Biochimica 1 (DNA, RNA, cinetica enzimatica)

Biochimica degli amminoacidi

Amminoacidi α-amminoacidi

Tutti gli amminoacidi presenti nelle proteine sono α-amminoacidi. Essi hanno un gruppo α-carbossilico e un gruppo amminico legati allo stesso atomo di carbonio, detto carbonio α. Differiscono tra di loro per la catena laterale R che influenza la solubilità dell’amminoacido in acqua. Il carbonio è detto centro chirale in quanto, a causa della forma tetraedrica, gli amminoacidi possono presentarsi in due forme diverse, quindi per ogni amminoacido sono possibili due stereoisomeri, essendo dunque speculari (chirali) l’uno all’altro prendono il nome di enantiometri. In base alla posizione del gruppo H gli amminoacidi si classificano in destrogiro (D) o levogiro (L).

Classificazione degli amminoacidi in base alla polarità

• Gruppi R alifatici, non polari: i gruppi R di questa classe sono idrofobici quindi non in grado di formare legami a idrogeno, si raggruppano all’interno delle molecole e stabilizzano la struttura mediante iterazioni idrofobiche. Se sono fuori costituiscono zone aderenti che servono per tenere unite le varie subunità di una proteina, servono anche per la trasmissione di informazioni strutturali.
• Gruppi R aromatici: assorbono a una lunghezza d’onda di 280nm, questa lunghezza d’onda è utile per quantificare o vedere la dimensione delle proteine, questa determinazione può avvenire anche attraverso un fascio di luce di lunghezza determinata fatto passare per una provetta contenente il campione da analizzare. Se la luce che esce dalla provetta è di meno vuol dire che sono presenti amminoacidi o proteine, più luce viene assorbita vuol dire che nel campione sono presenti altri componenti che assorbono.
• Gruppi R polari, non carichi: questi amminoacidi sono molto più solubili in acqua rispetto agli amminoacidi non polari in quanto contengono gruppi funzionali che formano legami a idrogeno con l’acqua.
• Gruppi R carichi positivamente (basici): istidina, arginina e lisina, hanno catene laterali con carica positiva netta a pH neutro.
• Gruppi R carichi negativamente: i gruppi R di aspartato e glutammato hanno una carica negativa netta. NB: la carica netta è la somma delle cariche positive e negative. Gli amminoacidi carichi sono normalmente esterni alla molecola in modo da fare legami idrogeno con l’acqua per stabilizzare in questo modo la molecola dall’esterno. Se l’amminoacido è interno alla molecola funge da accettore/cessore di elettroni, servono quindi per far avvenire delle reazioni. Nel caso degli enzimi catalizzano reazioni, trasferiscono elettroni e creano nuovi legami.

Amminoacidi non standard

Le proteine possono contenere, oltre ai 20 amminoacidi comuni, altri amminoacidi non comuni derivanti dalla modificazione chimica degli amminoacidi comuni. La modificazione chimica avviene dopo la sintesi proteica ad opera di specifici enzimi. (post-traduzionale). Gli amminoacidi non standard sono in grado di dare una diversa forma alla proteina. Ad esempio, la idrossiprolina a cui è stato aggiunto un gruppo -OH.

Gli amminoacidi possono essere acidi o basi

Quando un amminoacido possiede un gruppo R ionizzabile e viene sciolto in acqua a pH neutro, esso esiste in soluzione sotto forma di ione dipolare (ovvero acido o base) e prende il nome di zwitterione. I composti che hanno questa natura sono detti anfoterici o anfoliti. La loro natura dipolare ha come caratteristica un punto di fusione molto più alto rispetto alle sostanze organiche con pari massa.

Proprietà degli amminoacidi in soluzione

Gli amminoacidi sono acidi deboli poliprotici, ovvero in soluzione acquosa possono fornire più di un protone. Il pKa degli amminoacidi è influenzato dal gruppo amminico. Dalla condensazione di più amminoacidi si forma un legame peptidico (a formare una catena polipeptidica). Alcuni amminoacidi oltre alla funzione strutturale hanno anche una funzione di regolazione del metabolismo proteico oppure hanno un ruolo di difesa cellulare sotto forma di antiossidanti. Gli amminoacidi possono esistere in diverse forme anioniche o cationiche. Nelle soluzioni tampone, se sono presenti degli amminoacidi carichi, questi possono funzionare da tampone, infatti sono in grado di variare il pH della soluzione con la conseguente attivazione o disattivazione delle proteine.

Proteine

Classificazione in base a funzione biologica

• Funzione a livello molecolare
  • Catalisi enzimatica
  • Trasporto
  • Nutrimento e riserva
  • Difesa
  • Controllo crescita
  • Controllo espressione genica
• Materiale strutturale
  • Tendini e cartilagini
  • Legamenti
  • Capelli, unghie e piume
• Movimento
  • Muscoli
  • Microtubuli

Classificazione in base alla forma

• Fibrose
  • Materiale strutturale
  • Movimento
• Globulari
  • Azione a livello molecolare

Legame peptidico

Due amminoacidi si possono unire covalentemente tra di loro mediante un legame amminico detto peptidico, formando un dipeptide. Questo legame si genera per eliminazione di una molecola di acqua dal gruppo α-carbossilico e α-amminico di due amminoacidi diversi (reazione di condensazione). L’idrolisi del legame peptidico avviene molto lentamente nonostante sia una reazione esoergonica, a causa della elevata energia di attivazione, di conseguenza i legami peptidici sono stabili.

Diversi studi hanno portato alla scoperta che il legame peptidico è un po’ più corto rispetto al legame che si forma tra le ammine primarie. Si forma una sorta di doppio legame dovuto al legame tra gruppo carbonilico e gruppo amminico e l’attrazione tra gli stessi in quanto di cariche opposte. L’atomo di ossigeno del gruppo carbonilico è in posizione trans rispetto all’atomo di idrogeno del gruppo ammidico, questo porta al fatto che i legami C-N non possono ruotare liberamente; di conseguenza la rigidità del legame peptidico limita di molto le forme che il peptide può assumere.

Conformazione dei peptidi

La conformazione di un peptide è definita da angoli (phi angolo tra Cα-N) e (psi angolo tra Cα-C) che riflettono le rotazioni dei legami all’interno del peptide. Questi angoli possono assumere qualunque valore compreso tra -180° e +180°. Quando il numero di amminoacidi è relativamente piccolo si parla di oligopeptide, se invece gli amminoacidi sono molti si parla di polipeptide. Le unità amminoacidiche di un peptide prendono il nome di residui, il residuo amminoacidico terminale prende il nome di residuo amminoterminale, il residuo all’altra estremità prende il nome di residuo carbossiterminale. Questi gruppi ionizzano come se fossero degli amminoacidi liberi anche se la loro costante di ionizzazione è diversa rispetto a quella di un normale amminoacido a causa della mancanza del segno opposto sul carbonio α.

Struttura primaria delle proteine

La struttura primaria è costituita dalla sequenza di amminoacidi legati tra loro da legami peptidici covalenti e eventuali ponti disolfuro. I ponti disolfuro possono essere intracatena o intercatena e possono essere rotti da agenti riducenti (es: β-mercaptoetanolo). Nel secondo caso la proteina si scinde in subunità. La catena polipeptidica a causa delle interazioni dei suoi residui amminoacidici intracatena e/o intercatena può avvolgersi (folding) e formare strutture più complesse (struttura secondaria, terziaria e quaternaria).

Mutazioni del DNA dovute a struttura primaria

• Mutazioni conservative: sostituzione di uno o più amminoacidi con caratteristiche simili senza però nessuna sensibile conseguenza. La proteina conserva la funzione nonostante avvenga una mutazione a livello genico.
• Mutazioni non conservative: sostituzione di uno o più amminoacidi con caratteristiche diverse con conseguenze positive (adattamento evolutivo) o negative (anomalie funzionali), di conseguenza la proteina non conserva la sua funzione.

Struttura secondaria delle proteine

Struttura secondaria: segmento polipeptidico della proteina descrive l’organizzazione spaziale della catena principale senza tener conto delle catene laterali. Si ha una struttura regolare quando gli angoli rimangono invariati nel segmento principale. Le principali strutture secondarie regolari sono:

• α elica: struttura elicoidale, lo scheletro carbonioso si avvolge strettamente intorno ad un asse immaginario e i residui amminoacidici sporgono al di fuori della struttura elicoidale. La struttura è stabilizzata da legami a idrogeno intracatena che si formano tra l’ossigeno del gruppo carbonilico e l’idrogeno legato all’azoto del legame peptidico. La struttura più comune è quella destrogiro.

α elica può essere stabilizzata o destabilizzata da:

• Gruppi -R con cariche uguali che si respingono oppure con cariche diverse che si attraggono
• Alcuni amminoacidi (asparagina, serina, tirosina e lisina) vicini possono impedire la formazione dell’elica
• Negli atomi di prolina non si può formare l’elica a causa della rigidità tra gruppo amminico e carbonio alfa. I peptidi che formano la glicina invece tendono a distribuirsi in modo casuale impedendo la formazione dell’elica
• Iterazioni idrofobiche tra amminoacidi distanti 3-4 residui possono compromettere la formazione dell’elica
• Se sono presenti amminoacidi con gruppo -R carico questo può compromettere la formazione del legame peptidico.

α-elica: La struttura caratterizza sia le proteine globulari che quelle fibrose:

• Proteine globulari: rappresenta il 78% della struttura di mioglobina ed emoglobina
• Proteine fibrose: α-cheratina è presente principalmente nelle cellule epidermiche presenti in capelli, lana, corna, piuma. Presenti anche nel collagene. Sono insolubili a causa della presenza di gruppi R non polari. Sono tenute insieme da ponti disolfuro, più sono numerosi più la catena è resistente α-cheratine α-elica α-cheratina. NB: le α-cheratine sono formate da un destrosa, due catene di α-eliche con la stessa direzionalità (con amminoacidi terminali alla stessa estremità) si avvolgono l’una sull’altra formando un super avvolgimento sinistroso opposto all’α-elica.

NB: il collagene è composto da tre catene α da non confondere con le α delle cheratine, superavvolte a formare una triplice elica destrosa.

Collagene

È la proteina più abbondante nei mammiferi (30% proteine totali). Tutte le forme di collagene hanno una composizione amminoacidica in cui si ripetono filamenti di glicina (35%), prolina e idrossiprolina (21%), questi sono tutti amminoacidi non essenziali, quindi con basso valore nutrizionale.

Struttura collagene

Struttura molto compatta e non elastica a causa dei numerosi residui di glicina e prolina che ne impediscono l’allungamento. I legami trasversali tra i filamenti di collagene aumentano la resistenza meccanica della struttura. La tipologia dei legami che si vengono a formare tra i collageni dipendono dalla funzione biologica e dall’età del tessuto. Il tropocollagene è l’unità di base del collagene.

Curiosità: la sostituzione di un residuo di glicina con lisina o serina causa l’osteogenesi imperfetta e la sindrome di Ehlers-Danlos.

Biosintesi del collagene

La biosintesi del collagene avviene sia all’interno che all’esterno della cellula. Nella fase iniziale i geni delle procatene vengono trascritti in m-RNA e successivamente tradotti a livello di ribosomi in catene polipeptidiche prepro-α; nella catena nascente di procollagene alcuni residui di prolina e lisina vengono idrossilati da due specifici enzimi (galattosio e glucosio) per formare idrossiprolina e idrossilisina con produzione di catena α di procollagene. Tre di queste catene si avvolgono a formare una tripla elica, stabilizzata da legami disolfuro intra/inter catena. Questa catena passa all’apparato del Golgi dove poi la molecola viene secreta all’esterno dove subisce l’azione del procollagene peptidasi, che rimuove i residui N-terminali e C-terminali con formazione del tropocollagene. Le molecole di tropocollagene tendono a disporsi in file parallele formando fibrille attraverso legami crociati.

Conformazione β

La conformazione β presenta uno scheletro della catena polipeptidica si estende formando una conformazione a zig-zag. Queste catene possono essere disposte una accanto all’altra formando una struttura che nel suo insieme presenta delle ripiegature. In questa disposizione detta foglietto i legami a idrogeno si formano tra regioni adiacenti delle catene polipeptidiche. I residui laterali R sono piccoli e idrofobici e si trovano sopra e sotto il piano della molecola. Le catene polipeptidiche adiacenti di un foglietto β possono essere:

• Parallele: struttura tipica delle proteine fibrose con legami a idrogeno intercatena;
• Antiparallele: struttura tipica delle proteine globulari con legami a idrogeno intracatena.

α-elica: le catene sono più distese rispetto all’α-elica. Stirando una catena si ottiene una struttura β (la distanza tra due amminoacidi è 3.5 Å contro 1,5 Å dell’α-elica).

Ripiegamenti

Nelle proteine globulari quasi un terzo dei residui amminoacidici si trova in ripiegamenti o anse, dove la catena inverte la sua direzione. Questi ripiegamenti collegano tra di loro tratti di α eliche o conformazioni β. Molto comuni sono i ripiegamenti che collegano le estremità adiacenti di due foglietti β. La struttura consiste in un ripiegamento di 180° di una sequenza di quattro residui, dove il gruppo carbonilico del primo residuo forma un legame a idrogeno con l’idrogeno legato all’azoto del quarto residuo. I residui coinvolti sono glicina e prolina, il primo perché piccolo e flessibile, il secondo perché il legame peptidico con l’azoto imminico della prolina assume la configurazione cis, una forma che si adatta al cambio di direzione.

Cheratine β

Le β-cheratine sono proteine prevalentemente insolubili, flessibili e non allungabili, un esempio sono le fibre della seta e delle tele dei ragni. Queste strutture sono stabilizzate da legami a idrogeno tra i gruppi peptidici. Questa tipologia di fibre è ricca di alanina e glicina che permettono di avvicinare molto le catene tra di loro e di formare un foglietto compatto in quanto le catene laterali R si integrano perfettamente.

Struttura terziaria

La disposizione di tutti gli atomi di una proteina nello spazio (anche a lungo raggio) viene definita come struttura terziaria. La struttura terziaria consiste in un ripiegamento della catena (folding) per formare una struttura tridimensionale ben definita. Parti lontane della catena vengono a trovarsi spazialmente vicine creando siti specifici di riconoscimento per particolari molecole. A stabilizzare la struttura terziaria concorrono legami a idrogeno e legami covalenti. In genere i residui polari si dispongono rivolti verso la superficie a contatto con H₂O, mentre quelli apolari all’interno della proteina.

Esperimento di Anfinsen

L’esperimento riguarda la denaturazione e la rinaturazione della ribonucleasi.

• Prendere proteina nativa, ovvero cataliticamente attiva;
• Aggiunta di urea e mercaptoetanolo;
• La proteina si srotola (inattiva) e i ponti disolfuro sono ridotti a residui di cisteina.
• Allontanamento di urea e mercaptoetanolo per passaggio diretto a punto 74;
• Allontanamento mercaptoetanolo;
• Stato inattivo a causa di ponti disolfuro non corretti;
• Aggiunta di mercaptoetanolo e successivo allontanamento di mercaptoetanolo e urea;
• Raggiungimento stato nativo cataliticamente attivo, i ponti disolfuro di cisteina si sono formati correttamente.

Questo esperimento dimostra che:

• La sequenza specifica la conformazione e quindi l’attività biologica
• La conformazione è in funzione dell’ambiente
• La conformazione nativa è quella termodinamicamente più stabile (minor contenuto energetico)

Difetti struttura terziaria

Difetti nell’avvolgimento delle proteine possono causare molte malattie. Un errato avvolgimento che porta alla formazione di una fibra extracellulare insolubile amiloide (amiloidosi) è alla base di molte malattie. Un quarto di tutti i polipeptidi sintetizzati viene distrutto a causa di un errato folding.

Malattie da prioni

I prioni (PrP) sono delle normali proteine presenti nel cervello degli organismi superiori la cui funzione non è nota. Per eventi ancora non completamente chiariti la proteina può modificare un tratto della sua struttura da α-elica (PrP_C) a foglietto β (PrP_Sc) innescando un processo a cascata che porta alla completa trasformazione di tutti i PrP in PrP_Sc. Il PrP_Sc non subisce degradazione proteolitica (turnover proteico) e si accumula nel tessuto cerebrale determinando una degenerazione spongiforme che porta a lungo termine a forme di demenza e morte (BSE o mucca pazza nei bovini, scrapie negli ovini, morbo di Creutzfeld-Jacob nell’uomo).

NB: Prion (Proteinaceous infections only)

Struttura quaternaria delle proteine

La struttura quaternaria deriva dalle interazioni deboli (identiche a quelle che stabilizzano la struttura terziaria) che si stabiliscono tra più catene polipeptidiche (subunità) identiche o diverse per dare complessi proteici tridimensionali chiamati oligomeri o multimeri se il numero delle subunità è molto elevato.

Limiti dimensione delle proteine

• È più semplice ed efficace sintetizzare molte copie di una proteina piccola che una sola copia di una proteina molto grande
• La maggior parte delle proteine che hanno massa