista nei confronti di recettori nervosi, ovvero intervengono

regolando la risposta da parte delle cellule nervose.

- Antimicrobica

- Veicolante di micronutrienti, ovvero rendono più efficace l’assorbimento di un

determinato micronutriente, perché lo presentano in modo ottimale alle cellule

deputate al loro assorbimento.

Questi peptidi possono agire soli o in sinergia tra di loro.

Non tutte le proteine sono i precursori di proteine bioattive, ovvero perché si generi un peptide

bioattivo è necessario che nella proteina sia presente la sequenza tipica associabile a peptidi

bioattivi. Un secondo aspetto importante è che il peptide bioattivo, perché funzioni, deve essere

liberato. La proteasi deve liberarmi tutto il peptide bioattivo, non metà e non di più di tutto.

Una cosa che si è vista è che molti peptidi bioattivi vengono liberati da proteasi presenti in

microrganismi probiotici, molto importante.

Le principali fonti di peptidi bioattivi sono caseine, sieroproteine, e in minor quantità, il

glutine. Potremmo trovare anche la soia in questo elenco, ma la peculiarità è che lavora non

sui peptidi ma sulle proteine.

Il seguente è un elenco di peptidi bioattivi identificati nel latte. I fosfopeptidi sono considerati

peptidi bioattivi perché molti fosfopeptidi facilitano l’assorbimento del calcio e di altri metalli

(alluminio e zinco), molto importanti quando devo rigenerare le ossa. Le caseomorfine

derivano dalla β-caseina, sono degli oppiodi agonisti, quindi riducono a livello del sistema

nervoso lo stress (aiutano il sonno). Gli immunopeptidi sono degli immunostimolatori; le

caseochine sono ACE-inibitori, ovvero regolano la pressione sanguigna; infine abbiamo

caseoxine e lattorfine.

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Notiamo che questi peptidi bioattivi sono molto piccoli.

Questi studi vengono compiuti per capire dove possiamo trovare i peptidi bioattivi. Più un

formaggio è stagionato, più posso avere questi peptidi, oppure li posso avere in un latte

fermentato (yogurt).

Non basta la sequenza dei peptidi per la loro funzionalità, occorre che essi presentino una

certa strutturazione, e questa è stata una scoperta recente.

Un primo esempio è legato a uno studio fatto su dei peptidi c-terminali di β-caseina che hanno

un effetto immunostimolante. Il frammento p1 può essere frammentato in pezzettini fino ad

arrivare al frammento e1, formato da 1 residuo di prolina e dagli ultimi 3 amminoacidi (GPF).

Si è notato che anche il frammento e1 ha lo stesso effetto immunostimolante del p1, ma se al

gruppo GFP aggiungo l’amminoacido seguente, ovvero R (arginina), il peptide che si genera non

è più immunostimolante. Se aggiungo anche V (valina), il frammento ritorna a essere

immunostimolante, e continua ad esserlo aggiungendo anche gli altri.

Perché quando R è n-terminale questo peptide non è più immunostimolante, e se R non è più n-

terminale il peptide è immunostimolante? Da qui è partita un’osservazione sperimentale.

L’ipotesi era che i diversi peptidi immunostimolanti potevano avere una particolare

strutturazione che non era possibile nel caso in cui R fosse n-terminale. Per prima cosa per

vedere se i peptidi hanno una struttura o no è stato introdotto sul peptide più corto un

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elemento di rigidità, ovvero una D-prolina, un amminoacido chirale che impedisce certe

rotazioni che alla L-prolina sono consentite.

Questo grafico misura la capacità immunostimolante a 2 dosi fatta su cellule animali. Nella β-

caseina non ho una risposta proporzionale alla dose, quindi non funziona, in e1 e in p1 la

risposta è proporzionale, l’e2 è lo stesso peptide di e1 a cui ho aggiunto la D-prolina: la risposa

non è proporzionale, quindi non è immunostimolante.

Per vedere la struttura possiamo vedere la

presenza di struttura secondaria in questo schema.

In particolare se ho un massimo negativo, ho un’α-

elica. In p1 ho l’α-elica. In e1 ho un’α-elica, in e2 e

in p2 ho una struttura random. Rimane il dubbio

dell’arginina. Abbiamo visto che e1 ha una struttura

ordinata e ripiegata, grazie alla L-prolina che fa un

ripiegamento. Se metto la L-prolina, come in e2,

essa impedisce il ripiegamento e creo una struttura

non regolare, quindi la cellula non riconosce questa

strutturazione. Parlando del peptide più lungo se

aggiungo l’arginina R aggiungo 2 cariche positive, e esse

tendono a destabilizzare la struttura. Se invece aggiungo

la valina V, la carica positiva del gruppo amminico

dell’arginina fa legame peptidico con la valina, quindi è

possibile mantenere una struttura ordinata.

In poche parole la cellula non riconosce i gruppi

funzionali, ma la struttura complessiva che si forma.

Un altro esempio di come la strutturazione ha un aspetto

funzionale è rappresentato dai fosfopeptidi. Ovvero

l’attività di questi peptidi nel veicolare il calcio è strettamente dipendente da come questi

peptidi sono associati fra di loro. Il calcio nella cellula non è libero, poiché la sua presenza

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libero è altamente dannosa siccome è poco solubile e tossico. Quindi il calcio è presente nella

cellula chelato. È stato visto che molti casein-fosfopeptidi (CPP, frammenti peptidici derivanti

dalla caseina, fosforilati) hanno la capacità di aumentare l’assorbimento del calcio a livello

intestinale, ma non tutti hanno la stessa funzionalità. Qui di seguito sono riportate delle miscele

di fosfopeptidi tra le più usate. Commercialmente posso trovare anche degli altri fosfopeptidi

formati solo da α-caseina o solo da β-caseina, con prezzi diversi. Tutti chelano il calcio alla

stessa maniera, ma non sono tutti efficaci ugualmente quando si presentano all’osteoblasto.

Questo è

l’assorbimento di calcio a livello cellulare. La miscela è

inefficace, perché assorbe circa il 30% a fronte di un 179.

Qui vedo l’assorbimento del fosfopeptide con il

calcio da parte di cellule. Sono blu, quando

assorbono diventano verdi, poi è importante che

ritornino blu, perché mi dice che la cellula è

ritornata al suo ciclo vitale di partenza. In seguito vediamo le curve di assorbimento del

calcio. Nella prima vediamo quando il fosfopeptide è

costituito solo da frammenti di β-caseina, in mezzo

abbiamo la miscela dei 2 e in fondo abbiamo il

fosfopeptide derivante dall’αs1-caseina. Questo dato

mi dice che l’αs1-caseina non funziona: chela il calcio

ma non viene assorbita dall’osteoblasto. Quindi la

miscela è meno efficiente perché contiene l’αs1-

caseina, che non serve a assorbire il calcio.

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Come mai, siccome legano il calcio alla stessa maniera, alcuni fosfopeptidi vengono riconosciuti

dalla cellula e altri no? La risposta sta nel fatto che la diversità di fornire il calcio dipende da

come questi fosfopeptidi si associano fra di loro (quindi dalla struttura quaternaria che

assumono). In particolare i fosfopeptidi dell’αs1-caseina tendono ad associarsi con difficoltà,

quindi a non formare dei peptidi associati. L’aggregazione dipende dalle fosforilazioni.

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Quali reazioni più importanti avvengono nei componenti negli alimenti a causa di enzimi , perché

costitutivi dell’alimento derivanti da intervento microbiologico. Vediamo 2 reazioni che possono

avvenire a carico di aa , presenti nell’alimento quelli dell’altra volta si generano per azioni di

proteasi ( fino a singoli aa )

Le principali reazioni sono di due tipi : reazione di decarbossilazione , quindi privare l aa del gruppo

carbossilico , quindi ottengo le ammine biogeniche , es istamina , triptamina et o Composti usati

dalla cellula per trasmettere un segnale o per regolare il processo metabolico.

Un altro tipo di reazione riguarda l ossidazione di alcuni aa che è alla base dell’ imbrunimento

enzimatico , vediamo ora alcuni casi , alcuni composti che sono neurotrasmettitori che derivano da

aa decarbossilati.

Composti neurotrasmettitori

Serotonina derivante dal triptofano , il GABA dal glutammato , l’istamina dall’ istidina , la dopamina

dalla tirosina , l’ epinefrina è il precursore dell adrenalina , sono tutti neurotrasmettitori , agiscono

tutti sul sistema nervoso centrale o su altri tessuti specifici , l aspetto importante deriva da alcuni aa

, di qusti neurotrasmettitori , sono 3 i più importanti.

C’è una connessione tra questi neurotrasm e gli alimenti che si consumano, o con farmaci . Questi

neurotrasm , derivanti da questi aa , vengono normalmente prodotti dalla cellula in risposta ,

quando ne ha bisogno e vengono degradati quando cessano la loro funzione. Può succedere che

dopo un ingestione di certi alimenti magari associati con certi farmaci posso avere una circolazione

elevata di questi neurotrasm o pechè quelli endogeni nn sono degradati o perché consumando certi

alimenti io aumento la quantità circolante e in alcuni casi ha effetti positivi altri negativi.

Serotonina , istamina , dopamina ( tiramina )

Istamina ; istidina che è stata privata del gruppo carbossilico , la istamina viene prodotta in stati

infiammatori , istamina viene prodotta in caso di allergie , allergia ad alimenti , pollini , viene

prodotto in risposta a queste manifestazioni. Alcuni Alimenti sono ricchi in istamina son i formaggi

a lunga maturazione ,oppure nelle cellule in rapida riproduzione come i lieviti . Se io ho una

manifestazione allergica prendo l antistaminico ,intervengo sui mastociti , blocco la produzione di

istamina , il farmaco lavora contro tutta l istamina , se consumo alimenti ricchi in istamina l effetto

del farmaco viene ridotto .

Se ho un trattamento antistaminico non ha senso che io consumi questi alimenti. Gli alimenti ricchi

in istamina facilitano l insorgere di allergie . se devo abbattere la quantità di istamina è ovvio che

non prendo alimenti con cui introduco ancora istamina.

Ammina biogenica , derivante dal triptofano : la serotonina , alimenti ricchi di serotonina sono

cioccolato , banane , datteri , sono ricchi o in serotonina o in triptofano libero che può esser

metabolizzato in serotonina. La serotonina , serve per mantenere il buon umore , è una risposta

positiva verso l ambiente , mantiene il buon umore. La serotonina va in contro a un processo di

degradazione , un enzima chiave sono le MAO , e monoamminoossidasi .

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Molti Farmaci antidepressivi : bloccano questi enzimi , sono inibitori delle monoammino ossidasi ,

MAO , che tengono alti i livelli di serotonina . C’è un problema : le mono ammino ossidasi , gli stessi

enzimi , intervengono anche nella degradazione di tutta una serie di altri neurotrasmettitori non

derivanti dal triptofano ma dalla tirosina che sono la tiramina , da cui derivano tanti altri

neurotrasmettitori che servono in tanti processi di regolazione cellulare. La tiramina interviene

nella regolazione della pressione sanguigna , quand la cellula ha bisogno di innescare i prcessi che

regolano la pressione , produce tiramina a partire da tirosina.

La tiramina viene prodotta per regolare la pressione sanguigna , per elevare la press sanguigna

Se un alment è ricco di tiramina e ho problemi di pressione devo evitare questo alimento.

Si trova in avocado , cioccolato , caffè , lievito . Un altro aspett importante è che sono tutti

degradati da mono ammino ossidasi . Bisogna stare molto attenti tra il consumo di alimenti ricchi in

tiramina e farmaci antidepressivi ,. Se ho un consumo di farmaco antidepressivo e

contemporaneamente uso un apporto alimentare ricchi di queste ammine biogeniche il rischio è

elevato, io nn controllo più la pressione sanguigna. Ci sono stati casi di morte.

Alcuni alimenti sono stati accusati di essere ricchi di ammine biogeniche , quindi pericolosi per

soggetti o trattati con certi farmaci.

E’ grave associazione di farmaco antidepressive e alimenti ricchi in tiramina . sono positivi la

serotonina . Le ammine biogeniche sono legati agli alimenti

Alterazioni compositive indotte da processi di trasformazione

Enzimi che comportano processi di ossidazione a carico di gruppi oh , fenolici , che comportano a

lungo andare al formazione di polimeri bruni che sono alla base dell imbrunimento enzimatico ,

questi enzimi sono detti ossidasi , enzimi che sono attivi su specie dell ossigeno , hanno come

substrato l ossigeno , ossigeno come radicale , o come specie radicaliche OH .

Ossidasi : è definita come un enzima che comporta una reazione di ossidazione , quindi un

substrato viene ad essere ossidato e contemporaneamente , si riduce il substrato relativo all

ossigeno. Nella prima reazione l’ Ossigeno diventa acqua . in un'altra reazione l’ossigeno diventa

acqua ossigenata . Altra reaz l ossigeno diventa ione superossido .

Nei vegetali ci sono una serie di enzimi dette laccasi o polifenolo ossidasi che agiscono sui gruppi oh

di alcuni aa , es sulla tirosina , se lo ossidano fanno una serie di reazioni che si traducono nella

formazione di composti bruni. Ha una serie di passaggi questa reazione. L’enzima è la Polifenol

ossidasi che ossida .

Questo enzima : il gruppo R , o altri composti incolori viene ossidato a un composto che è marrone

, il chinone può polimerizzare con altri composti simili e forma il composto marrone.

La tirosina lavora di solito con la tirosina idrolasi , che libera tirosina , si ha una reazione di

ossidazione , nel gruppo oh della tirosina , alla fine ottengo un composto condensato che è la

melanina , se è sulla mela diventa marrone. Il primo passaggio , ovvero l ossidazione è la prima

reazione di partenza , quando ottengo il chinone tutto il resto è immediato , se io voglio prevenire

la formazione del composto bruno devo intervenire all’inizio , nella prima reazione di ossidazione.

© Laila Pansera - 86

Come faccio a bloccare il tutto? Devo abbassare il ph , e l enzima agisce più lentamente. Oppur

posso intervenire usando un altro riducente , es metto acido ascorbico , il dopachinone reagisce

con ac ascorbico ,si forma il dopa idrochinone , composto che nn può idrolizzare. Il dopa chinone è

il composto chiave. Quindi o non lo faccio formare ( intervengo sull enzima e abbasso il pH ) ,

oppure posso usare un chelante del ferro , es ac citrico , o ac ascorbico

Oppure l altra strategia è che dal dopachinone non si formino gli altri composti ,perché se si

formano tutti gli altri composti ottengo la melanina . Allora metto ac ascorbico che chela i metalli ,

oppure forma un composto che non è reattivo e non si forma la polimerizzazione . lo stesso effetto

lo ottengo con la cisteina , e interrompo la catena all’inizio . ma è molto più comodo l’ac ascorbico

che ha anche la funzione di chelante . Aggiungo succo di limone per ritardare l’imbrunimento

enzimatico

E’ un Effetto diretto su enzima ossidasi , no ha senso di pensare di bloccare questo inattivando

l’enzima . come inattivo l’enzima? Usando un trattamento termico , l’effetto per bloccare gli enzimi

è abbassando il pH e usando chelanti dei metalli , qualcosa che blocchi la reazione.

Se non voglio abbassare il ph aggiungo ac citrico , anche la cisteina funziona, la cisteina ridotta è

molto meno stabile , oppure per bloccare quello è di usare la .. enzimi.

Questi enzimi sono compartimentati , quando taglio l’alimento , oppure quando ho traumi : mela

perfetta ma ho una macchia scura all interno , è un imbrunimento termico dovuto a un trattamento

termico , raffraddamento elevato , congelamento elevato , l enzima è uscito che ha trovato il

substrato e ha reagito. Ma il frutto è perfetto all’esterno , non ho sentore che ci sia la macchia. E’

un imbrunimento enzimatico legato ad alterazioni che sono avvenute a livello cellulare .

Relazione tra ferro e proteine

Relazione tra proteine e alimenti , le proteine svolgono la funzione di legare con microrganismi ,

con effetti positivi o negativi . I fosfopeptidi legavano il calcio , hanno effetto positivo ,rendevano

più solubili e più assorbibili .

Proteine con effetto negativo : la funzione di queste proteine è svolta solo se le proteine hanno

struttura nativa , se perdono la struttura si denaturano .Devo essere sicura che la proteina sia in

grado di interagire con il microelemento .

Interazione tra ferro e alcune proteine , es il ferro , nella cellula batterica , non è mai libero in

soluzione , i Sali di ferro hanno basso prodotto di solubilità , il ferro ha bassa solubilità , inoltre il

ferro libero nella cellula è altamente tossico ,

Fenton : reazioni ce comportano la produzione di radicali liberi , che sono specie altamente reattive

che reagiscono sui costituenti delle membrane , ovvero sugli ac insaturi , che costituiscono le

membrane , inoltre reagiscono con alterazioni sulle basi del dna .La presenza di ferro da ferro 2 che

diventa ferro 3 , ferro che facilmente può essere ossidato e comporta la formazione di specie

radicaliche . infatti il ferro è sempre legato ad una proteina , es all emoglobina , il ferro 2, se viene

ossidato c’è qualcuno che lo riduce subito e quando viene ossidato si formano i radicali liberi .

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un individuo ricicla il 95 % del ferro , si prende il ferro all inizio della vita e poi se lo porta per tutta la

vita , che gli serve e riciclarlo il più possibile, e deve essere accumulato e mediato da due proteine.

Le due proteine che portano il ferro nei due distretti e quelle in cui viene immagazzinato. Il ferro

presente neglli alimenti si trova ossidato , come il ferro 3 ,il ferro per essere assorbito deve essere

ridotto , noi assorbiamo il ferro come ferro 2 , viene ridotto da una ferro reduttasi che si trova sull

orletto a spazzola del villo intestinale. SE Iil ferro viene ridotto si ossida l ac ascorbico.

Un alimento in condizioni acide è più facilmente assorbibile , il ferro è assorbito come ferro 2 , entra

nel villo intestinale , poi arriva nel circolo sanguigno . C’è qualche proteina che lo chela etc..

Guardiamo le due proteine nel trasporto del ferro nei comparti dove serve , le due proteine

principali sono la transferrina , proteina di trasporto a cui si lega il ferro per esser trasportata in

ogni distretto che serve , sia nel villo intestinale oppure dove serve .

Il ferro mi serve dove c’ una proliferazione cellulare , può essere endogena se devo rigenerare un

tessuto , oppure se c’è un infezione batterica , le cellule stanno crescendo e hanno bisogno di ferro

, la transferrina è usato come marcatore di infiammazione.

L’ altra proteina di trasporto è la ferritina , con struttura ben definita , è una glicoproteina , ha

glicosilazione particolare , legata a stati dell organismo , è una proteina ricercata dopo che è stata

ritirat la patente , dopo il consumo di alcol la ferritina viene glicosilata in maniera massiccia. Se uno

nn consuma più alcool i livelli di ferritina glicosilata diminuiscono .

, è una proteina con 3 lobi , 3 regioni strutturali , 2 a destra , 1 a sinistra , dato che ha questa

struttura ben definita la struttura è importante per il legame del ferro perché ogni lobo lega uno

ione di ferro occorre che come ferro ossidato come ferro 3 ,

Perché il ferro 3 possa essere legato a ogni lobo occorre che simultaneamente sia presente uno

ione bicarbonato , ione sinergico , in questa situazione ogni lobo di ferritina , ogni molecola di

transferrina lega 2 molec di ferro

il terzo lobo serve perché quando arriva la cellula che deve depositare il ferro è il punto di

riconoscimento del recettore da parte della cellula. Ho 2 lobi che legano ognuno una molecola di

ferro mediata da ione bicarbonata e un terzo lobo che serve per il riconoscimento cellulare.

Quando la proteina arriva sulla cellula , che deve essere donato , il ferro , Abbiamo un itenrazione

con il recettore , la proteina viene inglobata nella cellula , e se mi serve il ferro .

La proteine viene liberata acidificando leggermente , se acidifico leggermente il bicarbonato nn c’è

più e il ferro è rilasciato alla proteina che serve per fare centri ferro zolfo , per fare emoglobina

oppure per essere depsitati

Poi la proteina scarica viene rigenerata. Una proteina simile alla transferrina , nel latte , la

lattoferrina è la transferrina derivante dal siero che si trova nel latte , viene venduta , l utilizzo è a

due scopi , viene usato come packaging attivo , se io chelo il ferro, la lattoferrina chela il ferro ,devo

mettere qualcosa che regoli la crescita microbica , la lattoferrina chela il ferro , quindi la crescita

microbica non è facilitata . Ma rallenta la crescita. Quindi viene usato come packaging attivo. Il

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significato è quello di ridurre la crescita microbica , la capacità di legare il ferro dipende dal fatto

che la proteina ha 3 lobi , che sia nativa .

Dato che il ferro lega il ferro , io posso selezionare il tipo di microrganismo che cresce , non tutti i

microrg crescono con stesse condizioni , alcuni microrg crescono in condizioni in cui c’è poco ferro ,

si è visto che usare lattoferrina regola a livello della flora che si sta formando , la selezione verso un

tipo di microflora migliore rispetto ad altri . Viene aggiunta lattoferrina funzionale che leghi il ferro

perché si è visto ch così si formano bifido batteri che sono più resistenti all ‘infezione , che facilitano

maggiormente lo sviluppo la crescita di individui ch nati prematuri hanno problemi di sviluppo

maggiori rispetto ad altri. Nei latti della prima infanzia c’è un aggiunta di lattoferrina , chelando il

ferro , posso modulare il ferro , facilitando un certo tipo di microflora, deve essere lattoferrina

nativa , non denaturata .

Posso mdulare il ferro facilitando un certo tipo di microflora.

Chelando il ferro, è un intervento relativo . Dalla lattoferrina deriva la lattoferricina , lattofrrina

privata di un peptide, che è più attiva dal punto di vista MO , che chela più fortemente il ferro, ha

attività microbica più elevata. Il ferro circola attraverso la transferrina , lo lega e viene ceduto , se

non serve viene depositato come sale di ferro ,come ruggine , all interno di una proteina, che è la

ferritina ,

La ferritina è una proteina molto grossa fatta da una serie di subunità , 24 subunità , multimerica ,

all interno di cui c’è il ferro depositato come ferro3 , come ruggine. Ho così il ferro

compartimentato, non disponibile per nessuna reazione , questo ferro deve esser depositato e

mobilizzato .

Il trucco perchè il ferro dalla cellula sia depositato o mobilizzato è basato su un cambiamento di

stato redox , il ferro quando viene rilasciato dalla transferrina se nn serve vien depositato , e per

entrare nella ferritina deve essere ridotto. Il ferro 2 è depositato come ferro 3 e lasciato nel core.

Quando serve viene di nuovo riridotto a Ferro 2 e esportato dalla proteina. Il ferro è trasportato

dalla transferrina come ferro 3, ridotto , depositato nella ferritina che viene subito riossidato come

ferro 3 . Quando serve viene mobilizzato come ferro 2. Sembra che ci sia una attività redox in ogni

sub unità che costituiscono la proteina. La ferritina è la proteina in cui il ferro viene depositato . La

supplementazione di ferro viene fornita come ferritina .

Estrema tossicità del ferro viene neutralizzata completamente , resa inefficace mediante una

proteina.

Il legame con il ferro non è univoco , viene legato e quando serve viene mobilizzato e viene ceduto.

Ogni molecola di ferritina può contenere fino a 4000 atomi di ferro. E’ la proteina che deposita il

ferro , un dosaggio della ferritina da un idea del dosaggio di ferro. Se ho ferritina bassissima

significa che non ho deposito di ferro.

La quantità di ferro circolante nel individuo va a intervenire nella regolazione della sintesi della

proteina, è un esempio di nutrigenomica .

Iodio

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Interazione tra proteine e microelemento per la funzionalità : proteine e Iodio , che serve per la

produzione dell ormone tiroideo , che è fatto da iodio legato a una tirosina , questo ormone

tiroideo come viene fatto? Prendere una tirosina , modificarla e legarci uno iodio.

La proteina che cattura lo iodio e che forma ormone tiroideo è la tiroglobulina , proteina molto

grossa che si trova nei follicoli della tiroide , questa proteina serve a collegare , cattura le varie

tirosine , a far si che queste tirosine vengano iodate e poi vengono trasformate in ormone tiroideo.

Pola tiroglobulina cattura lo iodio presente, se io non ho iodio , la tiroglobulina non può catturare lo

iodio da coniugare sulla tirosina , allora l organismo ha bisogno di ormone tiroideo ma non c’ è

perché non c’è iodio , quindi devo catturare quel poco di iodio , quindi l’organismo a livello della

tiroide sintetizza elevate quantità di tiroglobulina . Deve catturare assolutamente quel poco iodio

che c’è.

Il sale arrivava dalle montagne , c’erano carenze di iodio , quindi produco molecole che cattura lo

iodio , proteina che abbia l tirosine iodate .

Proteine che legano le vitamine

Avidina : sequestranti di principi attivi, è una proteina glicosilata ,formata da 4 subunità ogni sub

unità per 17000, ogni subunità lega una molecola di biootina, il legame avidina biotina che avviene

soltanto quando la proteina è nativa , se denaturo la proteina il legame con la biotina nn c’ è più.

L’avidina si trova nell’albume , di solito.

La biotina serve quando si sviluppa il pulcino , è ricco di proteine che chelano , l’ avidina che quando

è legata non è biodisponibile e non può essere usata questo legame è molto elevato e specifico , è

usato per scopi analitici , alla biotina lego un anticorpo , poi aggiungo avidina , la biotina è

fluorescente. E’ un legame molto forte e specifico. L avidina è termosensibile , se scaldo e

denaturo la proteina non ho più questo legame.

Niacina : è una vitamina del gruppo B, legata a malattie come la pellagra , legata a carenze

nutrizionali , legate alla mancanza di niacina in popolazione con alimenti privi di niacina oppure in

popolazioni che si nutrivano di mais . Il mais è uno degli alimenti più ricchi di niacina. Queste

niacine erano legate a una famiglia di proteine , che legate non erano biodisponibili. Il legame tra

queste proteine e la niacina era legato al fatto che , queste famiglie di proteine erano termosensibili

.

Quindi Un semplice trattamento termico le denaturava ma non era sufficiente per rilasciare la

niacina , se il trattamento termico era condotto in condizioni alcaline la proteina si denaturava

rilasciando la niacina .

Devo fare un trattamento detto soaking alcalino , trattamento in cui la farina sia trattata in

condizioni basiche , in questo modo denaturo le proteine. Cambia il trattamento alcalino. In molte

Farine di mais , sono farine che hanno subito la nixtamalizzazione , è previsto un trattamento

alcalino con proteasi , per aiutare l’idrolisi di queste proteine e contemporaneamente il rilascio

della niacina.

La cottura con la cenere comportava la liberazione della niacina

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Le proteine chelano certi composti , ma non è automatico che se

Niacina : le proteine sono termosensibili ma non lo sono se agisco con azioni abbassando il pH.

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Il muscolo

Il muscolo è costituito da una serie di unità, definite fibre muscolari (con diametro fino a 0.1

nm e una lunghezza da 1 a 40 nm). Ogni fibra muscolare è una cellula specializzata. Le cellule

muscolari sono cellule polinucleate, come tutte le cellule hanno una membrana, che però ha

una caratteristica particolare: infatti il sarcolemma (così è definita la membrana cellulare della

cellula muscolare) è particolarmente sensibile alla stimolazione elettrica e quindi è facilmente

eccitabile: infatti deve rispondere

all’impulso nervoso. In più ha un

citoplasma chiamato sarcoplasma con

delle caratteristiche particolari. All’interno

del sarcoplasma sono presenti molti

filamenti proteici, chiamati miofibrille.

Esse, messe tutte parallele in fasci lungo

l’asse della cellula, sono avvolte in senso

perpendicolare dai tubuli trasversi.

All’interno del sarcoplasma si trova il

reticolo sarcoplasmatico che è simile a

quello endoplasmatico, ma è altamente

specializzato, esteso e messo

longitudinalmente rispetto alle miofibrille,

e negli spazi che rimangono si trova una grande quantità di mitocondri.

All’interno del muscolo abbiamo un 75% di acqua e un 20% di proteine. Di queste proteine:

Più del 50% sono proteine miofibrillari, e sono quelle che andranno a definire le

o caratteristiche del mio prodotto.

Il 30% sono proteine del sarcoplasma sono solubili e servono per l’attività metabolica del

o muscolo; buona parte sono proteine della glicolisi, che servono alla cellula.

Un 10-15% sono le proteine dello stroma, insolubili in condizioni normali,

o fondamentalmente collagene e elastina, e servono ad ancorare il muscolo.

Reticolo sarcoplasmatico

È simile al reticolo endoplasmatico liscio, con alcune differenze. Nel reticolo endoplasmatico

liscio di una cellula standard avvengono le modificazioni post-traduzionali delle proteine

(glicosidazione, fosforilazione etc), mentre in questo reticolo non avviene nessuna di queste

funzioni, perché è esclusivamente una pompa del calcio, ovvero qui si deposita e viene

rilasciato il calcio. La concentrazione del calcio infatti è fondamentale per la funzionalità del

muscolo. Pertanto il reticolo sarcoplasmatico svolge un ruolo fondamentale durante la

contrazione muscolare.

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Miofibrille

Ogni miofibrilla è formata da una serie di unità ripetitive (anche 20000) definiti come

sarcomeri. Ogni sarcomero è costituito, da una banda A, chiamata anche banda anisotropa (che

assorbe la luce) e una banda I o isotropa, che fa passare la luce. Al microscopio si presenta in

questo modo:

la banda I è fatta da un unico tipo di filamento, quello sottile, mentre la banda A è costituita da

2 tipi di filamenti: gli stessi della banda I, più i filamenti spessi posizionati in modo diverso. In

più c’è una zona costituita solo da filamenti più spessi. Quindi in queste unità ripetitive

abbiamo la presenza di 2 tipologie di filamenti: spessi e sottili. Perpendicolarmente a ogni

sarcomero abbiamo delle linnee più scure, la zona H nella banda A e le linee Z nella banda I. La

linea Z sono i punti di ancoraggio dei filamenti sottili, mentre la zona H è costituita oltre che dai

filamenti spessi, da una serie di altre proteine. Queste zone sono importanti perché gli

interventi atti all’ottenimento della carne interesseranno solo queste zone.

Filamenti sottili

È un complesso proteico costituito da 3 tipi di proteine associate fra di loro:

Actina

o Troponina

o Tropomiosina

o

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L’actina è una proteina filamentosa costituita da 2 filamenti associati fra di loro a doppia elica

(elica proteica diversa da tutte le precedenti viste) con un passo di 6-7 nm e della lunghezza di

35 nm. Ogni filamento è costituito da monomeri di actina G. Actina G è un monomero, che in

presenza di magnesio (Mg++) polimerizza formando un filamento, il quale si avvolge a doppia

elica con un altro filamento formando l’actina F. Lungo questa doppia elica di actina sono

posizionate le 2 altre proteine: la tropomiosina è un dimero filamentoso, formato da 2

monomeri uguali da 70000 Da, che si avvolge come un cordone lungo la doppia elica di actina a

ogni passo dell’elica, e serve a dare più forza alla doppia elica di actina. In corrispondenza del

passo dell’elica abbiamo anche la troponina, una proteina globulare costituita da un trimero,

quindi ha 3 diverse subunità:

• TnT lega la tropomiosina, e ancora il complesso sulla tropomiosina

• TpI inibisce l’interazione tra l’actina e la miosina (del filamento spesso), quindi modula

l’interazione tra i 2 filamenti che costituiscono la fibra muscolare

• TnC lega il calcio, se c’è.

Filamenti spessi

Sono costituiti da miosina. Essa è una

proteina oligomerica costituita da 2

catene pesanti da 200000, 2 catene

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leggere da 20000 e 2 catene leggere da 16000. È organizzata in maniera particolare: le 2 catene

pesanti sono avvolte a partire dalla parte c-terminale, e verso la parte n-terminale si aprono.

All’interno delle 2 teste si trovano le 2 tipologie di catene leggere, una per parte. All’interno

della coda della miosina esiste un punto preciso flessibile, facilmente aggredibile dalla proteasi.

Le unità di miosina si associano coda verso coda, andando a formare il filamento spesso. Esso è

formato da associazioni di miosina coda contro coda, e vedo una zona nuda, costituita dalle

code, e da una zona che ha le teste della miosina.

Nelle zone in cui ci sono entrambi i filamenti (sottile e spesso), è possibile un’interazione tra

actina e miosina, ma occorre tenere presente la presenza dell’inibitore della troponina. Infatti il

contatto tra teste della miosina e actina non è casuale.

La miosina ha 2 attività importanti:

1. Attività ATPasica: idrolizza ATP per liberare energia;

2. Capacità di formare il complesso actina-miosina.

Contrazione muscolare

Come si modifica il sarcomero, quindi come i 2 filamenti scorrono l’uno sull’altro, è alla base

della contrazione muscolare. Il caso 1 è un muscolo perfettamente rilasciato, ed è la struttura

appena vista, il caso 4 è un muscolo perfettamente contratto. La banda che è sparita è la banda

I. quindi in un muscolo rilasciato il sarcomero ha la struttura regolare, mentre nel muscolo

contratto i filamenti sottili (banda I) penetrano all’interno della banda A. La carne che io

consumo deve essere costituita da muscolo in condizioni rilasciate, ma l’animale al momento

della morte è alla massima contrazione. Quindi durante la frollatura devo superare la fase di

contrazione.

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Tappe della contrazione muscolare

Il primo fenomeno è rappresentato dalla fase nervosa: l’impulso arriva al muscolo perché ci sia

una contrazione. L’effetto immediato è una generazione a livello della membrana della fibra

muscolare di una variazione di potenziale attraverso l’impulso elettrico. Questo impulso

elettrico comporta una depolarizzazione lungo i tubuli trasversi, che comporta che il calcio che

si trova all’interno dei tubuli e del reticolo sarcoplasmatico viene rilasciato. Il salto di

concentrazione è significativo. Il calcio si lega alla troponina, quindi si modifica la struttura

della troponina, e i siti di legame della miosina sull’actina diventano accessibili. A questo punto

la testa della miosina si associa con l’actina, e questo legame rappresenta lo scorrimento del

filamento sottile sul filamento pesante, ovvero la contrazione.

Se il muscolo è in fase rigida, il sale penetra molto meno. Per rilasciare il muscolo devo

ritornare alle condizioni di partenza. Il motore del rilasciamento è che il calcio venga

riassorbito. La contrazione muscolare è finita, arriva l’impulso che cambia la polarizzazione

della membrana, quindi il reticolo e i tubuli non sono più permeabili al calcio, ma non basta

questo. Occorre il trasporto del calcio contro gradiente all’interno dei reticoli, quindi mi serve

ATP per trasportare il calcio al suo posto. Non essendoci più il calcio anche la troponina cambia

la sua struttura e inibisce il contatto tra actina e miosina, quindi il filamento sottile torna al suo

posto.

Modificazioni post-mortem

Si ferma la circolazione sanguigna, quindi passo da un metabolismo aerobico a un metabolismo

anaerobico. In termini energetici esso è un metabolismo meno vantaggioso. Per superare lo

stato di contrazione devo diminuire la quantità di calcio presente, e lo faccio usando

dell’energia, quindi l’ATP che produco col metabolismo anaerobio. Partendo da presupposto

che i mitocondri sono morti, e quindi non posso produrre ATP da loro, devo cercare di

produrlo altrove. Può utilizzare la fosfocreatina, ma la cosa non aiuta molto più indicata è

procedere con la glicolisi. Il substrato di partenza della glicolisi. Parto dal glicogeno, che è

fondamentale che ce ne sia. Qui teniamo presente un fatto importante: l’animale non deve

arrivare affamato o assetato alla macellazione, perché altrimenti non ha glicogeno depositato.

Un passaggio essenziale nella glicolisi è legato alla disponibilità di NAD, che deve essere

rigenerato. Per rigenerare il NAD si produce però l’acido lattico, che in condizioni di

metabolismo aerobico va al fegato e viene rigenerato. In condizioni di morte l’acido lattico di

accumula, e acidifica l’ambiente, quindi ho un decremento di pH, che ha 2 effetti importanti:

rallenta la glicolisi (perché riduce l’attività degli enzimi glicolitici), denatura in maniera

parziale le proteine presenti e quindi ne comporta delle modificazioni strutturali, che

interagiscono diversamente con le altre proteine e con l’acqua, quindi perdono la capacità di

interazione con gli eventi che arrivano dall’esterno. Ovviamente l’abbassamento del pH ha

anche esiti postivi, ovvero stabilizzo il prodotto dal punto di vista biotecnologico. Tuttavia

l’acidificazione non deve essere immediata, tant’è vero che l’animale appena ucciso viene

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messo a 4°C, perché abbassando la temperatura rendo graduale nel tempo l’abbassamento del

pH.

Se si abbassa il pH vuol dire che la glicolisi è compiuta, quindi ho prodotto ATP che ha

riassorbito il calcio e è avvenuto il rilasciamento. Può avvenire la frollatura.

Il decremento del pH è molto importante, perché influenza la texture del prodotto, e

soprattutto è specie specifico, interessa soprattutto i suini. Infatti l’abbassamento di pH in

alcune specie suine è tale da far perdere alla carne la capacità di trattenere acqua e rende

impossibile per esempio il trattamento per ottenere il prosciutto.

Accanto a tutti questi eventi glicolitici, abbiamo anche eventi proteolitici, che interessano

un’idrolisi a livello della linea Z e della linea M. i responsabili sono degli enzimi citosolici, le

calpaine, che sono delle proteasi, che hanno bisogno di calcio per attivarsi, e hanno bisogno di

pH più acidi rispetto a quello fisiologico. Questi 2 fattori fanno sì che queste proteasi si attivino

dopo la morte. Quindi in un muscolo a frollatura, se lo si analizza al microscopio, rimane il

sarcomero, ma senza le linee nette Z e M.

Dopo queste modificazioni sia metaboliche che proteolitiche ottengo la carne.

Un sistema che viene normalmente impiegato per accelerare queste modificazioni, è quello di

aggiungere degli enzimi proteolitici, e il più impiegato è la papaina. Un sistema è quello di

spruzzare in maniera uniforme la papaina sulla carcassa, non in grandi quantità. Oppure

vengono vendute delle miscele per marinare la carne, con la funzione di rendere più tenera la

carne.

Un altro caso importante di utilizzo degli enzimi è la transglutaminasi (TG). Esso è un enzima

che si trova normalmente nella cellula e fa un legame isopeptidico (uguale a quello peptidico)

che coinvolge dei gruppi R. Un legame peptidico standard avviene tra il gruppo amminico e il

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gruppo carbossilico di due amminoacidi, invece la transglutaminasi utilizza come gruppo

carbossilico il residuo R di una glutammina dopo che ha tolto il gruppo amminico. Il gruppo R

della glutammina è CONH , se tolgo il gruppo amminico ottengo l’acido glutammico. Il TG lega

2

un residuo di glutammina con un residuo di lisina, dividendo la reazione in 2 tappe: elimina il

gruppo amminico dalla glutammina, che diventa un acido glutammico, e COH si lega all’NH 2

della lisina, formando un legame dal punto di vista chimico uguale al peptidico, ma

isopeptidico, perché i protagonisti sono diversi. Con questo sistema posso legare

trasversalmente le proteine, ma occorrono proteine ricche in glutammina e lisina, come lo sono

le carni.

Il vantaggio è che posso trasformare delle proteine animali legandole fra di loro, in un prodotto

che ha una texture, e questo viene fatto con i surimi, fatti da pezzi piccolissimi, di pesce di

diversa origine, metto la TG, conferisco una texture e ottengo i surimi. Oppure ho dei pezzi di

carne, uso la TG e formo un reticolo e ottengo un prodotto compatto.

Se ho delle proteine con dei legami non naturali, quando degrado quella proteina la proteasi

non riuscirà a degradare il tutto, quindi si fermerà all’ottenimento di un peptide con il legame

isopeptidico. In più questi peptidi non sono naturali, quindi scatenano un metabolismo

alternativo.

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Modificazioni degli alimenti per fasce di consumatori

sensibili

Parlando di sensibilità agli alimenti o reazioni avverse a un alimento, non si intendono le

reazioni che avvengono nel caso ci sia nell’alimento un componente o un’interazione microbica,

ma si intende una reazione in cui l’ingestione di un determinato alimento comporta solo in

fasce di individui cosiddetti sensibili, delle manifestazioni con conseguenze di diversa entità.

Si parla di allergie a un alimento quando c’è una risposta del sistema immunitario che vede la

produzione di uno specifico gruppo di anticorpi, le IgE, che sono degli anticorpi prodotti solo in

persone sensibili in risposta a alcuni alimenti.

Un’altra manifestazione è rappresentata dall’intolleranza all’alimento, che è diversa dal punto

di vista dei meccanismi molecolari rispetto all’allergia. Un primo aspetto è che non abbiamo

una partecipazione diretta del sistema immunitario e quindi non produciamo IgE; un altro

aspetto è che un ruolo molto importante per determinare la risposta all’intolleranza è svolto

dal tipo di microbioma che ognuno di noi ha, accanto ad alcuni difetti nel funzionamento di

enzimi coinvolti nel metabolismo di alcuni composti. Un altro aspetto è che un allergene

alimentare è sempre e solo una proteina (o un frammento di proteina), mentre nel caso delle

intolleranze i composti coinvolti possono essere delle proteine, ma in molti casi non lo sono,

per esempio nelle intolleranze al lattosio.

Profondamente diversa è anche la gestione delle 2 problematiche. Nel caso delle intolleranze

esiste una soglia minima al di sotto della quale non abbiamo manifestazioni, ed è abbastanza

uniforme, quindi è molto più facile stabilire un limite che vada bene a tutti. Nel caso delle

allergie abbiamo invece una grossa variabilità della quantità massima legata alla sensibilità

individuale.

La celiachia non è un’allergia perché non presenta i sintomi tipici di una manifestazione

allergica, per cui viene spesso considerata come un’intolleranza delle sequenze presenti delle

proteine di alcuni cereali. Tuttavia rispetto all’intolleranza ha una grossa partecipazione anche

© Laila Pansera - 99

del sistema immunitario di individui predisposti. In questo caso il sistema immunitario

reagisce con delle risposte molto diverse da quelle di un’allergia, e che quindi somigliano molto

alle risposte a delle malattie autoimmuni. In realtà una corretta definizione della celiachia è

un’intolleranza autoimmune.

Allergie

Una reazione allergica si manifesta in 2 step. Il primo è l’instaurarsi della risposta allergica: nel

momento in cui ingerisco l’alimento in cui è presente il composto che ne determina l’allergia, le

cellule B dell’individuo, cioè quelle che nel sistema immunitario sono deputate alla risposta

esterna positiva a qualsiasi invasione, in questo caso all’allergia, conoscono la proteina e

producono gli anticorpi contro l’allergene. Di questi anticorpi una parte rimangono attaccati

alla cellula e costituiscono la cellula memoria (per la prossima voltauna seconda

manifestazione allergica è sempre più violenta della prima), altri vengono rilasciati nel circolo

sanguigno, vanno ad attaccarsi ai recettori presenti in altre cellule del nostro sistema

immunitario, che sono i mastociti, presenti in tutte le zone di contatto con l’esterno (bocca,

intestino). Questi mastociti sono considerati cellule spazzino, nel caso dell’allergia il legame

tra mastociti e anticorpi, potenziato dalla presenza dell’allergene, comporta una modificazione

morfologica nel mastocita, definita degranulazione. In pratica all’interno del mastocita

avvengono risposte che si traducono nella produzione di una serie di mediatori: il più comune

è l’istamina, che è un vaso-dilatatore, aumenta la permeabilità capillare, favorisce la

contrazione dei bronchi, infatti uno dei problemi dell’allergia è l’asma, altri mediatori sono le

prostaglandine e i leucotrieni, che producono lacrimazione degli occhi o del naso. Tuti questi

mediatori sono dei vasodilatatori, ovvero se a livello periferico il vaso si dilata, faccio fatica a

mandare il sangue. Infatti se si muore per shock anafilattico è perché scoppia il cuore, perché fa

una fatica tremenda a mandare il sangue.

© Laila Pansera - 100

Teniamo presente che non è l’alimento a generare la reazione, ma la proteina all’interno

dell’alimento che scatena il tutto.

Nella manifestazione iniziale a livello della cellula B si produce un anticorpo IgE che ha una

struttura simile alle altre classi di anticorpi prodotti dal corpo. Un anticorpo ha una struttura a

Y, è una proteina multimerica, formata da 4 subunità uguali a 2 a 2, 2 pesanti e 2 leggere. Le

catene pesante costituisce la base e i 2 bracci della Y, e sui 2 bracci, legati mediante legame

disolfuro, abbiamo le catene leggere. Un altro

aspetto comune a tutti gli anticorpi, è il fatto di

avere una zona uguale per categoria di anticorpi,

nel caso delle IgE è quella blu. Quindi le varie IgE si

differenziano per la parte rossa.

Il sistema immunitario di un antigene non

riconosce in toto l’allergene, ma riconosce solo

delle zone, e verso quelle zone sono prodotti gli

anticorpi. Queste zone sono dette epitopi.

All’interno dello stesso allergene (antigene)

esistono diversi epitopi. Essi possono essere:

- Conformazionali: sono regioni riconoscibili

dagli anticorpi legate alla struttura

tridimensionale. Il sistema immunitario fa un

anticorpo contro delle strutture, per esempio contro un’α-elica, o un foglietto. Se quel

foglietto per esempio non c’è più, non vengono prodotti anticorpi. Questo ha un aspetto

applicativo molto importante, perché se applico un trattamento fisico a una proteina, il

© Laila Pansera - 101

sistema immunitario reagisce meno: ecco perché certa gente è meno allergica a un cibo

cotto.

- Sequenziali: essi sono delle specifiche sequenze di amminoacidi. Se io voglio eliminare un

epitopo sequenziale devo rompere la sequenza, quindi idrolizzare il legame peptidico.

Nel sistema sanguigno che va a colpire il mastocita ho una famiglia di anticorpi, per cui si parla

spesso di anticorpi policlonati, ovvero che riconoscono tutti lo stesso allergene, ma i diversi

epitopi di un allergene.

Quando devo eliminare l’allergene mi basta modificare gli epitopi. Nei processi che eliminano

gli allergeni ho un’azione combinata di agenti fisici e agenti enzimatici, ma non uso enzimi

casuali, ma enzimi che idrolizzano prevalentemente le sequenze epitopiche.

Ogni individuo risponde in maniera diversa ai vari epitopi, chi è molto sensibile risponde a tutti

gli epitopi, chi lo è meno risponde solo a pochi epitopi, quindi da qui dipendono le quantità

necessarie perché avvenga una manifestazione.

Quindi un allergene:

È una proteina o un peptide

✓ Può essere un componente dell’alimento

✓ Può essere un composto aggiunto come ingrediente

✓ Può essere un contaminante, derivante per esempio da lavorazioni miste (presente in

✓ tracce)

In un alimento non tutte le proteine presenti sono degli allergeni, ma solo dei gruppi.

È stata fatta una direttiva CE nel 2000 per vedere quali alimenti sono responsabili dei

principali allergeni presenti nella popolazione europea. Essi sono il frumento, i crostacei, le

uova, il pesce, le arachidi, la soia, il latte, la nocciola, il sedano, la senape e il sesamo. Questa

mappa ha definito tutta la legislazione che ne è derivata, per cui in etichetta bisogna segnare la

presenza di questi allergeni.

Gli allergeni, essendo proteine, non sfuggono alle modificazioni strutturali che abbiamo già

visto, e queste modificazioni possono comportare una diversa risposta all’allergene da parte

del sistema immunitario.

Come i diversi processi possono variare la risposata all’allergene da parte del sistema

immunitario

Un processo termico, come la cottura, l’UHT o la pastorizzazione, può diminuire o aumentare

l’allergenicità, oppure lasciarla del tutto indifferente: questo dipende dalle modificazioni che il

trattamento comporta in funzione degli epitopi conformazionali. Un altro aspetto è che il

trattamento termico porta alla formazione di polimeri: in generale un allergene in forma

polimerica è molto più reattivo nei confronti del sistema immunitario. Se un epitopo

sequenziale ha al suo interno un amminoacido glicosilato, esso è molto più immunoreattivo

(viene riconosciuto in maniera molto più forte da sistema immunitario). Un esempio sono le

arachidi: normalmente le arachidi vengono consumate tostate, e la tostatura è un processo

© Laila Pansera - 102

termico, che comporta tra le tante cose la glicosilazione in alcuni epitopi sequenziali. L’affinità

aumenta di 100 volte.

Il nostro sistema immunitario non risponde in maniera quantitativa, perché produce anticorpi

anche per allergeni che non sono presenti in quantità elevate.

Nella risposta da parte del sistema immunitario è importante lo stato fisico in cui si presenta

nell’alimento un allergene. Ad esempio un allergene in emulsione genera una risposta

completamente diversa rispetto allo stesso allergene non in emulsione. Questo perché variano

2 parametri importanti: nell’emulsione la proteina cambia la sua struttura, quindi cambiano la

digeribilità e l’aggredibilità da parte delle proteasi, e la capacità di valicare le barriere

fisiologiche. Vale anche per quanto l’alimento è stato frammentato, per esempio se applico un

trattamento di omogeneizzazione, essa comporta una variazione dell’organizzazione

strutturale, e quindi una diversa risposa del sistema immunitario.

Per complicare le cose occorre tenere a mente che c’è un effetto sinergico: ogni alimento non

ha un solo allergene, in più se ho una contemporanea presenza di una proteina che è un

immunostimolatore del sistema immunitario (qualcosa che determina la risposta del sistema

immunitario) come una proteina batterica, insieme a un allergene, la risposta all’allergene si

manifesta in maniera molto più violenta. Questo regola la produzione di alimenti per la prima

infanzia o gli alimenti per immunodepressi: essi non devono contenere tracce di proteine

batteriche.

Strategie per produrre alimenti anallergici

Sono 3:

• Alterazione biotecnologica

Non piace al consumatore. Intervengo direttamente e faccio in modo che l’alimento (vegetale)

non abbia più le proteine allergeniche. Il problema è che le proteine allergeniche hanno un

ruolo nell’alimento, di solito sono di deposito o di difesa dall’attacco di muffe e parassiti.

Ovviamente togliendo queste proteine la pianta cresce male, ed è più facile preda di muffe etc,

oppure ricrea delle proteine che hanno le stesse funzioni e che sono allergeni più o meno come

gli altri.

• Rimozione fisica

Faccio un trattamento in cui elimino le proteine allergeniche. Viene fatta principalmente in 2

casi, in cui faccio dei derivati. Voglio uno sciroppo di glucosio anallergico o un olio di soia

anallergico. Questi sono 2 alimenti pericolosi se non sono anallergici. Devo fare dei processi

fisici di separazione e di precipitazione in cui vengono allontanante tutte le proteine, in

particolare quelle allergeniche. Oppure posso fare dei trattamenti sui frutti ne quali gli

allergeni si trovano soltanto sulla buccia. Un esempio può essere la mela, o la pesca. In questi 2

© Laila Pansera - 103

frutti c’è un allergene nella buccia che è una lipid transfer protein (LTP), piccola e compatta

(pesa 10000 e ha più di 8 ponti disolfuro). Viene fatto un trattamento in particolari condizioni

che mi fanno ottenere un prodotto completamente anallergico.

• Modificazione enzimatica

Trattamento che comporta la rimozioni degli epitopi conformazionali e sequenziali presenti

negli allergeni. La vera fascia di produzione di alimenti anallergici è quella dei prodotti della

prima infanzia.

Ho una prima fase in cui avviene l’idrolisi degli epitopi coinvolti, seguita da un trattamento

termico, che viene fatto in 2 fasi, perché le proteine in cui sono presenti gli allergeni sono molto

compatte e quindi difficilmente penetrabili. Per cui di solito si fa un pre-trattamento termico

con lo scopo di denaturare la proteina (modificarne la struttura), in modo da renderla più

facilmente aggredibile da parte della proteasi. Dopo l’idrolisi si fa un altro trattamento termico

a temperatura elevata, in modo da inattivare la proteasi, e in modo da polimerizzare le

proteine. Nella fase successiva devo vedere quali dei peptidi che si sono generati sono

immunoreattivi, quindi devo fare una selezione. È stato visto che i peptidi dotto i 4000/5000

Da sono poco o per niente immunoreattivi. Quindi la miscela viene filtrata con una membrana

che ha un cut-off di 3000/4000 Da: in questo modo tutti i peptidi che pesano più di 3000

vengono trattenuti, e ottengo una miscela a basso PM, in cui ho solo peptidi, ed essi sono gli

ingredienti base per produrre l’alimento anallergico. Chiaramente essi devono essere

controllati.

Gli aspetti negativi del processo sono legati al primo trattamento termico che devo fare per

facilitare l’idrolisi. Sono la formazione di polimeri solubili o insolubili, che sono più

immunoreattivi delle singole proteine e più resistenti all’azione delle proteasi, quindi devo

scegliere un buon compromesso tempo-temperatura. Un altro aspetto negativo è che tra gli

effetti del trattamento termico abbiamo le reazioni di glicosilazione (formazione di zuccheri

legati a dei residui particolari di amminoacidi), che non sono composti naturali e possono

© Laila Pansera - 104

essere più o meno dannosi. Un ultimo aspetto negativo è quello che si potrebbero creare troppi

peptidi corti e con residui idrofobici nella parte n-terminale, che conferiscono il sapore amaro.

Ecco perché i prodotti anallergici non sono fatti con le caseine ma con le sieroproteine.

Metodi per verificare che ho ottenuto prodotti anallergici

Sono 2:

• metodo analitico in cui verifico se il mio enzima ha agito e ha comportato la produzione di

peptidi

• metodo che descrive le proprietà immunochimiche dei peptidi presenti, ovvero valutano se

le proteine presenti sono ancora in grado di generare una risposta del sistema immunitario.

sono 3 le categorie di metodi impiegati per valutare la presenza di peptidi in una matrice, e

sfruttano le proprietà dei peptidi presenti.

1. Metodo cromatografico

È basato sulla diversa idrofobicità delle proteine e dei peptidi derivanti dalla stessa proteina.

Parto dal presupposto che alla diversa idrofobicità della proteina viene vista esponendo le zone

idrofobiche della proteina, quindi denaturando la proteina cambiando solvente, per esempio

metto la miscela in condizioni acide. Quindi denaturo la proteina e poi espongo questa miscela

denaturata a una matrice, di solito silice, in cui sono attaccate delle catene alifatiche di diversa

lunghezza. A questa catena si attaccano le diverse proteine idrofobicamente, e più la proteina è

idrofobica, più fortemente sarà attaccata. Dopo cambio la polarità del solvente, quindi cambio

anche l’idrofobicità, e la proteina si stacca, secondo il principio che le interazioni idrofobiche

meno forti si staccano per prime. I peptidi derivanti da una proteina sono meno idrofobici

rispetto alla proteina che li ha generati, quindi si slegano prima. Quindi metto l’intera miscela e

poi vario al polarità in maniera lineare.

Questo è un tracciato, relativo a un idrolisi fatta

con delle sieroproteine con 4 diverse proteasi. Nel

box rosso dovrebbero venire eluite le proteine se

fossero presenti libere. Tutto quello che viene

eluito prima sono i diversi peptidi generati

dall’azione delle proteasi. Ogni profilo è diverso,

ciò significa che le 4 proteasi utilizzate hanno una

generazione di peptidi diversi, in particolare quelli

eluiti a 10 minuti sono meno idrofobici rispetto a

quelli eluiti a 30 minuti, quindi saranno quelli con

residui amminoacidici più polari e quindi carichi.

Una cromatografia di questo tipo mi dice che il mio enzima ha prodotto dei peptidi, e che in

queste condizioni spinte non ci sono più proteine integre. Questo metodo non separa in base

alle dimensioni dei peptidi, ma in base alla loro idrofobicità. Questa è una tecnica puramente

© Laila Pansera - 105

analitica, perché i peptidi sono denaturati e non posso recuperarli con la loro struttura nativa,

in altre parole non userò mai questa tecnica per separare un enzima, se mi interessa che

l’enzima sia funzionale.

2. Elettroforesi o SDS-PAGE

Viene utilizzata in accoppiamento alla prima tecnica. La SDS mi permette di separare proteine e

peptidi in base al loro PM, quindi in base alle dimensioni.

In questa tecnica le proteine vengono separate sfruttando la loro mobilità in un campo

elettrico. In altre parole viene applicato un campo elettrico, le proteine vengono messe su un

supporto e separate.

• Il supporto è costituito da un gel di acrilammide, un polimero solubile che in determinate

condizioni polimerizza formando tante maglie perfettamente regolari, e funge da maglia di

separazione.

• Nella fase successiva applico sul supporto le proteine, che sono state denaturate in modo da

formare una catena perfettamente lineare. Questo lo ottengo trattando le proteine a caldo

in presenza di un sapone, che è l’SDS (sodio dodecil fosfato), una lunga catena alifatica con

una testa polare (SO ), ed è la stessa molecola che trovo in qualsiasi detergente. Mettere

3-

l’SDS nella miscela a caldo significa denaturare la proteina per il caldo, e nel frattempo l’SDS

si attacca alla proteina, con la lunga catena alifatica con le zone idrofobiche e la testa polare

verso l’ambiente: la mia proteina diventa una stringa circondata dal detergente, e ogni

proteina è con un rapporto dimensione-SDS costante, quindi cariche negativamente.

• Carico le mie proteine cariche negativamente al polo negativo, applico il campo elettrico per

un tempo fisso, ed esse migreranno verso il polo positivo. Siccome il rapporto quantità di

SDS/ dimensione dei peptidi è costante, migreranno più velocemente i peptidi di minori

dimensioni, quindi ho una separazione in base alle dimensioni. Chiaramente devo trovarmi

in condizioni che la separazione non deve essere influenzata dall’ingombro sterico, ecco

perché aggiungo l’SDS in modo che l’unica discriminante sia la dimensione delle proteine.

• Se per esempio ho una proteina composta da 2 subunità e voglio vedere se è proprio così,

non basta l’SDS, devo trattarla anche con un riducente; farò 2 corse, una con l’SDS e una con

riducente+SDS e se noto una differenza fra le 2 corse ho 2 subunità. SDS- è in assenza di

riducente, mentre SDS+ è in presenza di riducente. C=frazione

caseinica

SP=sieropriteine

M=marker

(5000 Da)

© Laila Pansera - 106

Qui sopra abbiamo l’SDS di latte che è stato proteolizzato da 2 enzimi.

Da questo tracciato ottengo diverse informazioni:

• nel latte idrolizzato per molto tempo non c’è più la caseina, ma ci sono ancora le

sieroproteine (anche se la BLG è notevolmente ridotta); a 30 minuti ho già idrolizzato tutte

le sieroproteine che posso

• si sono formati dei peptidi (macchione enorme)

• nell’elettroforesi non si riescono a separare peptidi più piccoli di 3000

L’SDS è il sistema più semplice per avere un’idea globale delle proteine.

Questi primi 2 metodi sono fisici e mi danno indicazioni sulle proprietà chimico-fisiche delle

proteine.

Valutazione dell’immunoreattività

Una volta controllate le proteine, occorre verificare gli effetti che producono nel sistema

immunitario. posso farlo con test in vitro e test in vivo. Ovviamente parto dai test in vitro.

Test in vitro

Essi fanno parte del gruppo dei test immunochimici, ovvero dei test in cui valuto la presenza di

un determinato composto sfruttando la capacità di un anticorpo di interagire con esso. Ci sono

2 tipi di test:

• ELISA

• Dot Blotting

ELISA

Sono dei test che utilizzano dei supporti di polistirene. Essi sono delle piastre con all’interno

dei pozzetti, e in ogni pozzetto viene messa in soluzione la proteina allergenica (antigene), per

esempio la BLG. La proteina si attacca al polistirene mediante interazioni non covalenti. Prendo

la piastra e la rovescio, e ovviamente la proteina rimane legata al supporto. Dopodiché

aggiungo una soluzione contenente l’anticorpo, ed esso riconosce la proteina formando un

complesso antigene-anticorpo. Per vedere la formazione del complesso ho 2 possibilità:

posso avere coniugato all’anticorpo un enzima, che in presenza di un substrato, lo

o ossida e dà origine a un composto colorato; se non ho l’antigene non si forma il

complesso colorato, se ne ho poco, si colora poco;

quello rosso è un anticorpo secondario specie specifico, a cui attacco un enzima, per cui

o riconosce l’anticorpo legato all’antigene. Il vantaggio è che è standardizzato, quindi so

che funziona.

In pratica con il metodo ELISA riconosco la presenza dell’allergene mediante la colorazione.

© Laila Pansera - 107

Qui sopra è rappresentata una variazione di assorbanza in funzione della quantità di caseine e

di BLG. Se ottengo une linea lineare, vuol dire che ho tolto tutti gli epitopi, mentre i puntini neri

rappresentano una variazione in base alla quantità di anticorpo che aggiungo.

Dot Blotting

Funzione esattamente come ELISA, solo che invece del supporto, abbiamo una membrana di

microcellulosa, dove si fanno tante macchioline di proteina e si procede come in precedenza.

Il test viene completato inserendo sieri di persone allergiche.

Test in vivo

Ce ne sono di 2 tipi, e vengono fatti in condizione controllata:

• test cutanei, in cui l’alimento viene messo sulla cute per vedere se ci sono

manifestazioni

• ingestione sottolinguale dell’alimento

sono l’ultimo aspetto, la valutazione finale.

Gestione del rischio

Come posso essere sicuro che questo alimento non contiene l’allergene o ne contiene in

quantità non in grado di scatenare una reazione allergica.

Per prima cosa secondo la direttiva 2000/13/EC, se l’alimento contiene un allergene di quelli

citati a pag 83, devo dichiararlo in etichetta. Per tutelarsi, i produttori sulle etichette mettevano

© Laila Pansera - 108


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DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea in scienze e tecnologie alimentari
SSD:
Università: Milano - Unimi
A.A.: 2016-2017

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher panseralaila di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Biochimica alimentare e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Milano - Unimi o del prof Iametti Stefania.

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