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crescita della macromolecola e quindi, di fatto, si avrà una troncatura della sintesi della macromolecola. In pratica

abbiamo una prima fase che corrisponde alla fase di aggancio tra il Nucleoside e la catena polinucleotidica. Il passaggio

immediatamente successivo vede il Nucleotide sbagliato e, di conseguenza, la Polimerasi non riconosce più il suo

substrato e quindi non riesce ad andare a legare un’altra base alla catena in cres cita. Ricordiamo però che, come ogni

danno al DNA, possiamo avere l’intervento degli enzimi di riparazione che annullano l’effetto della reazione che, pur

essendo covalente, non è irreversibile. Di conseguenza attraverso questa metodica avremo solo un rall entamento della

proliferazione cellulare e non una cessazione completa.

ALTRI ANTIMETABOLITI DELLE BASI DEL DNA

Per quanto riguarda la Guanina abbiamo come antimetaboliti la

6-Mercaptopurina e la 6-Tioguanina. Queste sono delle purine

in cui abbiamo lo zolfo al posto dell’ossigeno. Questo è un chiaro

esempio di sostituzione bioisostera per l’ossigeno. Possiamo

anche avere delle modificazioni al Ribosio e quindi delle

modificazioni che avvengono all’anello zuccherino. In questo

caso abbiamo, come opzioni, una variazione della chiralità

dell’anello oppure una sostituzione di gruppi dell’anello

zuccherino. Ad esempio nella Citarabina abbiamo modificato la

configurazione stereochimica del carbonio in posizione 2 del

ribosio. Una modificazione dal punto di vis ta stereochimico,

ovviamente, ha le sue conseguenze nel processo di sintesi del

DNA. L’incorporazione, il più delle volte, viene bloccata con un

rallentamento generale del processo di proliferazione cellulare.

Un esempio della seconda opzione presentata è la Gemcitabina

che corrisponde a un ribosio in cui la posizione 2 del Ribosio è

stata disostituita con due Fluori. Questo antimetabolita, usato

soprattutto per le forme di tumore al Pancreas, è estremamente

efficace. Dal punto di vista chimico-sintetico la Gemcitabina ha il vantaggio di non presentare dei carboni asimmetrici in

quanto il carbonio 2 presenta due sostituenti uguali. Capiamo quindi che la sintesi del Fluoroderivato è più facilitata

rispetto alla Citarabina in quanto nel primo caso non dobbiamo rispettare una stereochimica, condizione necessaria

invece per l’Ara-C. Venerdì, 6 Novembre 2015

Per quanto riguarda gli antimetaboliti riassumiamo il tutto dicendo che il meccanismo d’azione con cui essi lavorano

corrisponde allo spiazzare il metabolita naturale dalla sede enzimatica. L’idea del Metotressato, come detto, derivava

dal fatto che si pensava che la forma dell’Acido Folico, interagente con la DHFR, fosse la forma Imminica e quindi si cercò

di isolare una struttura che impedisse l’equilibrio tautomerico dell’Acido Folico. L’Acido Folico, essendo rappresentato

da un equilibrio tra le due forme tautomeriche, legava parzialmente il recettore mentre il Metotressato, non

presentando un equilibrio tautomerico, avrebbe mostrato una affinità decisamen te più elevata per il recettore.

Evidentemente, come abbiamo potuto vedere, l’idea di partenza non era corretta in quanto l’Acido Folico interagisce

nella sua forma ammidica e non nella forma imminica. In ogni modo la geometria tra le strutture è differente, la forma

è differente e l’efficienza del Metotressato è elevata. Tutti questi fattori, alla fine, portano a una efficacia della molecola

sviluppata che quindi può essere usata come farmaco. L’importante, quindi, è che l’antimetabolita impedisca al

metabolita di essere processato e quindi impedisca al metabolita di dare origine alle strutture fondamentali per la

costruzione di acidi nucleici che permettono la trascrizione e la replicazione della cellula. Attraverso i farmaci antiblasti ci,

come abbiamo detto, andiamo a sfruttare una proprietà intrinseca delle cellule tumorali (elevata capacità proliferativa)

per intervenire in maniera efficace sulla malattia neoplastica. Come sappiamo questo tipo di terapia è generica e

parecchio grossolana. Il fatto che le cellule si replichino velocemente porta a una maggiore esposizione dell’acido

nucleico rispetto alle cellule somatiche del nostro organismo e quindi l’acido nucleico delle cellule tumorali è più

facilmente danneggiabile. Ricordiamo che la cromatina, inizi almente, è una struttura compatta e poco accessibile.

Evidentemente, in questo caso, ogni composto proveniente dall’esterno fa fatica a interagire con queste strutture. Man

mano che parte la replicazione la struttura compatta si espande sino alla rimozione degli istoni. In questo caso l’acido

nucleico è molto più esposto all’esterno e quindi possiamo pensare che il farmaco possa interagire più velocemente con

NICOLA MORO – APPUNTI DI CHIMICA FARMACEUTICA E TOSSICOLOGICA 1

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questa forma di cromatina (forma replicante). Se troviamo il modo di interferire con la struttura d ell’acido nucleico

danneggiandolo in maniera tale che questo danneggiamento sia irreversibile allora possiamo andare a sviluppare

farmaci molto efficaci che però, ripetiamo, sono abbastanza grossolani. In questo modo raggiungiamo, almeno in parte,

il nostro scopo che è quello di eliminare le cellule danneggiate con il minor numero di effetti collaterali possibili. Esistono

una serie di farmaci che hanno come bersaglio gli acidi nucleici. Arriveremo, alla fine della discussione sugli antitumorali,

parlare di alcuni farmaci che invece sono abbastanza selettivi nei confronti di queste cellule (Inibitori della Telomerasi e

gli Agenti a Struttura Oligonucleotidica).

FARMACI ANTICANCRO DIRETTI CONTRO GLI ACIDI NUCLEICI

Gli agenti che sono in grado di andare a da nneggiare il DNA di una cellula fino a portare la stessa verso la morte sono gli

agenti alchilanti. Abbiamo visto che gli agenti alchilanti sono delle sostanze cancerogene in quanto essi portano a delle

mutazioni. È chiaro che in questo caso andiamo di proposito a inserire delle mutazioni nell’acido nucleico di una cellula

già di per sé malata in modo tale da portarla a morte per eccesso di danno. Questo è dovuto al fatto che la cellula, in

seguito a tutti i danni accumulati, la cellula non è più in grado d i sopravvivere. Questi composti, quindi, sono dei

composti cancerogeni (es. Mostarde Azotate) che vanno a interferire con il patrimonio genetico. A volte può anche

capitare che, andando a curare un cancro primario, si venga a formare un cancro secondario a causa di questi agenti. In

alcuni libri anche i Complessi del Cis -Platino sono considerati agenti alchilanti pur essendo dei complessi di

coordinazione. Abbiamo poi degli agenti che sfruttano dei processi naturali come il processo di variazione topologica

del DNA (Topoisomerasi). Questi agenti sfruttano questo aspetto di processamento del DNA per creare una condizione

tale da bloccare la struttura dell’acido nucleico in una forma “tagliata” dall’enzima che non è suscettibile ai processi di

riparazione e quindi porta alla morte cellulare. Spesso, la morte cellulare indotta da questi danni massivi, avviene per

via apoptotica quindi abbiamo anche un vantaggio dal punto di vista della terapia. Abbiamo infine agenti che, per

processi ossidativi o processi riduttivi, attivano delle reazioni chimiche a carico dell’acido nucleico che degradano l’acido

nucleico stesso. La degradazione dell’acido nucleico, ovviamente, corrisponde alla morte cellulare. I farmaci in fase di

sviluppo sono gli agenti che interferiscono con la Telomerasi e gli Agenti a Struttura Oligonucleotidica. Assieme agli

agenti che interferiscono con la Telomerasi tratteremo anche gli aspetti Epigenetici e della Istone Deacetilasi. Gli Agenti

a Struttura Oligonucleotidica sono particolarmente interess anti in quanto, ora che si sono scoperti gli RNA non

codificanti (strutture di acido nucleico che interferiscono con l’acido nucleico e quindi con gli Oncogèni e gli

Oncosoppressori), possiamo andare a costruire delle strutture oligonucleotidiche che ricon oscono dei bersagli tipici

della malattia cancerosa e che agiscono su questi bersagli in maniera selettiva.

PROCESSI DI ALCHILAZIONE

Per alchilazione intendiamo l’addizione di un elettrofilo a un sito nucleofilo del DNA

presente sulle basi azotate. Vediamo la struttura del DNA in cui mettiamo in evidenza

l’appaiamento delle basi G—C. possiamo notare che le coppie di basi sono caratterizzate

da un solco maggiore (che possiede una superficie di esposizione maggiore) e da un solco

minore (possiede una superficie di esposizione minore). Teniamo presente che

solitamente gli enzimi che processano il DNA vanno a legarsi a livello del solco maggiore

e quindi vanno a interferire con la parte più ampia anche perché si ha un numero

maggiore di elementi di riconoscimento. I gruppi nucleofili che possono reagire con un

elettrofilo e che quindi, di fatto, possono subire processi di alchilazione sono

essenzialmente relativi alla presenza di Azoto. In particolare il gruppo più nucleofilo che

esiste a livello delle basi del DNA corrisponde all’azoto 7 della Guanina. L’azoto 7 della

Guanina, infatti, giustifica circa il 75-80% delle reazioni chimiche che avvengono a carico

del DNA. Il nostro principale bersaglio, quindi, è la Guanina nella zona esposta a livello

del solco maggiore. Abbiamo anche altre possibilità che però sono molto meno

significative. Abbiamo anche ad esempio l’Azoto 3 dell’Adenina, che si trova a livello del

solco minore, che è un buon nucleofilo pur rappresentando meno del 10% delle reazioni

a carico dell’acido nucleico. Se consideriamo il nostro sistema a livello globale possiamo

dire che è quasi sempre l’Azoto 7 della Guanina a reagire con gli elettrofili. In rari casi

anche l’Azoto 2 della Guanina è reattivo. La reattività di questa posizione è

principalmente legata a dei fenomeni di riconoscimento selettivo del solco minore. In

pratica abbiamo un primo processo di complessamento reversibile seguito da un

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processo di alchilazione che avviene in seguito a una reazione intramolecolare. Essenzialmente, quindi , abbiamo una

base che è più facilmente attaccabile. Nel momento in cui andiamo ad alchilare l’azoto in 7 avremo la formazione di un

sale di ammonio carico (prodotto instabile) e questo comporta un processo di depurinazione (eliminazione della base).

In pratica si ha il ribaltamento del legame tra l’Azoto e lo zucchero in modo tale che si abbia la neutralizzazione dell’Azoto

7 in seguito a ribaltamento dei doppietti elettronici. In seguito a questo processo abbiamo la formazione di un sito

apurinico che è un sito molto labile che può essere facilmente idrolizzato. Anche in questo caso, quindi, potremo andare

a sviluppare dei farmaci che possiedano dei gruppi elettrofili in grado di andare a interagire con le posizioni nucleofile

sensibili delle basi a livell o del DNA.

DANNI COVALENTI AL DNA

Abbiamo dei sistemi che sono Monofunzionali. Un sistema monofunzionale crea un unico addotto covalente alchilato.

Un danno monofunzionale, quindi, corrisponde alla possibilità di poter alchilare con un'unica funzione del farmaco. Il

farmaco che possiede una azione mono-alchilante, quindi, è un farmaco che possiede un solo sito d’azione che quindi

andrà ad alchilare, con il 75% di probabilità, l’Azoto 7 della Guanina. Se abbiamo dei farmaci che possiedono più

funzionalità alchilanti allora l’alchilazione può avvenire in due tempi. In un primo momento avremo l’alchilazione di un

primo sito nucleofilo e, una volta terminata la reazione, avremo la possibilità che il nostro farmaco interagisca con una

seconda zona dell’acido nucleico dando origine a dei legami Bifunzionali (Cross-Links o Legami Crociati). Come possiamo

vedere nella figura questi legami bifunzionali possono essere Intracatena (due basi azotate successive) oppure

Intercatena (due basi appartenenti a filamenti diversi del DNA). Il tipo di danno più grave, da cui la cellula si deve

riguardare, è il danno bifunzionale Intercatena in quanto è ovvio che un qualsiasi enzima deputato alla riparazione del

danno è obbligato ad andare a effettuare una rottura di

entrambi i filamenti del DNA e quindi non si ha più lo

stampo. Nel caso in cui il danno sia Intracatena, invece, si

attiva il meccanismo di riparazione chiamato Excision

Repair che, dopo aver eliminato il segmento di DNA

danneggiato, ricostruisce la sequenza corretta s fruttando

lo stampo di DNA complementare. Se invece il danno è

Intercatena allora questo è indicativo del fatto che

entrambi i filamenti sono stati danneggiati e quindi la

riparazione diventa molto più complessa. Anche il danno

bifunzionale intracatena è un danno importante, ma,

fortunatamente, il danno viene riparato in maniera più semplice.

AGENTI ALCHILANTI

MOSTARDE AZOTATE

Le Mostarde Solforate venivano utilizzate come Gas Nervini tossici che portavano a morte ed erano

composti molto reattivi che causavano alchilazione degli acidi nucleici con conseguenze letali per

i soldati che respiravano questi gas. Da questi fatti si svilupparono le Mostarde Azotate. La prima,

e più nota, è la Mecloretamina che corrisponde a un Dicloroderivato di una Ammina Terziaria .

Questa molecola è una delle Mostarde Azotate efficace dal punto di vista terapeutico. A questa

molecola sono succedute diverse molecole come il Clorambucile e il

Melfalan (derivato della Fenilalanina) che possiedono un anello

aromatico legato all’Azoto ed eventualmente un gruppo funzionale carbossilico o amminico

terminale. Osservando la struttura del Melfalan possiamo notare che essa è molto simile alla

struttura della Fenilalanina. Questo è stato sviluppato in quanto si riteneva che la Fenilalanina

avesse tropismo per i tessuti dove poteva attecchire il melanoma ed

infatti questo farmaco venne ideato per agire su questo tipo di tumore.

In pratica l’idea era stata quella di legare alla Mostarda Azotata una

specie di struttura di trasporto per portare in maniera abbastanza

selettiva il farmaco al bersaglio. L’ultimo tipo di molecola che andiamo

a vedere è una Fosforammide e, in particolare, una Tiofosforammid e

chiamata Tiotepa che, possedendo anelli a tre termini, è estremamente reattiva a causa

dell’elevata tensione di anello. La Tiotepa, quindi, da un lato ha una forma attenuata di lipofilia a

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causa del legame Fosforo-Zolfo ma abbiamo anche una reattività aumentata a causa della presenza degli anelli a tre

termini.

Meccanismo

Vediamo che la Mecloretamina (o altre strutture simili in quanto il gruppo –R può rappresentare anche un anello

aromatico) ha la possibilità di subire una

reazione nucleofila intramolecolare in

cui il doppietto dell’azoto reagisce con il

carbonio legato al Cloro. In questo modo

si ha la chiusura dell’anello a tre termini

con la formazione dello ione Aziridinio. La presenza del Cloro quindi assicura la

possibilità di generare una forma attivata della struttura Aziridinica che reagisce

facilmente con nucleofili anche non molto forti come ad esempio l’Azoto in posizione 7

della Guanina (vedi immagine). Abbiamo inoltre una doppia funzionalità in quanto il

doppietto elettronico dell’Azoto può andare a reagire ulteriormente creando una

seconda struttura Aziridinica che, a questo punto, ha la possibilità di andare a reagire

una seconda volta con un’altra struttura nucleofila. Questo fatto determina la possibilità

di avere quello che si chiama Crosslinkaggio. In questo modo si ha la connessione di due

filamenti di DNA l’uno con l’altro attraverso la struttura della Mostarda Azotata. In

pratica l’acido nucleico si crosslinka in quanto i danni, solitamente, avvengono su due

catene differenti. Il danno generato è un danno “subdolo” in quanto gli enzimi di

riparazione hanno difficoltà a riconoscere il danno al DNA. La molecola è crosslinkata

all’interno della doppia elica. Dall’esterno dell’acido nucleico, quindi, non si notano delle

variazioni significative. Una volta che è stato effettuato un crosslinkaggio si ha l’impossibilità della separazione delle due

catene e quindi la replicazione del DNA è impedita. Riassumendo, quindi, il DNA non può né essere riparato né essere

replicato e, per questi due motivi, la cellula è indotta a morte. Il problema di questa tipologia di farmaci è che sono

estremamente elettrofili e, di conseguenza, saranno in grado di andare a reagire con un qualsiasi nucleofilo (anche con

l’acqua) e non solo il DNA. Al nucleo, quindi, arriverà solo circa il 2% della quantità somministrata. Il restante 98% viene

perso per reazioni con amminoacidi basici, acqua (idrolisi dell’Aziridina con conseguente inattivazione della molecola)

La resa del processo è quindi assolutamente insufficiente se teniamo conto dei danni che vengono generati dal

momento della somministrazione fino all ’arrivo al bersaglio farmacologico. Avremo quindi effetti collaterali gravi,

multipli e complessi. Per fare in modo di diminuire la sua reattività, permettendo al farmaco di arrivare al target

terapeutico in quantità maggiori, si è scelto di aggiungere un anello aromatico che permette una riduzione della

nucleofilicità dell’azoto (una ammina aromatica è meno reattiva di una ammina alifatica). Per questi motivi è stato

sintetizzato il Clorambucile che riduce l’attività della struttura Aziridinica permettendo l’arrivo di una quantità maggiore

di farmaco al sito attivo. Al di là dello scopo originario, che era quello di indirizzare il farmaco verso un preciso tessuto ,

c’è anche l’aspetto della reattività che è assolutamente importante e necessario per dire che si ha a che fare con un

farmaco non tossico a livello sistemico.

Meccanismo Ciclofosfamide

Per rendere maggiormente efficace il processo di trasporto al sito attivo si è costruita una struttura che rappresenta un

Pro-farmaco chiamato Ciclofosfamide. Questa struttura, di per sé, è scarsamente alchilante. Questa viene attivata

metabolicamente con l’addizione di un idrossile in posizione 4 in seguito alla reazione catalizzata dal Citocromo con la

formazione della 4-Idrossifosfamide. L’Idrossifosfamide si apre essendo in equilibrio con l’Aldofosfamide. Otteniamo

quindi una struttura aperta che mostra un gruppo aldeidico terminale in posizione 4 e un amminogruppo legato al

fosforo.

NICOLA MORO – APPUNTI DI CHIMICA FARMACEUTICA E TOSSICOLOGICA 1 78

La 4-Idrossiciclofosfamide a sua volta è soggetta a ossidazione che

porta a una struttura chetonica partendo dalla struttura alcolica. La

struttura Chetonica è un metabolita inattivo. In questo caso, quindi,

abbiamo una prima reazione metabolica iniziale che porta alla

formazione del prodotto ossidrilato in equilibrio con la forma

aldeidica. Il prodotto ossidrilato viene nuovamente ossidato alla

forma 4-cheto (inattiva).

L’Aldofosfamide, invece, viene ossidata nella forma carbossilata con

formazione della Carbossifosfamide che è ancora inattiva. La specie

attiva deriva dall’idrolisi dell’Aldofosfamide. L’idrolisi del legame

estereo P—O da un lato libera la struttura ossidrilata dell’aldeide

insatura (Acroleina) e dall’altro libera Mostarda fosforammidica che,

analogamente a quanto visto con la Tiotepa, dà origine a strutture

Aziridiniche reattive (meno reattive della strutture amminiche

viste). Sia la Mostarda sia l’Acroleina sono strutture elettrofile e quindi entrambe sono in grado di generare danni a

livello cellulare.

Teniamo conto, però, che queste molecole sono in grado di reagire con tutti i siti nucleofili presenti all’interno della

cellula e non solo con il DNA.

NITROSOUREE

Vediamo ora una seconda classe di Alchilanti. Anche in questo caso possiamo capire che i Nitroso derivati sono

estremamente reattivi e questo è comprens ibile anche in seguito ai ragionamenti fatti nei giorni scorsi. Anche in questo

caso avremo, in contemporanea, degli effetti tossici e degli effetti terapeutici (morte delle cellule cancerose). Le N-

Nitrosouree sono i derivati nitrosati dell’Urea. Sono del le strutture instabili che possono scindersi in due strutture

ovvero un Diazoidrato (forma idratata di un sale di diazonio) e in un Isocianato che sono entrambe delle specie elettrofile

estremamente reattive e tossiche per l’organismo umano.

Il sale di diazonio, che deriva dalla variazione del pH, si scinde in un Carbocatione e in una molecola di azoto. Il

Carbocatione, ovviamente, è una specie alchilante che può andare ad alchilare l’Azoto in posizione 7 della Guanina.

Esistono principalmente due clas si di N-Nitrosouree che possono avere o un gruppo Cloroetilico legato all’atomo di

Azoto oppure il gruppo Cicloesilico legato sempre all’azoto. Otteniamo così due composti noti con il nome BNCU

(Carmustina) e CCNU (Lomustina). La differenza tra i due consi ste nel tipo di catena laterale che sarà poi presente nel

gruppo Isocianato che si viene a creare in seguito alla reazione vista in precedenza. La struttura iniziale, invece, è

esattamente la stessa. NICOLA MORO – APPUNTI DI CHIMICA FARMACEUTICA E TOSSICOLOGICA 1

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Meccanismo

ANTRAMICINA

Fino ad ora abbiamo avuto a che fare con farmaci che vanno ad agire in maniera sistemica nell’organismo e che

reagiscono contro gli acidi nucleici per un puro discorso statistico e di probabilità. L’Antramicina è il primo tentativo di

sviluppare un farmaco che sia indirizzato verso il DNA. Per fare questo l’Antramicina contiene una struttura triciclica che

termina in un gruppo ammidico. Questa struttura, come possiamo notare, si adatta molto bene al solco minore del DNA

in quanto si ha un riconoscimento tramite dei legami a ponte di Idr ogeno. La forma curva della molecola giustificherà

quindi la tendenza di sviluppare dei legami reversibili con l’acido nucleico in quanto, appunto, è complementare alla

struttura del solco minore e quindi tenderà a formare un complesso stabile che, ovviamente, favorirà la reazione

intramolecolare di alchilazione a carico del carbonio adiacente all’azoto presente nell’anello centrale.

Abbiamo quindi un legame specifico per il solco minore e una interazione con un

elettrofilo relativamente debole (nella struttura imminica il carbonio è debolmente

elettrofilo) e, di conseguenza, da un lato abbiamo un indirizzamento della struttura

verso un complesso che coinvolga il solco minore del DNA e dall’altro abbiamo la

possibilità che l’elettrofilo si trovi proprio nelle vicinanze dell’Azoto in posizione 2

della Guanina e quindi abbiamo una elevata probabilità che si possa alchilare l’Azoto

2 della Guanina portando a un addotto legato in maniera irreversibile all’acido

nucleico. Abbiamo quindi un tipo di processo reversibile che permette

l’avvicinamento delle funzionalità reattive della molecola ai siti nucleofili del DNA comportano un aumento della

probabilità che avvenga il processo intramolecolare di alchilazione irreversibile. La molecola, quindi, aderisce al solco

minore del DNA che, solitamente, è ricoperto d’acqua che viene spiazzata per permettere la formazione di legami a

ponte di idrogeno tra l’Antramicina e l’acido nucleico. Il complesso è inizialmente reversibile ma tutto sommato stabile.

Il complesso viene ulteriormente stabilizzato in seguito al legame covalente che si viene a creare tra l’N2 della base

azotata e il sito elettrofilo dell’Antramicina.

NICOLA MORO – APPUNTI DI CHIMICA FARMACEUTICA E TOSSICOLOGICA 1 80

MITOMICINA C

Questo è un esempio di una molecola che subisce una attivazione metabolica riduttiva. La Mitomicina è un prodotto

naturale molto efficace e molto tossico.

È una struttura abbastanza particolare poiché, in qualche modo, ricorda la struttura di una mostarda azotata. Vediamo

che abbiamo anche in questo caso la struttura Aziridinica (ciclo a 3 termini). Ha inoltre una struttura chinonica

(Amminochinone) che è condensata a due strutture parzialmente aromatiche. Abbiamo infine il quarto anello che

corrisponde al ciclo Aziridinico. Di per sé, la molecola, non è reattiva ma in seguito alla riduzione metabolica si ottiene

un Idrochinone ovvero una specie elettrofila che, attraverso i due siti reattivi, crea dei complessi bifunzionali con il DNA.

La reazione, in questo caso, avviene anche sull’Adenina e non solo sulla Guanina ed è quindi meno selettiva rispetto a

quelle viste in precedenza. Vediamo ora cosa succede dal punto di vista chimico.

Meccanismo

Il meccanismo con cui avviene la reazione della Mitomicina C è molto interessante in quanto potremo osservare che la

reattività è direttamente dipendente dalla riduzione metabolica che avviene sull’Amminochinone. Attraverso la

riduzione metabolica del Chinone, infatti, si ottiene un sistema aromatico. L’anello aromatico che si viene a formare

permette la formazione di una ulteriore struttura ciclica planare con la formazione di un doppio legame tra la posizione

9 e la posizione 9a.

La struttura 9,9a con il doppio legame è suscettibile a una reazione che porta a un ribaltamento di doppietti elettronici

con l’apertura dell’anello Aziridinico ottenendo così una struttura semichinonica. Questa struttura, quindi, diventa

reattiva alla posizione 1.

A questo punto la reattività passa al sito 1 dove si ha un primo attacco al sito nucleofilo del DNA.

NICOLA MORO – APPUNTI DI CHIMICA FARMACEUTICA E TOSSICOLOGICA 1

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Come possiamo notare la reazione della molecola con il DNA alla posizione 1 porta a un nuovo ribaltamento degli

elettroni con la riformazione del doppietto 9,9a e quindi si crea una situazione di possibilità di eliminazione del gruppo

Carbammidico alla posizione 10 con il ribaltamento del doppietto 9,9a alla po sizione 9,10. In questo modo siamo andati

a generare una struttura metilica.

La struttura metilica che si ottiene è molto reattiva ed elettrofila quindi può andare ad attaccare la struttura del DNA

che si trova nelle vicinanze per generare un sistema coordinato a livello del C1 e del C10.

Riassumendo, quindi, la molecola diventa attiva solo in seguito al processo di riduzione metabolica. Si ha a questo punto

la perdita di metanolo con la formazione di un doppio legame a livello delle posizioni 9,9a. La struttura formatasi

suscettibile a una reazione di spostamento dei doppi legami con apertura del sistema Aziridinico che porta all’attivazione

della posizione 1. La posizione 1 attivata reagisce con il sito nucleofilo del DNA andando a formare il primo add otto. In

seguito a migrazione dei doppi legami abbiamo la formazione di un gruppo metilenico reattivo che interagisce con un

secondo sito nucleofilo del DNA comportando quindi la formazione di un addotto bifunzionale.

COMPLESSI DI PLATINO (COMPLESSI DI COORDINAZIONE)

I derivati del Platino sono stati scoperti per puro caso. Quando i derivati del Platino sono stati scoperti si stava studiando

l’effetto del campo elettrico sulla crescita batterica. Ci si accorse che applicando questo campo elettrico le cellule

batteriche non si replicavano. L’idea iniziale fu che il campo elettrico in qualche modo impedisse la replicazione delle

cellule batteriche. Cambiando elettrodi, tuttavia, il fenomeno non si verificava. Si è quindi arrivati alla conclusione che

non fosse il campo elettrico di per sé ad avere queste proprietà anti -replicative ma che l’effetto dipendesse dal tipo di

elettrodo usato. La motivazione per cui le cellule batteriche non riuscivano a replicarsi era che in seguito all’applicazione

della corrente elettrica, necessaria per andare a sviluppare il campo elettrico, degli ioni del metallo usato come elettrodo

si liberavano in soluzione e, in particolare, con l’elettrodo al Platino si otteneva un blocco della crescita cellulare. Ci s i

accorse, quindi, che gli ioni Platino sono in grado di interferire in maniera efficace con la crescita batterica prima, e in

seguito si scoprì che le considerazioni erano valide anche per la crescita delle cellule tumorali.

Teniamo conto che i complessi del Platino trovano un ampio utilizzo nel caso del tumore al

Testicolo e danno ottimi risultati. Solitamente i complessi vengono formati principalmente con il

Pt (II) ma possono essere generati anche con il Pt(IV). Il legame del platino può essere gestito da

quello che viene chiamato Cis-Platino. I legami con l’Ammoniaca sono due legami di

coordinazione. Il Platino, quindi, è coordinato a due Azoti e a due Clori. In realtà questa struttura

può essere convertita anche in forma trans (stereochimicamente diverso) che è anche molto

meno reattiva.

NICOLA MORO – APPUNTI DI CHIMICA FARMACEUTICA E TOSSICOLOGICA 1 82

Il Cis-Platino è in equilibrio con dei complessi di idrolisi in cui il Cloro viene sostituito dall’acqua.

Di fatto la specie reattiva è la seconda specie mostrata nell’immagine sopra. La reattività è buona e la tossicità è elevata.

L’unica controindicazione è che questa molecola comporta degli accumuli a livello renale (il farmaco non viene escreto)

che possono causare alcuni danni. Quando si somministrano questi farmaci, infatti, è consigliato bere molto per aiutare

il corpo diluendo il prodotto di eliminazione. Non abbiamo quindi i problemi che abbiamo solitamente dovuti alla

necessità di migliorare e ottimizzare il farmaco per quanto riguarda la sua azione primaria ma necessitiamo di

ottimizzarlo per quanto riguarda gli effetti collaterali. Questo è un altro problema logico in quanto dobbiamo sempre

tenere presente che è necessario avere un rapporto beneficio/danno il più alto possibile. Se riusciamo a diminuire il

danno, quindi, a parità di beneficio abbiamo un notevole vantaggio. La pr oblematica legata all’attività del farmaco,

quindi, non è tanto connessa alla risposta primaria delle cellule cancerose ma agli effetti di tossicità del farmaco stesso.

La tossicità renale deriva dal fatto che le catene idratate formano legami idrogeno con la formazione di lunghe catene

polimeriche che non riescono ad essere escrete con le vie urinarie. Ovviamente queste catene causano i problemi renali

per il fatto che esse vengono accumulate e impediscono una corretta filtrazione degli altri scarti metabo lici. Per

affrontare queste problematiche sono stati sviluppati due derivati del Cis -Platino (Carboplatino e Oxaliplatino) che

presentano delle strutture leggermente diverse rispetto a quelle standard e che sono ancora ampiamente utilizzate.

Nel Carboplatino la coordinazione rispetto al Cisplatino è molto simile ma possiamo notare che, in primo luogo, abbiamo

un acido dicarbossilico e, in secondo luogo, abbiamo una struttura ciclica che stabilizza maggiormente il complesso e

causando, di fatto, una più difficoltosa addizione di acqua. Questo permette la formazione di polimeri sicuramente meno

lunghi che favoriscono, quindi, l’eliminazione per le vie urinarie. L’Oxaliplatino, invece, presenta sia i gruppi amminici

sia i gruppi carbossilici chelati. L’Oxal iplatino, quindi, presenta una scarsa reattività per quanto riguarda la reazione di

idrolisi e quindi dà origine a catene sempre meno lunghe (N.B. la reazione di idrolisi avviene comunque ma più

difficilmente e più lentamente). Queste sostituzioni permettono una diminuzione degli effetti collaterali senza incidere

sulla reattività originale. Abbiamo detto che la molecola reattiva è il sistema monoacquo derivato e, quello che si arriva

ad ottenere, sono una serie di addotti (non covalenti bensì di coordinazi one) che

possono andarsi a generare sia Intracatena (90%) sia Intercatena (5%). Il restante

5% è rappresentato dagli addotti che il Platino va a formare con le proteine e il

DNA. Come possiamo osservare nell’immagine abbiamo degli addotti 1 -2 e degli

addotti 1-3. Gli addotti 1-2 sono rappresentati dagli addotti che si creano tra due

basi successive mentre gli addotti 1-3 sono gli addotti che si vengono a creare tra

due basi distanziate da una terza base che si interpone tra le due coinvolte nel

legame (ad esempio un addotto su due Guanine in una sequenza –G—C—G—). La

causa principale del danno e dell’effetto citotossico, quindi, è legata alla

formazione di questi crosslink 1-2 e 1-3. Ricordiamo che le basi che solitamente

reagiscono sono le basi Pirimidiniche e non le basi Puriniche. Il Platino, interagendo

con le basi azotate del DNA, crea un allungamento del legame che, a sua volta,

comporta un piegamento dell’asse dell’elica del DNA. Possiamo notare

nell’immagine che il primo addotto che si viene a creare mantiene la struttura del

DNA lineare mentre con il secondo addotto si ha l’allungamento dei legami che porta al piegamento dell’asse dell’elica.

NICOLA MORO – APPUNTI DI CHIMICA FARMACEUTICA E TOSSICOLOGICA 1

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Possiamo osservare come l’addotto che lega due Guanine adiacenti

è notevolmente più dannoso in quanto distorce completamente la

struttura dell’acido nucleico. Abbiamo visto che un addotto

intercatena, dal punto di vista strutturale, è meno importante

mentre un addotto intracatena, a prescindere dal fatto che sia un addotto 1,2 o 1,3, provoca una curvatura note vole

che viene appunto riconosciuta come un danno e, in particolare, se questo danno è esteso allora diventa irreparabile.

Come possiamo vedere nell’immagine sopra riportata, inoltre, il monoaddotto risulta essere meno dannoso rispetto

all’addotto bifunzionale. Il monoaddotto, infatti, non danneggia visibilmente l’acido nucleico rendendo il danno meno

grave rispetto a quello causato dal diaddotto. Nel caso del diaddotto, quindi, gli enzimi di riparazione del DNA non

riconoscono la natura chimica del prodotto che ha causato la curvatura ma riconoscono la curvatura causata

dall’addotto al DNA. Mercoledì, 11 Novembre 2015

Dopo aver visto gli alchilanti, come agenti che danneggiano gli acidi nucleici, vediamo un’altra famiglia di composti che

interferiscono con la struttura del DNA (Bleomicine). Dall'altro lato vedremo anche i farmaci che agiscono interferiscono

con la costruzione/ distruzione del fuso mitotico (Alcaloidi della Vinca).

BLEOMICINA

In questo caso quello che abbiamo è un danno radicalico all’acido nucleico che è causato da un complesso metallico, in

particolare con il ferro, di un composto naturale che si chiama Bleomicina (capostipite della famiglia delle Bleomicine

che comprendono vari composti differenziati in funzione dei sostituenti che son o presenti nel dominio di legame con

l'acido nucleico o DBD). Queste molecole sono delle sostanze naturali, chirali e abbastanza complesse e sono costituite

da tre componenti. Abbiamo una parte centrale che è il

Dominio di legame con lo ione metallico (metal binding

domain), è un insieme di amminoacidi analoghi

(amminoalanina, metilvalerato, treonina, idrossiistidina)

che sono degli amminoacidi modificati organizzati in

maniera tale da formare una struttura ciclica (a

“canestro”) che permette ad uno ione metallico di

coordinarsi al centro con gli Azoti che presenti in grande

numero in questo dominio della molecola. Il primo

dominio risulta collegato ad altri due domini. Abbiamo un

Dominio Disaccaridico (caratterizzato da carboidrati

come il mannosio) e questi due strutture zuccherine sono

legate tra loro da quello che si chiama CHD (dominio

riguardante la parte zuccherina). Abbiamo inoltre una

zona, legata alla treonina, che è costituita o da Bitiazoli

(terminanti con uno zolfo protonato) (A2) oppure

terminanti con gruppi Guanidinici (B2) che sono

necessari per l’aggancio al DNA (DBD). Il Dominio Disaccaridico rende più solubile la molecola (teniamo conto che il peso

molecolare è molto elevato), va ad migliorare il processo di trasporto. Non ha, quindi, una fu nzione a livello recettoriale

o a livello della farmacodinamica ma andrà a migliora la farmacocinetica. Il dominio centrale (metal binding domain),

come detto, crea una sorta di gabbia in cui i vari Azoti sono coordinati in maniera tale da costituire un Cluster dove si

lega lo ione metallico (o più di uno ione metallico, che sono diversi in funzione del fatto che la molecola sia in fase di

trasporto o di azione a livello dell'acido nucleico). Se andiamo ad osservare il dominio di legame del DNA si può notar e

NICOLA MORO – APPUNTI DI CHIMICA FARMACEUTICA E TOSSICOLOGICA 1 84

che la strutture presenta dei gruppi guanidinici protonati per cui la struttura B2 è carica positivamente mentre la A2 è

carica positivamente intrinsecamente in quanto abbiamo uno zolfo carico all’interno della struttura. Questa

caratteristica comporta che entrambe le catene sono cariche positivamente per cui riusciranno a interagire facilmente

con i gruppi fosfato (carichi negativamente) della catena fosfodiesterea dell'acido nucleico che, sotto questo punto di

vista, può essere considerato un polianione. Questo farmaco, quindi, presenta una carica positiva e quindi in condizioni

fisiologiche sarà carico positivamente. Questo comporta la formazione d un legame elettrostatico con il gruppo fosfato

del DNA. Il legame elettrostatico, inoltre, facilita le interazioni successive. Vedremo che una parte di questa zona di

legame (quella bitiazolica) è in grado di inserirsi fra le coppie di basi e quindi formare dei ulteriori legami di tipo

idrofobico (legami π), che permettono di stabilizzare ulteriormente il legame tra il complesso della Bleomicina con il

DNA. La porzione carica, quindi, funge da controione nei riguardi del legame fosfodiestereo e dall'altro lato, un'altra

zona (che è particolarmente evidente nel caso nella Bleomicina A2) abbiamo una struttura planare (i sistemi tiazolici)

riescono a inserirsi fra le coppie di basi dell'acido nucleico a formare una specie di sandwich che stabilizza ulteriormente

il complesso. Abbiamo quindi due siti di agganc io che permettono di aumentare l’affinità della molecola con l'acido

nucleico. La molecola, quindi, è stata ingegnerizzata sia per essere trasportata più facilmente sia per coordinarsi con

ioni metallici che possono dare origine a processi redox, ma anche per legare l'acido nucleico con queste due “braccia”

cariche positivamente ed eventualmente contenenti questi sistemi planari che si inseriscono all'interno della catena

dell’acido nucleico. Se osserviamo la struttura tridimensionale, possiamo nota la

zona centrale (colorata in oro) che rappresenta lo ione

metallico coordinato da delle strutture cicliche. In alto

a destra è presente la zona legante il DNA (DBD)

mentre in basso a sinistra è presente il dominio CHD.

Nell’immagine a sinistra possiamo apprezzare come la

struttura Bitiazolica che si inserisce tra due coppie di

basi mentre il nucleo verde rappresenta lo ione

metallico che, come possiamo notare, si trova nelle

vicinanze della struttura fosfodiesterea. Abbiamo quindi una molecola che possiede una

specie reattiva nei confronti del DNA (ione metallico che attiva processi redox) e dall’altra

parte una specie reattiva che si lega in maniera efficace all’acido nucleico attraverso il

legame bitiazolico assieme all’interazione elettrostatica che coinvolge la specie protonata

(o carica) della bleomicina che interagisce con una interazione elettrostatica con i gruppi

fosfato dell’acido nucleico. Questa, quindi, è una molecola che la natura ha ingegnerizzato apposta per interagire e

interferire con la struttura del DNA e poterla poi danneggiare attraverso la presenza dello ione metallico che induce un

processo redox.

Meccanismo

Come possiamo osservare inizialmente la Bleomicina si trova al di fuori

della cellula ed è trasportata come complesso con lo ione Ra me (Cu II).

La Bleomicina-Cu(II) entra nel plasma e viene trasportata, tramite un

sistema di trasporto attivo, all’interno della cellula sempre sotto forma

di Bleomicina-Cu (II). Questa viene ridotta a livello intracellulare a

Bleomicina-Cu(I) da una Reduttasi. Il complesso rameoso [Cu(I]), in

presenza di ossigeno, si riossida ed è quindi una specie reattiva e

instabile. Questa cede un elettrone all’Ossigeno con formazione dello

ione superossido mentre il rame viene ossidato a Cu(II). La Bleomicina

all’interno della cellula può scambiare comunque anche con il Ferro. In

pratica il Rame si scambia con il Ferro. Non c’è infatti solo il complesso

Cu(I) reattivo ma c’è anche il complesso con il Fe(II) che, a sua volta,

può andare a ossidarsi a Fe(III) riducendo l ’ossigeno e formando un

complesso Fe(III)-OOH (perossido). Il Fe(II), quindi, si ossida a Fe(III) e

questa ossidazione produce l’anione perossido che e quindi abbiamo

una specie molto reattiva che è in grado di attaccare la catena dell’acido

nucleico. Abbiamo quindi il processo di trasporto che è mediato dal Rame, l’internalizzazione attiva e, una volta

all’interno della molecola il Rame può ridursi e quindi portare al complesso Cu(I) che a sua volta si riossida a Cu (II)

producendo ione superossido. Dall’a ltro lato ci può anche essere lo scambio con il Fe(II) con formazione del complesso

Belomicina- Ferro (II). A questo punto il Ferro si ossida nuovamente a Fe(III) con formazione della specie perossidica,

che è appunto una specie reattiva in forma radicalic a. Questo, quindi, è un processo che prevede due meccanismi,

sempre radicalici, con lo strappo in entrambi i casi di un idrogeno dalla posizione 4’ del desossiribosio.

NICOLA MORO – APPUNTI DI CHIMICA FARMACEUTICA E TOSSICOLOGICA 1

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Nell’immagine le linee blu rappresentano la catena di acido nucleico intatta. Nel primo passaggio In questo primo

passaggio viene strappato l’idrogeno in posizione 4’ però la catena è intera e quindi il DNA resta intatto. Chiaramente

abbiamo questo processo ossidativo che è alla base dell’attività biologica, dobbiamo prima avere l’ossidazione del Fe(II)

a Fe(III) e la formazione del complesso perossidico per avere poi la degradazione dell’acido nucleico.

Come detto abbiamo due meccanismi differenti:

1. Nel primo meccanismo si ha la somma di Ossigeno radicalico in posizione 4’. Si ha la formazione di un

perossoradicale in posizione 4’ che si protona e può dar origine all’apertura di anello con l’incorporamento di

un Ossigeno nel ciclo. In questo modo abbiamo la formazione di una struttura 1,3-Diossanica. Questa struttura

è altamente instabile e reattiva poiché sul Carbonio in posizione 4 si possono notare tre legami con ossigeno.

Si ha quindi un ribaltamento di doppietti che fa aprire l’anello del Diossano e fa ribattere i doppietti sull’ex

posizione 3’ dello zucchero e sull’Ossigeno del fosfato por tando quindi alla rottura della catena. Quando

abbiamo il ribaltamento del doppietto elettronico tra il legame C —O all’ossigeno del fosfato allora si ha la

3’

rottura della catena, separazione delle due catene di acido nucleico e quindi si avrà la degradazi one della

struttura del DNA. A questo punto la catena è rotta, c’è un riarrangiamento molecolare all’interno della

struttura in posizione 5’, e vediamo che sia ha una perdita di una Acroleina modificata con una base (B) e di

acido carbossilico che deriva dalla degradazione. La degradazione, quindi, porta a una rottura della catena (in

più di una posizione in funzione delle varie posizioni in cui si va a legare la Bleomicina) e alla fine si forma una

base propenale che è reattiva (che danneggia ulteriormente la cellula) e la struttura dell’acido nucleico viene

degradata.

2. Il secondo meccanismo parte sempre dal radicale in posizione 4’. In questo caso, però, invece che avere un

ossidazione con un perossido si ha l’attacco del gruppo ossidrilico. In questo cas o l’ossidrile crea comunque

una situazione di instabilità, con ribaltamento del doppietto dall’Ossigeno al legame C -O e quindi causa la

rottura del legame del sistema ciclico del deossiribosio con la formazione di un sito basico. Vediamo che la base

viene eliminata inizialmente e questo distacco della base con la formazione del gruppo Aldeidico crea ancora

una volta una situazione instabile e quindi di possibile coniugazione fra il gruppo carbonilico. A questo punto

abbiamo il ribaltamento del legame C-H a formare un doppio legame che porta a un ulteriore ribaltamento del

legame tra il Carbonio del ribosio e l’Ossigeno appartenente al gruppo Fosfato che a questo punto viene

liberato. Questo fatto porta quindi alla rottura della catena e alla degradazione del la struttura dell’acido

nucleico. Vediamo quindi che l’aldeide insatura rimane nella catena terminale in posizione5’.

Per cui si abbiamo due diversi meccanismi di degradazione che però devono essere preceduti da una ossidazione.

Definiamo quindi questi meccanismi come meccanismi di Degradazione Ossidativa. La conclusione è che la Bleomicina

fa morire la cellula perché, appunto, degrada l’acido nucleico e non permette all’acido nucleico di replicarsi o comunque

di andare ad sintetizzare le proteine codifi cate dal DNA. Questo, come sappiamo, porta alla morte (prevalentemente

per via necrotica) della cellula. Quello della Bleomicina è un meccanismo interessante perché prevede un meccanismo

di trasporto che, in qualche modo, è un sistema di difesa. La Bleomic ina, infatti, è un antibiotico e quindi funge da

NICOLA MORO – APPUNTI DI CHIMICA FARMACEUTICA E TOSSICOLOGICA 1 86

meccanismo di difesa contro eventuali attacchi da parte di agenti ostili. La Bleomicina quindi, creando delle condizioni

di distorsione del patrimonio genetico di queste strutture esterne, è una sostanza mol to reattiva che possiamo sfruttare

come farmaco. I meccanismi sopra descritti, pur agendo come meccanismi di difesa, sono dei meccanismi che possono

avvenire anche su cellule sane e non solo su quelle malate. Nel nostro caso, però, andiamo a sfruttare la d iversa velocità

di replicazione della cellula malata rispetto a quella sana che corrisponde a una maggiore esposizione dell’acido

nucleico. Nelle cellule cancerose, infatti, abbiamo una proliferazione molto rapida e quindi il DNA è più esposto anche

a danni derivanti da agenti esterni. In questo modo riusciamo a colpire in un numero maggiore le cellule malate piuttosto

che le cellule sane.

ANTIMITOTICI

Vediamo un altro meccanismo che è interessante e che

stavolta ha a che fare con la costruzione/distruzione del fuso

mitotico. Sappiamo che il fuso mitotico è necessario per la

replicazione cellulare. Prima di tutto si avrà la costruzione del

fuso mitotico attraverso i microtubuli che lo costituiscono e

questo deve assemblarsi, creare le condizioni di separazione

del patrimonio genetico tra cellula madre e cellula figlia e,

infine, il fuso mitotico si dovrà distruggere portando la cellula

nuovamente alle condizioni originarie con la conclusione

della mitosi e la separazione della cellula madre dalla cellula

figlia. Il fuso mitotico è costituito da due elementi

fondamentali che sono la α-Tubulina e la β- Tubulina. Queste

proteine si alternano in modo da costruire quello che viene chiamato protofilamento che, assemblandosi, permette la

costruzione del microtubulo. Il microtubulo ha una lunghezza di circa 50nm ed è cavo all’interno. Il microtubulo, come

dicevamo, deve costruirsi ma anche deve distruggersi in quanto deve andare a creare il fuso mitotico in un

riarrangiamento tale da costituire la mitosi ma, una volta terminato il processo, deve essere in grado di distruggersi per

completare la mitosi. Questo processo è gestito da un nucleoside trifosfato (Guanosina Trifosfato) che viene convertito

in nucleoside difosfato (Guanosina Difosfato). L’assemblaggio e il disa ssemblaggio di queste due proteine, mediato dal

legame con GTP e GDP, è quindi il processo fondamentale che permette la costituzione e la distruzione del microtubuli.

Il complesso α-β Tubulina, costituito dalle due proteine che si susseguono lungo il micro tubulo, nel caso in cui leghi il

GTP permette la formazione del microtubulo. In particolare il GTP va a legarsi alla β-

Tubulina. Il GTP è determinante in questo processo in quanto permette la

polimerizzazione della catena la condizione di costituzione del fuso mitotico. Quando il

fuso mitotico non serve più la distruzione del fuso mitotico avviene attraverso l’idrolisi

del GTP che si converte in GDP. La GDP cambia la struttura del complesso tubulinico

portando a un piegamento (la struttura non è più lineare ma tende a curvarsi) e potremo

notare un arricciamento della porzione terminale del microtubulo. Questo

arricciamento, causato dall’idrolisi del GTP, porta alla degradazione e alla separazione

dei vari microtubuli e quindi poi alla conclusione del proces so della mitosi. È chiaro che

dal momento che noi siamo in grado di andare a intervenire e interferire con questo

processo allora interveniamo anche sul processo di replicazione della cellula. Se siamo

in grado di bloccare la mitosi allora evidentemente si amo in grado di non far replicare

la cellula e quindi di andare a evitare la nascita di una progenie di cellule malate. La Tubulina GTP, ovviamente, è diversa

dalla Tubulina GDP in quanto l’idrolisi provoca una variazione strutturale della microtubulina e fa in modo da facilitare

il disassemblaggio del microtubulo attraverso il ripiegamento e l’arricciamento dei terminali della struttura. Finché è

legato al GTP allora il microtubulo è lineare e non si degrada mentre nel momento in cui abbiamo l’idrolisi del GTP in

GDP allora il microtubulo comincia ad arricciarsi e a degradarsi perdendo le varie subunità di α e β Tubulina. Quello che

possiamo fare, dal punto di vista terapeutico, è di impedire la formazione del microtubulo andando a rendere

impossibile la mitosi (se il microtubulo non si forma allora non si forma nemmeno il fuso mitotico e di conseguenza non

si attiva il processo di mitosi) oppure possiamo intervenire stabilizzando il fuso mitotico e impedendo così la conclusione

della mitosi. Abbiamo quindi due potenziali meccanismi terapeutici che sfruttano, analogamente a quelli già visti, la

velocità di replicazione e che tenderebbero a bloccare la formazione del microtubulo nel momento in cui questo si

assembla (impediamo la costruzione del fuso mitotico) oppure a stabilizzare il fuso mitotico ed impedire che questo

venga disassemblato in modo tale che la cellula non possa concludere la sua replicazione. Abbiamo due famiglie di

NICOLA MORO – APPUNTI DI CHIMICA FARMACEUTICA E TOSSICOLOGICA 1

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farmaci, entrambi prodotti naturali. Tassolo e Alcaloidi della Vinca sono prodo tti attraverso i quali la natura si difende

nei confronti di agenti esterni come ad esempio microrganismi considerati aggressivi.

1. Alcaloidi della vinca: impediscono la formazione del microtubulo e quindi andiamo ad agire a monte della

mitosi impedendo, di fatto, la formazione del fuso mitotico e quindi impedendo il processo di mitosi.

2. Tassolo e derivati: mediante il Tassolo si lavora sul blocco della disaggregazione del microtubulo. In questo caso

il fuso mitotico rimane intatto e quindi si blocca il processo mitotico e quindi, di conseguenza, la replicazione

cellulare.

Abbiamo quindi due famiglie di composti naturali che agiscono in maniera diversa una rispetto all’altra ma entrambe

portano allo stesso risultato finale ovvero quello di impedire la replicazione della cellula.

ALCALOIDI DELLA VINCA

Gli alcaloidi della vinca provengono dal Catharanthus Roseus e quindi sono gli estratti di una pianta. Sono molecole un

po’ complicate di cui non dobbiamo conoscere la struttura ma è importante capire quali sono l e componenti principali

di queste molecole. Alcaloide è indicativo di una specie alcalina e quindi protonabile. Osserviamo la struttura di alcuni

componenti di questa famiglia.

Come possiamo osservare la basicità deriva non dall’azoto dell’indolo (che è aromatico) ma dalle strutture amminiche

terziarie che sono molto basiche. Chiaramente le varie ammine possiedono differente basicità in funzione del fatto che

siano legate a gruppi alifatici o aromatici. Il motivo per cui queste sostanze sono dette Alcaloi di, quindi, è il fatto che

sono sostanze alcalinizzanti in virtù degli azoti amminici presenti nella struttura molecolare. Possiamo osservare che

l’Alcaloide è costituito da due sistemi ciclici. Uno prende il nome di Catarantina (sistema a cicli condensati nella parte

superiore della molecola) ed è un derivato Indolico mentre l’altro che si chiama Vindolina (sistema a cicli condensati

nella parte inferiore della molecola) che è un sistema a cinque cicli condensati parzialmente aromatico. Si hanno 2

componenti cicliche una derivante dall’Indolo (Catarantina) e che possiede una ammina terziaria protonabile e che

presenta, legato all’anello, un gruppo estereo. Dall’altro lato abbiamo il sistema a cinque cicli condensati, parzialmente

aromatico, che presenta due gruppi esterei. Vediamo ora queste proprietà molecolari cosa possono suggerirci dal punto

di vista dei meccanismi di azione. La molecola presenta 3 gruppi esterei (in rosso) che sono idrolizzabili. Questi, però,

non sono equivalenti. Due di questi, in seguito a idrolisi, danno origine ad un acido carbossilico legato alla molecola

mentre nell’altro caso rimane l’ossidrile. In funzione del processo metabolico possiamo avere, quindi, due situazioni

diverse. Un processo ci porterà alla formazione di carbossilati (situazione sconveniente in quanto formano dei sali interni

che cambiano completamente la polarità della molecola) mentre in un altro caso avremo la formazione di un alcol.

Fortunatamente, gli esteri, sono abbastanza stabili in quanto sono presenti dell e strutture policicliche da entrambi i lati

(sotto e sopra) che, in qualche modo vanno a proteggere il gruppo estereo dalla reazione di idrolisi. Il più critico è il

gruppo più esposto. Di conseguenza due di questi esteri sono metabolicamente stabili ma un terzo estere può benissimo

subire una reazione di idrolisi. L’estere più esposto, quindi, viene trasformato in ammide con una conseguente

stabilizzazione della struttura. Abbiamo quindi due composti naturali, la Vincristina e la Vinblastina che sono simili

tranne nell’acetilazione di un azoto che nella Vincristina risulta acetilato mentre nella vinblastina no. Questo azoto,

tuttavia, è poco basico ed è aromatico per cui la variazione di polarità non sarà così elevata. L’unico legame estereo

instabile, come detto, viene modificato ad ammide nella Vindesina in modo da favorire la farmacocinetica della

molecola.

NICOLA MORO – APPUNTI DI CHIMICA FARMACEUTICA E TOSSICOLOGICA 1 88

Meccanismo d’Azione

Il meccanismo d’azione di questi alcaloidi è quello di andare

a impedire la costruzione del fuso mitotico nella sua forma

funzionale e lineare. Questo può essere visto con due

tipologie di approccio. Il primo studio aveva dimostrato che

i dimeri della Tubulina si complessavano facilmente bene

con gli Alcaloidi della Vinca andando a formare degli

aggregati paracristallini (e quindi abbastanza ordinati) che

in qualche modo sottraggono al microtubulo la materia

prima (vengono complessati solo i componenti liberi nel

citoplasma). Sottraendo i dimeri tubulinici al microtubulo avremo l’instaurarsi di un meccanismo di competizione tra il

microtubulo e l’alcaloide. Il secondo meccanismo è quello di andare a interferire addirittura con la testa del microtubulo

(la parte superiore), in pratica sono stati fatti degli studi a raggi X

in cui si vedeva che la Tubulina in presenza della Vinblastina si

spiralizza. Abbiamo quindi la formazione di una struttura

spiraliforme che si genera all’estremità del microtubulo che

assomiglia molto alla situazione di arricciatura vista prima quando

analizzavamo la struttura correlata alla degradazione del

microtubulo. Difatti se andiamo a osservare ai raggi X possiamo

osservare il cofattore GDP (in viola) e una struttura β1α1-Tubulina

(un dimero) oltre una struttura β ,α -Tubulinica (secondo dimero)

2 2

che si legano fra loro formare il microtubulo. Possiamo notare c he

la Vinblastina va a interferire nella zona che lega il GDP all’interno

della catena tubulinica. La struttura ingrandita mostra che la

Vinblastina si inserisce all’interno della catena tubulinica

inducendo un piegamento su una catena che, in condizioni

normali, sarebbe dritta e rigida. L’inserimento di queste molecole, quindi, provoca una curvatura che porta alla

formazione di uno spazio tra i due dimeri. In questo modo si creano le condizioni per la degradazione del microtubulo.

Questa degradazione, quindi, diventa artificiale in quanto non è più gestita da GTP e GDP ma è

gestita dalla Vinblastina che, inserendosi nel microtubulo, lo deforma verso una struttura

spiraliforme. In questo modo il microtubulo perde le sue caratteristiche di assemblaggio lineare

e quindi si ha la degradazione del fuso mitotico. Anche in questa immagine possiamo notare le

strutture delle catene proteiche che sono al l’interfaccia (α2 a sinistra e β1 a destra). Vediamo

che la Vinblastina si inserisce tra i due dimeri e va ad allargare le maglie della catena tubulinica

fra α2 e β1 andando a creare la situazione di distorsione che provoca un mancato assemblaggio

del microtubulo e di conseguenza un mancato assemblaggio del fuso mitotico. La Vinblastina,

inserendosi, si sostituisce al GDP e crea la condizione di arricciamento che impedisce al fuso

mitotico di costituirsi nella maniera più adeguata. Giovedì, 12 Novembre 2015

TASSANI

Abbiamo visto, con gli Alcaloidi della Vinca, che possiamo andare ad agire sul fuso mitotico provocandone la

degradazione anticipata e impedendo alla cellula di replicarsi. Ora vedremo un meccanismo che è l’esatto opposto

ovvero un meccanismo che impedisce alla struttura del microtubulo di decomporsi per permettere la separazione delle

cellule che si sono replicate. Esiste un composto particolarmente noto, il Tassolo, che è un composto naturale molto

efficace derivante dal Taxus brevifolia (una Tasso proveniente dagli Stati uniti nella cui corteccia è contenuto il principio

attivo). È una struttura complessa che presenta numerosi centri chirali e che non è di facile sintesi chimica.

NICOLA MORO – APPUNTI DI CHIMICA FARMACEUTICA E TOSSICOLOGICA 1

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Il Tassolo, come detto, è una molecola complicata con quattro anelli condensati sostituiti in varie posizioni. Presenta

vari centri chirali (C 1,2,3,4,8,10). È una molecola piuttosto rigida per la presenza di questi 4 anelli condensati ma

presenta anche delle posizioni abbastanza snodate (posizione 13) che permettono v arie conformazioni spaziali.

Vediamo inoltre che abbiamo un'altra posizione relativamente snodata (posizione 2) dove si ha un ossigeno

appartenente ad un gruppo estereo che ci permette di avere una rotazione attorno al legame O —C. Sottolineiamo la

presenza di varie funzionalità idrofobiche rappresentate da dei gruppi aromatici presenti in posizione 2, in posizione 3’

legata al carbonio 13 e infine in posizione 3’ con il Fenile. Abbiamo inoltre una ammide legata sempre in 3’ che presenta

un gruppo R1 che può rappresentare un gruppo fenile oppure un gruppo terz-butilossi. In funzione del sostituente

possiamo avere due tipologie di composti che sono il Tassolo (classico con fenile in posizione R1) o il Taxotere (che è un

derivato del Tassolo in cui il Fenile legato all’ammide è sostituito con il gruppo il t-butilossi). Questa molecola non è

molto polare in quanto sono presenti quattro anelli condensati. Sicuramente abbiamo un certo numero di gruppi polari

ma parte centrale della molecola è idrofobica e va a lega rsi ad una zona idrofobica del suo bersaglio. Il farmaco è molto

attivo ma presenta un problema non da poco che nasce dal fatto che il principio attivo deve essere estratto dalla

corteccia della pianta. Estraendolo abbiamo il problema della fonte rinnovabi le perché una volta che è scorticato il Tasso

è destinato a morire. Per trattare il paziente per qualche mese occorrono circa 3 -4 alberi quindi si capisce che il problema

della sorgente rinnovabile è un problema serio. Il farmaco, quindi, non si produce per pura estrazione (sarebbe

improponibile sia per la natura che per la quantità del materiale ricavato) ma vedremo che siamo in grado di sfruttare

altre fonti rinnovabili da cui si ottiene un precursore che noi modificheremo chimicamente, (semisintesi), che ci

permette di partire da fonti rinnovabili (foglie) per ottenere il prodotto desiderato. Il Tassolo è un prodotto efficace in

particolare per le forme cancerose solide ed è citotossico nel senso che il suo meccanismo d’azione ha come effetto di

bloccare la mitosi cellulare e quindi la proliferazione delle cellule. Questo, ovviamente, vale sia per le cellule tumorali

che per quelle sane che fisiologicamente sono in replicazione (ad esempio quelle del sistema emopoietico) che

sicuramente trarranno svantaggi o da questo trattamento. Stiamo infatti sfruttando una proprietà generica come

bersaglio (l’elevata replicazione cellulare) che comunque appartiene non solo alle cellule tumorali ma anche ad alcuni

sistemi fisiologici. Tuttavia, per un allungamento della vita, si è disposti a tollerare anche effetti collaterali molto gravi.

Si va infatti a valutare il solito rapporto rischio/beneficio. Anche in questo caso si ha il problema della resistenza in

quanto con il passare del tempo si possono formare anche dei ceppi resistenti al trattamento farmacologico che, di

conseguenza, viene reso inutile. Quello che è importante è la calotta centrale con tre strutture aromatiche idrofobiche

che sono date dai tre gruppi fenilici indicati precedentemente. Questi tre elementi s trutturali, essendo i tre elementi

che permettono la flessibilità della molecola, sono quelli che determinano anche la sua conformazione dello spazio.

Possiamo quindi avere varie conformazioni che derivano dall’arrangiamento tridimensionale della molecola in modo

tale che i gruppi funzionali idrofobici siano orientati in maniera adeguata per lo scopo che si propone (sia essa la

cristallizzazione della molecola, sia la situazione in cui la molecola è in soluzione acquosa fisiologica, sia nel complesso

con la Tubulina). In pratica il complesso che si forma è quello con la β Tubulina che è quella che è in grado di legare il

GTP (che poi diventerà GDP). In pratica questa molecola non va a competere con il GDP e quindi avremo un legame

allosterico. La molecola di Tassolo, quindi, si lega alla Tubulina in un sito diverso da quello di legame del GTP su cui va a

interferire stericamente. Formando il complesso con la struttura della Tubulina, infatti, si ha il collocamento dei tre

gruppi aromatici in posizione ben definita per poter interagire in maniera idrofobica con la Tubulina. Si ha quindi la

formazione di un complesso che è strutturalmente diverso da quello con il GTP o il GDP. In questo modo andiamo a

creare una situazione tale da permettere il blocco della mitosi. Quello che succede in questo caso è che non c’è più

l’arricciamento dei microtubuli e non si ha più la possibilità di disassemblarli. In questo modo il fuso mitotico rimane

intatto e quindi il ciclo mitotico non è in grado di andare a completamento. Qu esta modificazione è, in pratica, una

complessazione del tassolo nei riguardi della struttura della β-Tubulina legata alla GDP. Ricordiamo che la β-Tubulina

NICOLA MORO – APPUNTI DI CHIMICA FARMACEUTICA E TOSSICOLOGICA 1 90

legata alla GDP risulta leggermente curva (ha una struttura non in linea con l’asse del microtubulo ma tende a

distanziarsi rispetto all’asse andando a formare degli arricciamenti nella porzione terminale). Il Tassolo legandosi alla

GDP-Tubulina determina una variazione conformazionale che compensa la rotazione delle 2 subunità (α e β) l’una

rispetto all’altra quando c’è l’idrolisi del GTP. È quindi un processo che fa variare la struttura del sistema a α,β -Tubulina-

GDP rimuovendo quella curvatura che era stata causata dall’idrolisi del GTP in GDP permettendo quindi al sistema di

mantenere una forma anche in presenza dell’idrolisi del GTP. Andando a vedere da vicino il complesso possiamo notare

che la β-Tubulina legata al Tassolo assomiglia strutturalmente all’α,-Tubulina in forma GTP in quanto si ha il

riallineamento delle due sub-unità. Nell’immagine il Tassolo è inserito in mezzo alla struttura della β-Tubulina,

localizzandosi in una zona molto idrofobica contenete vari amminoacidi idrofobici ( Leu,Phe,Val ) che reagiscono con le

catene aromatiche (le tre posizioni del tassolo). In pratica questo sistema a triade si inserisce nella β-Tubulina

determinandone il raddrizzamento e facendole assumere una struttura simile alla α-Tubulina. In questo modo

permettiamo al microtubulo di mantenere una struttura lineare.

Vediamo ora quali sono le posizioni modificabili della struttura del Tassolo, quali sono le posizioni più stabili che ne

consenton l’attività e quind andiamo a vedere le relazioni struttura-attività che ci permettono di capire quali sono gli

elementi strutturali più importanti. Prima di tutto gli elementi strutturali fondamentali, come anticipato, sono i tre

gruppi aromatici di cui abbiamo visto la posizione. Abbiamo due sostituenti in posizione 3’ e un sostituente in posizione

2. Queste posizioni devono contenere gruppi funzionali Arilici, o comunque t-butossi. Dobbiamo quindi avere delle

situazioni idrofobiche con sostituzione multipla al carbonio

e le dimensioni devono essere tali da non permettere che

vi siano sostituenti in posizione –para, in particolar modo

sulla posizione 2 mentre questo è leggermente più tollerato

in posizione 3’. La posizione 2, quindi, sopporta gruppi

aromatici sostituiti in -meta mmentre non sopporta gruppi

aromatici sostituiti in -para in quanto nella tasca idrofobica

(in cui sono presenti Leucina e Valina) che interagisce con il

Tassolo possiede delle dimensioni precise. Se andiamo a

inserire un gruppo aromatico sostituito in -para allora le

dimensioni della tasca non sono più adatte per accettare la

specie aromatica stessa. La deacetilazione in posizione 4

porta a una perdita di attività. Il gruppo acetilico è

necessario per mantenere l’idrofobicità poiché, se deacetiliamo, rimarrebbe un idrossile che è polare. L’ anello

setammico (l’eterociclo che si forma sui carboni 4,5) porta a perdità di attività sia nel caso in cui a ndiamo ad aprire

l’anello (con ottenenimento di un diolo) sia nel caso in cui apriamo l’anello a tre termini. La posizione precisa della

struttura ciclica, quindi, è importante ai fini dell’affinità. Vediamo anche la posizione 7 che prevede la presenza

dell’ossidrile. Questo gruppo è importante in quanto se modificato (ad esempio producendo un chetone) allora la

NICOLA MORO – APPUNTI DI CHIMICA FARMACEUTICA E TOSSICOLOGICA 1

91

struttura perde nettamente l’attività. Allo stesso modo se Aciliamo in posizione 7 con l’obiettivo di aumentare

l’idrofobicità della molecola, perdiamo di attività. La posizione 7, quindin, è una posizione critica e deve mantenersi

idrofilica per fare in modo di mantenere dei legami non idrofobici con la proteina target. Procedendo verso la posizione

9 possiamo osservare che è sucettibile alla riduzi one. Il chetone in posizione 9, quindi, può essere convertito ad alcol

migliorando la risposta. Ancora una volta possiamo immaginare che la posizione 9 sia una porzione della molecola che

probabilmente crea interazioni idrofiliche (con legami H) favoriti dalla polarità di quella porzione della molecola. Se

osserviamo il Carbonio 10 del Tassolo possiamo notre che la Deacetilazione non fa variare sensibilmente l’attività della

molecola. Il deacetil derivato in posizione 10, infatti, rimane praticamente equiattivo rispetto al derivato acilato. Nella

zona superiore della molecola abbiamo che la posizione 2’ è una posizione critica in quanto se andiamo a togliere

l’ossidrile andiamo a perdere in termini di attività. L’ammide in 3’ può essere sostituita con un gru ppo terz-butossi

ovvero un sistema alifatico ingombrante e idrofobico. La sostituzione è favorevole in quanto il Tassolo e il Taxotere

risultano essere praticamente equiattivi. Abbiamo quindi la possibilità di andare a effettuare molte sostituzioni una

buona parte di queste causano un peggioramento del profilo di attività. D’altro canto, come dicevamo, andare a

preparare una molecola del genere non è affatto facile.

Sintesi

La sintesi completa del Tassolo comprende circa una ventina di passaggi, molti dei quali sono enantioselettivi. La sintesi,

come detto, è molto complicata e non conveniente dal punto di vista dei costi e delle tempistiche. Come detto

l’estrazione del Tassolo dalla pianta non è coveniente in quanto porta alla morte di un gran numero di pi ante ma non è

nemmeno conveniente effettuare una sintesi chimica pura in quanto è troppo impegnativa dal punto di vista dei

passaggi da effettuare, dei costi da sostenere, del numero di passaggi di sintesi, del il tempo e del numero di persone

impegnate nel lavoro. Si decide quindi di operare attraverso una semisintesi che parte da un nucleo con l’ossidrile in

posizione 13. Questo nucleo è presente nelle foglie del Tasso per cui la presenza delle foglie permette di estrarre questo

precursore del tassolo chi amato 10-Deacetilbaccatina III (la posizione 10 è deacetilata e come abbiamo visto la

deacetilazione in quella posizione non fa variare la attività della molecola). Il primo passaggio quindi è quello di andare

ad estrarre dalle foglie del Tasso (senza scorticarlo e quindi mantenendolo vivo, abbiamo una fonte rinnovabile), la

Deacetilbaccatina III che essenzialmente è il nucleo centrale ciclico del Tassolo deacetilato in posizione 10 e privo della

sostituzione in posizione 13. A questo punto però noi dobbiamo pensare a effettuare delle reazioni selettive poiché

abbiamo la presenza di quattro idrossili ma dobiamo andare a generare il derivato solo in posizione 13. Per effettuare

questo dobbiamo in qualche modo tener conto della reattività presente nei gruppi i drossilici del precursore del Tassolo

che si trovano in posizione 1, 7, 10, 13. Bisogna trovare quindi in modo selettivo per non avere una modificazione

generalizzata sui vari gruppi idrossilici con difficolta poi di separare i vari prodotti e di ottenere quindi prodotto puro.

Per far questo sfruttiamo dei gruppi protettori a diversa reattività. Valutiamo intanto la reattività dei gruppi ossidrilici.

 L’ossidrile in posizione 1 è il meno reattivo di tutti e il motivo sta nel fatto che c’è un ingombro notevole.

Osservando la molecola osserviamo che l’ossidrile 1 è abbastanza protetto dal resto della struttura del

precursore. Di conseguenza non ci preoccuperemo di proteggere questo gruppo.

 Gli ossidrili in posizione 10 e 7 invece risultano più reattivi rispetto a quello in posizione 13 e dovranno essere

protetti.

La protezione avviene nel primo passaggio attraverso un processo di Sililazione dell’idrossile in posizione 7 con il

Dietilsililcloruro che provoca la Sililazione in posizione 7 (sostituente in rosso). In questo modo proteggiamo la posizione

7 attraverso un gruppo protettore rimovibile in seguito alla reazione in posizione 13 (sblocco con HCl). L’idrossile 7 deve

essere protetto durante la reazione in quanto, come abbiamo osservato, è una posizione critica per l’attività della

molecola e inoltre la posizione risulta più reattiva della posizione 13. La posizione 7, infatti, se viene acetilata, porta a

una perdita dell’attività della struttura. Una volta effettuata la protezione dell’Ossidrile in 7 andiamo a proteggere il

secondo ossidrile ovvero quello in posizione 10 che può essere trattato con cloruro di acetile in modo da ripristinare il

gruppo acetilato del Tassolo (ricordando però che questa sostituzione non è poi così fondamentale per l’attività). I due

passaggi saranno quindi Sililazione dell’Idrossile 7 e Acetilazione dell’Idrossile 10.

NICOLA MORO – APPUNTI DI CHIMICA FARMACEUTICA E TOSSICOLOGICA 1 92

A questo punto ci resta la posizione 13 che è una posizione poco reattiva. Per questo motivo avremo bisogno di una

attivazione del processo che viene effettuata con un estere attivo trattato con DPC (2-Piridilcarbonato che è una forma

di estere attivo) che permette di attivare la posizione 13 e permettere poi le sostituzioni per l’ottenimento dell’estere

fisiologico presente sul prodotto naturale. Trattiamo quindi con il DPC in presenza di una Fenilisoserina (in rosso)

protetta con un gruppo etossietile per impedire che l’Idrossile del precursoe del Tassolo reagisca con il gruppo

carbonilico dell’Amminoacido comportando la formazione di prodotti collaterali. Il 2 -Piridilcarbonato attiva l’idrossile

(normalmente poco reattivo) in posizione 13 e permette la formazione dell’estere attivo che permette la reazione di

trans-esterificazione. Dobbiamo però ovviamente proteggere il carbossile dell’Isoserina in quanto, essendo più reattivo

della posizione 13 del precursore del Tassolo, reagirebbe esso stesso con il gruppo che dobbiamo andare a legare.

Abbiamo inoltre detto che l’Idrossile in posizione 2’ è fondamentale in quanto in seguito alla sua rimozione avremmo

un abbattimento dell’attività del farmaco e quindi deve essere assolutamente protetto.

A questo punto abbiamo attaccato alla posizione 13 la funzionalità di interesse e quindi, a questo punto, dobbiamo

rimuovere il gruppo Metossietilico in posizione 2’ della catena laterale e il gruppo Sililico in posizione 7 per riottenere i

due gruppi ossidrilici liberi. Questo viene effettuato con acido cloridrico in etanolo che ci permette di sbloccare in

contemporanea entrambe le posizioni ottenendo così il Tassolo nella sua forma naturale.

Una semisintesi ancora più elegante passa attraverso una reazione con un β -Lattame che è un composto ad attività

antibatterica). In questo caso si sfrutta sempre la 10-Deacetilbaccatina III. Si fa sempre la solita protezione della

posizione 7 con il Trietilsilil cloruro ottendendo così il Tritilsilil derivato. Abbiamo, analogamente alla reazione

precedente, la protezione dell’ossidrile in posizione 10 attraverso una acetilazione condotta in condizioni basiche. Il

reagente LHDMS (Litio esametildisilazide) è una base forte necessaria per facilitare la reazione attraverso l’estrazione

efficace del protone. NICOLA MORO – APPUNTI DI CHIMICA FARMACEUTICA E TOSSICOLOGICA 1

93

A questo punto sono nella situazione precedente. Abbiamo protetto sia il gruppo 7 sia il gruppo 10. Sappiamo che il

gruppo 1 non è molto reattivo (in quanto stericamente ingombrato). A questo punto siamo in grado di far reagire

l’idrossile in posizione 13 con una struttura β-Lattamica (con la chiralità corretta). La struttura β-Lattamica è un reattivo

molto efficace in quanto l’ammde ciclica è estremamente reattiva per via dell’elevata tensione d’anello presente nel

ciclo lattamico a 4 componenti. In pratica andiamo ad attivare il sistema inserendo nella struttura una ammide attiva

che tenderà ad aprirsi. Il β-Lattame, quindi, va a reagire con il gruppo ossidrile e porta, in seguito allo sblocco in HCl, alla

struttura naturale del Tassolo.

In entrambi i casi, attraverso una semisintesi, otteniamo la struttura naturale del Tassolo da una fonte rinnovabile con

rese molto più che accettabili (85% nel secondo caso) e con reazioni chimiche di semplice effettuazione.

EPOTILONI

Esiste inoltre un’ altra classe di composti, di recente scoperta, che è la famiglia

degli Epotiloni. Il nome non è altro che l’acronimo di epossido, tiazolo (in

posizione 15 presenta una catena che termina con un tiazolo) e chetone perché

c’è la presenza di un gruppo chetonico in posizione 5. E’ un Lattone ciclico

caratterizzato da un gruppo carbonilico in posizione 5 e un epossido in posizione

12 oltra all’anello tiazolico legto alla posizione 15.

Questa struttura assomiglia in qualche modo a quella del Tassolo in quanto presenta una zona centrale che ha circa le

stesse dimensioni del tetraciclo e una catena laterale con il tiazolo in qualche modo mima la catena nella pos izione 13

del Tassolo. Abbiamo quindi una struttura che ci ricorda la struttura del Tassolo e ha la stessa funzionalità

(stabilizzazione del fuso mitotico impedendone la decomposizione). Vediamo anche che il sito d’azione è competitivo

con quello del Tassolo in quanto vengono collocati nella stessa tasca idrofobica

caratteristica dell’interazione del Tassolo. Anche in questo caso abbiamo una

modificazione semisintetica per ottenere quello che si chiama Ixabepilone. La

differenza rispetto al classico Epotilone è la presenza di un azoto al posto

dell’Ossigeno in modo da avere una forma ciclica più stabile. L’ammide, infatti,

fa più fatica ad idrolizzarsi e quindi rispetto ad un estere ciclico abbiamo una

stabilità sicuramente maggiore. E’ interessante notare c he gli Epotiloni

(possono essercene diversi in funzione della sostituzione alla posizione 12) non sono cross resistenti con il Tassolo. In

pratica cellule tumorali resistenti al Tassolo sono invece sucettibili all’attività degli Epotiloni che, quindi, superano la

resistenza del Tassolo. Ricordiamo che il meccanismo di resistenza è un meccanismo che avviene per gradi. Inizialmente

le cellule necessitano di un quantità sempre più elvata di farmaco per morire fino al punto da diventare totalmente

inerti nei suoi confronti. Nel momento in cui non siamo più in grado di andare a trattare le cellule cancerose con il

Tassolo allora a quel punto interveniamo con gli Epotiloni. Le cellule indicate in blu presentano la resistenza al Tassolo.

NICOLA MORO – APPUNTI DI CHIMICA FARMACEUTICA E TOSSICOLOGICA 1 94

Vedete che normalmente i l tassolo è molto attivo, ad esempio nell’A549 polmonare il tassolo ha 3 nM di attività e ciò

vuol dire che a questa dose si uccidono il 50% delle cellule tumorali. Il Tassolo, quindi, presenta una notevole efficacia

per quanto riguarda le cellule tumorali . Se però si va a vedere MCF-7/ADR e le altre linee indicate in blu, che presentani

una resistenza multipla derivante dalla Bleomicina, si vede che rispetto al 3,75 nM dell’A549 si arriva a 9105 nM quindi

a condizioni di potenza migliaia di volte più bass a e quindi, a quel punto, si ha la resistenza. Analogo discorso con la KB-

8511 o la 1A9PTX-10 che mostrano quali sono le mutazioni dei vari bersagli che hanno permesso di sopravvivere anche

al trattamento farmacologico. Come detto le linee cellulari evidenziate sono delle linee cellulari che presentano la

resistenza al Tassolo. Gli epotiloni invece mantengono, in particolare il B, sul KB-8511 e su MCF-7 una attività a livello

del nM, somo quindi in grado di superare la resistenza per lo meno per un certo periodo in quanto a distanza di tempo

sicuramente nasceranno delle resistenze anche nei confronti degli Epotiloni. Momentaneamente, comunque, è

possibile continuare e prolungare il trattamento in modo tale da allungare la vita del paziente in maniera efficac e.

Osservando le strutture del Tassolo e dell’Epotilone possiamo notare che, guardando le due molecole dal punto di vista

della modellistica, queste (Epotilone in blu e Tassolo in giallo) presentano una certa omogeneità di struttura, per cui si

potrebbe pensare ad un gruppo farmacoforico comune. Però se invece le osserviamo ai raggi X i dati della cristallografia

ci dicono che le due molecole sono orientate in maniera diversa all’interno del complesso con la β-Tubulina.

PROBLEMATICHE RELATIVE ALLA CRISTALLOGRAFIA E ALL’NMR

Facciamo ora un discorso di carattere generale sulle problematiche derivanti dalla struttura attiva e sui metodi usati per

la sua individuazione. Abbiamo es senzialmente due metodi per struttura la struttura tridimensionale di una biomolecola

o di un complesso macromolecolare: la cristallografia a raggi X e la Risonanaza Magnetica Nucleare (NMR). Con queste

due tecniche siamo in grado di disegnare nello spazio la molecola e quindi di vedere come è organizzata spazialmente.

Evidentemente per poter fare la cristallografia ai raggi X è necessario ottenere un cristallo e quindi dobbiamo creare

delle condizioni di simmetria adeguate perché le biomolecole o i comples si con le biomolecole si organizzino

strutturalmente in maniera tale da dare una struttura cristallina ordinata (la struttura cristallina, di fatto, è un insieme

di molecole che si organizzano fra di loro dando origine, appunto, ad una struttura ordinata). Dall’altro lato in soluzione

abbiamo invece la NMR che però ha un limite rappresentato dal peso molecolare. La NMR, infatti, non si applica a

qualsiasi molecola in soluzione in quanto per un PM superiore a 30 kDa si ha una certa difficoltà. Il problema pr incipale

è che molte molecole hanno un peso superiore a 30 kDa e quindi non è possibile studiare queste molecole in soluzione.

Un altro problema è quello della concentrazione. Anche nell’NMR bisogna utilizzare delle concetrazioni elevate e quindi,

in ogni caso, la molecola non si trova in condizioni fisiologiche poiché nell’organismo vivente queste molecole si trovano

in concentrazioni molto basse. Il sistema che andiamo a rappresentare non corrisponde quindi alla realtà in quanto,

solitamente, un sistema biologico funziona in maniera analoga sistemi individuali. Se si lavora a concentrazioni elevate

queste possono dare luogo a delle interazioni molecola -molecola che non sono fisiologiche e quindi può esserci la

probabilità che la struttura da noi analizzata sia in una conformazione modificata rispetto a quella fisiologicamente

significativa. Il problema derivante dalle interazioni intermolecolari è ancora più espresso nella Cristallografia a Raggi X

in quanto è necessario immobilizzare la struttura in un cri stallo e quindi forzare la conformazione della macromolecola

biologica in una struttura che non è quella fisiologica a causa dell’impaccamento cristallino. Definire se le misure

strutturali che noi che noi effettuiamo sulle biomolecole siano significative anche dal punto di vista fisiologico oppure

siano degli artefatti che derivano dalla modalità con le quali noi facciamo le misure è una questione ampiamente

discussa da molti anni. Di fatto noi dobbiamo effettuare misure ad alta concentrazione (all’NMR) e siamo limitati dal

peso molecolare oppure, nel secondo caso, dovremo andare a creare un impaccamento cristallino nel quale la

biomolecola modifica la sua conformazione. È chiaro che interazioni molecola -molecola possono portare ad un fit

indotto che non rappresenta più lo stato fisiologico ma rappresenta la situazione che noi creiamo artificialmente

attraverso una soluzione concentrata o attraverso la fase solida cristallina. A volte studiamo con due metodi diversi

(NMR e raggi X) le varie strutture e spess o si ottengono risultati diversi per la stessa struttura in base al fatto che l’analisi

sia stata effettuata all’NMR o mediante cristallografia a raggi X. Questo fa instillare il dubbio su quale sia, effettivamente,

la struttura significativa. Questo è anche quello che accade per il Tassolo dove la struttura ai raggi x è differente rispetto

a quella individuata con l’NMR. Bisogna quindi stare attenti quando si fanno delle deduzioni, magari anche logiche, ma

che sono basate su premesse sbagliate perchè parti amo da strutture non fisiologiche. Partendo da strutture non

fisiologiche quello che deduciamo non ha poi un rinscontro a livello di attività biologica o a livello di risultati

farmacologici. NICOLA MORO – APPUNTI DI CHIMICA FARMACEUTICA E TOSSICOLOGICA 1

95

Ritornando al confronto tra Tassolo e Epotilone possiamo oss ervare che abbiamo una

situazione analoga anche con la struttura cristallina del complesso. In questo caso

potremmo concludere che i gruppi funzionali delle due molecole (in oro il Tassolo e in blu

l’Epotilone) interagiscono in maniera simile dal punto di vista dello spazio ma diverso dal

punto di vista strutturale, per quanto riguarda il riconoscimetno della β-Tubulina. Dall’altro

lato se noi cerchiamo di fare qualche studio in soluzione (NMR) si vede che c’è maggiore

sovrapposizione. Non abbiamo quindi una soluzione definita poiché non abbiamo una

concordanza di dati derivanti dal confronto tra le strutture che vengono messe in evidenza

dalla NMR e dalla cristallografia ai raggi x. In questo caso ci rimane il dubbio su quale sia la

struttura attiva dal punto di vista farmacologico. Quello che è chiaro, comunque, è che

l’Epotilone occupa una porzione di spazio che è largamente sovrapponibile a quella del

Tassolo e quindi sicuramente avremo una competizione tra i due farmaci nel legare la β -

Tubulina. L’ultima osservazione da fare è legata alla resistenza. Abbiamo visto che alcune

linee resistenti al Tassolo non sono resistenti all’Epotilone e quindi sono sucettibili al

trattamento con quest’ultimo farmaco. In particolare sembra che ci sia una mutazione che

coinvolge la posizione 270. Questa mutazione prevede la sostituzione con una fenilalanina

nella struttura amminoacidica della tubulina. A volte, quando si ha la resistenza, questa è

dovuta ad una mutazione subita dalla proteina. Si ha una modificazione indo tta dal farmaco

sulla proteina che tenderà adifendersi. La cellula, in pratica, si difende dall’attacco del farmaco andando a modificare il

bersaglio. La modificazione del bersaglio, solitamente, avviene con la modificazione di uno o più ammindoacidi. Quando

questi vengono modificati allora la modificazione sarà tale da impedire l’effetto del farmaco, impedendone per esempio

l’ingresso. Quindi il modo di difendersi che ha il sistema naturale è quello di modificare il bersaglio rendendolo

inattaccabile dalla struttura che prima riusciva a bloccarlo ed a impedire la mitosi. Abbiamo quindi un mutante resistente

al tassolo grazie alla sostituzione di un amminoacido di dimensioni relativamente con una Fenilalanina nella posizione

270. Questa Fenilalanina, ovviamente, ha un notevole ingombro sterico. A questo punto non abbiamo più una questione

elettronica ma una questione di accessibilità al sito di interazione della

molecola. nell’immagine vediamo colorato in verde il Tassolo e possiamo

notare che va a “cozzare” contro la Fenilalanina 270. In questo modo la

compenetrazione non è più possibile e, di conseguenza, il Tassolo non è più

in grado di legarsi per motivi sterici. La struttura ingombrante della

Fenilalanina, quindi, ostruisce il legame del Tassolo (pur essendo idrofobica)

mentre l’Epotilone ha una struttura che è leggermente meno ingombrante

possedendo un solo anello aromatico nella catena laterale. L’Epotilone,

quindi, è in grado di interagire con la proteina anche se questa viene

modificata. In questo modo siamo in grado di andare a bloccare il fuso

mitotico analogamente a quanto accadeva prima con il Tassolo. Ci sono

anche delle mutazioni che si formano non esattamente in corrispondenza

del sito attivo. Queste sono mutazioni che provocano variazioni strutturali

a distanza (allosteriche) che permettano di ridurre la dimensione del sito di

legame in seguito a una variazione conformazionale allosterica. Sostituendo

la posizione 364 siamo in grado di modificare la struttura della tubulina in

maniera tale che quel sito diventi di dimensioni inferiori in quanto la variazione conformazionale ha occupato una

piccola parte dello spazio che prima veniva occupatto dal Tassolo. Le mutazioni possono avvenire, quindi, direttamente

sul sito attivo di legame con il farmaco o di tipo indiretto in cui una mutazione prossimale, ad una certa distanza dal sito,

modifica la struttura del sito di legame in maniera tale da impedire al farmaco di poter interagire efficacemente con la

Tubulina. Ovviamente è bene sottolineare che la mutazione che avviene a livello della proteina non inibisce la

funzionalità della struttura biologica ma si limita a inattivare la struttura che agisce come farmaco. L’Epotilone, quindi,

essendo più piccolo riesce ad entrare nel sito di legame della proteina mutata e quindi è ancora in grado di dare una

risposta farmacologica anche in quelle strutture in cui il Tassolo risulta è inefficace. Anche nel caso dell’Epotilone, però,

la cellula è in grado di adattarsi alla sua presenza. La cellula trattata prima con Tassolo e poi con Epotilone, quindi, sarà

in grado di andare a mutare degli amminoacidi in modo tale da impedire il legame al sito specifico di queste due

sostanze. Uno di questi casi è quello della Treonina 274 (inibizione diretta) oppure dell’Arginina 2 82 (meccanismo

allosterico). Anche le basi della resistenza sono quindi spiegabili con due meccanismo. Abbiamo il primo meccanismo,

NICOLA MORO – APPUNTI DI CHIMICA FARMACEUTICA E TOSSICOLOGICA 1 96

che è locale, legato all’interazione mentre il secondo meccanismo, che è a distanza, espande il suo effetto fino al sito

legame e quindi si avrà una variazione di tipo allosterico.

VELENI DELLE TOPOISOMERASI

La famiglia di composti che andiamo ad analizzare è una famigla doi composti che sfruttano un’interazione enzima -DNA

(agiscono sugli acidi nucleici) utilizzando un proces so enzimatico che taglia l’acido nucleico In realtà, quindi, è il processo

di taglio dell’acido nucleico che crea le condizioni che permettono il legame il farmaco al DNA. Le Topoisomerasi sono

degli enzimi che esistono in due tipologie (Topo 1 e Topo 2) c he producono delle rotture nell’acido nucleico a livello di

una singola catena (Topoisomerasi 1) o di entrambe le catene (Topoisomerasi 2) e che permettono la variazione della

topologia (numero di avvolgimenti) dell’acido nucleico. L’avvolgimento può crear e dei superavvolgimenti in funzione

del numero di volte in cui un avvolgimento passa sull’altra. La situazione di una cellula anche eucoriotica è una situazione

in cui il DNA è bloccato topologicamente attraverso le interazioni con proteine. Il solenoide, che si forma a livello del

DNA compattato, è tenuto fermo da proteine che bloccano le estremità dell’acido nucleico per cui questi tipi di s

struttura sono abbastaza simili a quelle del DNA ccircolare. Il DNA, contenuto nella cromatina, forma dei loops ch e sono

tenuti assieme da delle proteine che ne permettono il blocco. Questa stuttura è detta topologicamente costretta perché

non c’è libera rotazione delle estremità in quanto queste risultano tenute assieme da una proteina. Se noi guardiamo il

DNA circolare abbiamo che questo può essere avvolto su sé stesso più volte. Possiamo avere il DNA di una certa

lunghezza, di un certo peso molecolare, di un'unica tipologia di sequenze e composizione. Finchè questo DNA è lineare

allora esisterà in una sola forma ma, se noi chiudiamo le estremità e lo circolarizziamo, possiamo chiudere le estremità

in modo diverso. Possiamo ciroclarizzare il DNA in maniera tale da avere un circolo rilassato oppure avere dei

superavvolgimenti.

Vediamo un plasmide al microscopio elettronico. Possiamo notare che il plasmide ha un numero di superavvolgimenti

diversi a seconda della situazione nella quale si trova. Possiamo avere dei sistemi rilassati (a sinistra) in cui non c’è alcun

superavvolgimento oppure dei sistemi superavvolti (a destra) in cui abbiamo un numero elevato di superavvolgimenti.

Per passare da una forma topologica all’altra allora è necessario andare a rompere il DNA, far passare la catena

attraverso l’apertura e poi ricucire la struttura dell’acido nucleico. Esistono degli enzimi deputati a fare questo lavoro.

Nel momento in cui si ha la replicazione del DNA se la forma è superavvolta questa deve essere disavvolta per poter

leggere la sequenza. I due filamenti devono separarsi e quindi, man mano che la catena si apre, si creeranno dei

superavvolgimenti a monte e a valle del punto di apertura della catena. Se non avessimo una apertura e una ricucitura

della struttura dell’acido nucleico ad un certo punto la forza che si oppone alla continuazione dell’apertura ad opera

della forcella replicativa risulta troppo grande e non si riesce a procedere con il processo. La proteina deputata alla

replicazione del DNA, quindi, possiede questa tipologia di enzimi (Topoisomerasi) necessarie per variare lo stato

topologico del DNA man mano che viene replicato in modo tale da impedire questo fenomeno di superavvolgimento

che permetterebbe la continuazione della lettura della sequenza e, di conseguenza, impedirebbe anche la trascrizione

e la replicazione dell’acido nucleico. Le varie strutture di DNA, ovviamente, sono degli isomeri che però possono essere

differenziati per elettroforesi. La forma che presenta le dimensioni maggiori (DNA non superavvolto) avrà una corsa più

ritardata rispetto alle altre forme (Il volume idrodinamico è elevato) mentre quello più compatto avrà una corsa più

rapida in quanto sposterà meno solvente per muoversi. In un elettroforesi, quindi, siamo in grado di separare i vari

topoisomeri in funzione del numero di superavvolgimenti che si presentano. Evidentemente non è possibile distinguere

i superavvolgimenti in direzioni differenti (positivi e negativi) ma siamo in grado di vedere una serie di bande legate alla

presenza di diversi isomeri topologici. Gli enzimi che ci permettono di passare da un topoisomero ad un altro sono

NICOLA MORO – APPUNTI DI CHIMICA FARMACEUTICA E TOSSICOLOGICA 1

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chiamati topoisomerasi. Questi enzimi, quindi, ci permettono di variare il numero di superavvolgimenti dell’acido

nucleico (processo essenziale nel corso della replicazione). Durante la produzione di acido nucleico si ha una forcella

replicativa che, per proseguire, necessita di questi enzimi che processano il DNA. L’enzima Topoisomerasi, quindi, è un

enzima vitale per il processo di replicazione.

Meccanismo

Nel caso della Topoisomerasi 1 abbiamo che il processo avviene per rottura di un fi lamento, seguita da un passaggio

dell’altro filamento attraverso il filamento rotto e si conclude con la ricucitura dei due segmenti tagliati. Abbiamo quindi

due passaggi in cui il DNA viene prima tagliato, poi cambia topologia e infine viene ricucito. E’ chiaro che il DNA tagliato

è una condizione di danno cellulare, seppur temporaeo. Il DNA rotto, infatti, non si trova in condizioni fisiologiche. La

ricucitura avviene in seguito al passaggio, attraverso il filamento rotto, dell’altro filamento e quindi si ha una situazione

non fisiologica di rottura che dura per un certo periodo fino al momento in cui viene risanata dalla ricucitura da parte

dell’enzima. Possiamo ipotizzare, quindi, di usare un farmaco per interferire in questo processo. Se abbiamo un farmaco

che, in qualche modo, va a localizzarsi nella zona di rottura (e quindi va a bloccare il sito di rottura del DNA tagliato)

allora diventa molto più difficile la ricucitura del DNA e quindi il processo di ricucitura può essere bloccato da un farmaco.

Andiamo quindi a sfruttare l’enzima per effettuare il taglio andando però a impedire all’enzima di ricucire attraverso

l’inserimento di un farmaco nella zona dove è avvenuto il taglio del DNA. Questi farmaci, quindi, non sono inibitori

enzimatici in quanto l’enzima esegue la metà del suo lavoro andando a tagliare il DNA. Il farmaco interviene solo una

volta effettuato questo taglio. Questi farmaci, quindi, vengono definiti veleni (e non inibitori) in quanto permettono

all’enzima di svolgere una parte delle s ue funzioni. È logico che nel, momento in cui il sistema di riparazione vede il DNA

rotto, si attivano degli stimoli apoptotici che portano alla morte cellulare per apoptosi. Questi farmaci sono quindi degli

stimolatori di apoptosi che si genera, appunto, dalla permanenza della lesione del DNA operato dall’enzima. L’enzima

viene essenzialmente sfruttato come “cavallo di troia” in quanto taglia il DNA e a quel punto con un farmaco impediamo

all’enzima la ricucitura dell’acido nucleico. In questo modo il danno non viene riparato ed essendo considerato un

permanente determina la morte della cellula. Essendo le Topoisomerasi parte del patrimonio replicativo anche in questo

caso andremo a sfruttare la replicazione veloce delle cellule tumorali per andarle a colpi re in maniera prevalente. Nel

momento in cui andiamo a tagliare i filamenti e li ricongiungiamo siamo in grado di passare da un DNA rilassato ad un

DNA superavvolto. Quato visto, anche se applicato su DNA prevalentemente batterici e su plasmidi, può anche essere

applicato nella riproduzione del DNA umano. Andando a effettuare un taglio su una porzione del DNA avremo a

formazione di una regione di disavvolgimento (1) e di una regione di

superavvolgimento (2) a valle della forcella di replicazione. Il meccanismo

della Topoisomerasi 1 è un meccanismo in cui si ha un taglio di un unico

filamento. La Topoisomerasi 1 presenta nel suo sito attivo una Tirosina che

determina il legame all’acido nucleico e ne permette il taglio. In pratica si

ha una transesterificazione in cui il legame fosfodiestereo diventa un

legame fosfotirosinico. Il DNA viene quindi tagliatocon la formazione di un

complesso scindibile (perché il DNA è tagliato e quindi se noi denaturiamo separiamo i filamenti). Il processo di taglio

porta alla possibilità di avere una rotazione, controllata dall’enzima, della sequenza di acido nucleico attorno al taglio.

Questa rotazione permette la variazione della topologia. In questo modo

passiamo dal DNA superavvolto ad un DNA rilassato. La proteina è in forma

monomerica. Abbiamo a questo punto il legame del DNA superavvolto con

la formazione di un complesso non covalente. Si ha il processo di taglio e a

questo punto abbiamo una c’è una rotazione concertata attorno al taglio

che permette di variare di una unità il numero di superavvolgimenti. Una

volta avuta questa rotazione concertata si ha il processo di riattacco dei

due filamenti e quindi si ha il rilascio del DNA con un superavvvolgimento

in meno. In DNA quindi risulterà più rilassato e meno superavvolto. Per

capire come l’enzima determina il taglio, e se questo taglio effettivamente

avviene (meccanismo, numero di filamenti coinvolti nel taglio) è stata

messa a punto una metodica. Per prima cosa si prende una sequenza di

DNA nota e la si fa interagire con l a Topoisomerasi. Quando si è messo a

contatto la topoisomerasi con il DNA si fa una digestione enzimatica per cui

la topoisomerasi viene eliminata da un sistema proteolitico.

Evidentemente una parte delle catene rimarrà integra mentre un’altra

NICOLA MORO – APPUNTI DI CHIMICA FARMACEUTICA E TOSSICOLOGICA 1 98

parte risulterà tagliata perché l’enzima non ha fatto in tempo a completare la sua funzione. Se

andiamo ad analizzare quello che è successo ne risulterà che un filamento sarà rimasto intatto

in quanto la Topoisomerasi I è in grado di tagliare un solo filamento di DNA. L’altro filamento,

quindi, risulterà rotto in due pezzi che non sono identici fra loro. Andando ad effettuare una

elettroforesi avremo una banda unica (banda dei dei filamenti del DNA integro) costituita da

due filamenti praticamente uguali e quindi correranno con un'unica banda. In pratica andiamo

a depositare il nostro campione nella posizione indicata dalla freccia nell’immagine a sinistra.

A questo punto andiamo ad applicare un campo elettrico. In seguito a un certo numero di ore

noteremo una certa migrazione dei componenti del campione che è proporzionale alle

dimensioni e al peso molecolare dei componenti che lo costituiscono. Nel caso in cui abbiamo

la rottura del DNA, invece, si avranno dei filamenti più corti che correranno più velocemente

nel campo elettrico e quindi procederanno più in là rispetto alla banda precedente. La situazione 2 quindi ci dice che

un parte del DNA è rimasta come era (la parte del filamente rimasto integro) mentre si sono formate due frammenti

nuovi dovuti alla rottura della catena di DNA. La funzione della Topoisomerasi, quindi, è determinata dalla formazione

di questi due filamenti di pesi differenti analizzati tramite

l’elettroforesi. In questo modo, infatti, riusciamo a dimostrare che

ci sono processi di rottura a carico dell’enzima. La reazione, come

anticipato, riguarda una tirosina appartenente alla Topoisomerasi.

Questa Tirosina è in grado di attacarsi (sia in 3’ che in 5’ rispetto

al gruppo fosfato) al DNA in maniera covalente con la formazione

di un fosfodiestere con formazione della fosfotirosina. Questa

struttura che si viene a formare provoca, quindi, la rottura del

legame di DNA. La tirosina rimane legata covalentemente alla

struttura 5’ e quindi è possibile la ricongiunzione se i due filamenti

sono sufficientemente vicini tra loro. Ipotizziamo ora di inserire un

farmaco chiamato CPT. Il CPT è un farmaco che è in grado di

riconoscere il complesso rotto. Come detto in precedenza, quindi,

si sfrutta l’enzima per rompere il DNA e poi sfruttiamo il farmaco

per bloccare il complesso nella forma rotta. A quel punto si crea

un danno irreversibile perché quando la forcella replicativa arriva

a quel punto, dove c’è la rottura, la forcella replicativa si spacca

perché non si ha la separazione dei due filamenti e quindi la

replicazione non può continuare. A questo punto si ha il distacco

della proteina dal DNA che risulta danneggiato. La cellula,

accorgendosi del danno inferto, non può fare altro se non morire.

Il danno creato attraverso questo meccanismo, quindi, è

irreversibile in quanto, una volta rotto, non si ha la possibilità di

andare a ricongiungere i segmenti costituenti il DNA. Andando

inoltre a bloccare l’apertura della struttura avremo che a monte della forcella replicativa si avranno dei

superavvolgimenti che andranno a creare un “nodo” ovvero un punto che non permette più al DNA di disavvolgersi.

Nona abbiamo quindi solo il danno irreversibile dovuto alla struttura ma abbiamo anche la collisione della forcella

replicativa con un accumulo di superavvolgimenti che non permettono al processo replicativo di continuare. Abbiamo

quindi due processi che provocano la morte cellulare. Avveleniamo quindi la Topoisomerasi bloccandola in una

situazione di non ritorno attraverso questi due meccanismi di blocco della forc ella e distacco della stessa.

Venerdì, 13 Novembre 2015

Abbiamo parlato delle problematiche correlate alla Topoisomerasi. La Topoisomerasi cambia il livello di

superavvolgimento andando a tagliare e ricucire un filamento di DNA dopo averlo disavvolto (facendo passare una

catena sopra l’altra). È chiaro che nel momento in cui abbiamo una forcella replicativa che deve separare i filamenti di

DNA avremo che man mano che si procede con la separazione dei filamenti si avrà un supervvolgimento e a valle della

forcella replicativa e questo determina il fatto che ad un certo punto la forcella replicativa è impossibilitata a proseguire

a causa della forza fisica generata da questi superavvolgimenti. La Topoisomerasi ha il compito di rilassare lo stress che

si viene a formare e ricucire il filamento tagliato una volta che lo stress è stato rilassato. Abbiamo visto che c’è la

possibilità di interferire con questo processo fisico nel momento in cui l’enzima è legato covalentemente all’acido

NICOLA MORO – APPUNTI DI CHIMICA FARMACEUTICA E TOSSICOLOGICA 1

99

nucleico. L’enzima si lega all’acido nucleico e, nel caso della Topoisomerasi I, si ha il taglio di un singolo filamento mentre

l’altro rimane intatto. A questo punto facendo passare il filamento attraverso il foro che si è generato si avrà la variazione

topologica. Possiamo pensare di interferire con il processo di taglio e ricucitura mediante l’inserimento di una struttura

che blocchi e congeli la situazione dell’acido nucleico nel momento in cui questo viene rotto dall’enzima e deve ancora

essere ricucito. In questo modo il DNA tagliato è visto come un DNA danneggiato e gli enzimi di riparazione

provvederanno a eliminare la cellula stimolando l’apoptosi. Abbiamo quindi definito che la morte cellulare avviene

mediante un meccanismo Apoptotico. Abbiamo detto che il farmaco abbiamo detto può interferire in due modi. Infatti

può andare a collidere con la forcella replicativa portando alla rottura dell’acido nucleico (essendo la topoisomerasi

legata covalentemente con il DNA). Un secondo meccanismo è determinato dall’accumulo di superavvo lgimenti

generati dalla costrizione prodotta dall’enzima bloccato sulla superficie dell’acido nucleico. A questo punto vediamo

quali sono i farmaci, appartenenti in realtà ad un’unica famiglia che è quella delle Camptotecine.

CAMPTOTECINE

Anche in questo caso, come abbiamo visto con il tassolo e con gli Alcaloidi della Vinca il farmaco è un prodotto naturale

estratto da piante (Camptotheca acuminata). La Camptotecina (CPT) vedete che è un sistema a cinque cicli (A, B, C, D,

E). Due di questi cinque cicli di questi sono aromatici (A e B) e possiamo notare che abbiamo un ciclo corrispondente a

un Lattone (Ciclo E) che caratterizza una porzione instabile della molecola. Adiacente al Lattone abbiamo un atomo di

carbonio asimmetrico (posizione 20). La posizione 20 è caratterizzata da un gruppo ossidrilico e un gruppo etilico che

devono essere orientati come indicato dalla figura. Sono quindi stereochimicamente rilevanti ai fini del riconoscimento

del bersaglio. Dobbiamo quindi avere una stereochimica ben precisa n ella posizione 20 altrimenti il farmaco non ha

effetto. Si era provato a sintetizzare al Camptotecina come una miscela racemica ma gli effetti non erano soddisfacenti.

Questa instabilità metabolica è legata al fatto che l’anello del lattone può essere ap erto in condizioni fisiologiche e

quindi, per quanto riguarda la Camptotecina, possiamo avere la forma aperta e la forma quella chiusa. Queste due forme

però, dal punto di vista delle attività, non sono equivalenti. Le evidenze sperimentali indicano infatti che la forma aperta

è molto meno attiva rispetto a quella chiusa per cui questo equilibrio di apertura e di chiusura dell’anello del Lattone

porta a perdita di attività. Osservando la struttura possiamo immaginare che questa molecola sia caratterizzata d a alcuni

problemi per quanto riguarda il punto di vista farmacologico. La prima problematica che possiamo osservare è che un

sistema a cinque cicli (pur avendo sistemi aromatici a cui sono legati gruppi ossidrilici) avrà sicuramente una solubilità

bassa. Questa molecola è infatti praticamente insolubile. La Camptotecina, quindi, dal punto di vista dell’attività è un

ottimo farmaco ed è estremamente efficace (blocca in maniera molto efficace la Topoisomerasi I) congelando il

complesso ternario acido nucleico-enzima- farmaco in una struttura scissa che porta a un DNA rotto che viene visto

come irrimediabilmente danneggiato dai sistemi di riparazione cellulari. Abbiamo quindi un meccanismo che sfrutta,

come abbiamo visto ieri, il processo fisiologico delle Topoisomerasi per creare una apertura dell’acido nucleico che poi

viene congelato dal farmaco in un complesso ternario nel quale l’enzima è legato covalentemente al DNA e il farmaco

è legato reversibilmente all’enzima. Pur legandosi in maniera reversibile e non covalente alla Topoisomerasi, che quindi

può riprendere le sue funzioni in seguito alla rimozione del farmaco dalla sua struttura, abbiamo che il tempo di

persistenza del DNA rotto è compatibile con l’induzione dell’apoptosi. In pratica quando il DNA è r otto gli enzimi di

riparazione lo vedono come un danno irreversibile e quindi inducono l’apoptosi. L’induzione all’apoptosi, quindi,

rappresenta il momento critico dell’azione del farmaco in quanto una volta che questa è stata stimolata il processo di

NICOLA MORO – APPUNTI DI CHIMICA FARMACEUTICA E TOSSICOLOGICA 1 100

morte controllata non può essere fermato e quindi, pur essendo l’azione del farmaco reversibile, avremo comunque la

morte della cellula. Il problema di questo ottimo farmaco, quindi, è principalmente legato alla sua solubilità. Nel

momento in cui viene sommini strato come tale, infatti, avremo concentrazioni trascurabili nel plasma e l’effetto

curativo sicuramente ne risentirà. Il lavoro effettuato, più che avere l’obiettivo di migliorare la risposta farmacologica

aumentando la potenza del farmaco, si era posto principalmente l’obiettivo di migliorarne la solubilità. Le posizioni

localizzate nella porzione inferiore della molecola (1, 12, 14) sono posizioni che non vanno sostituite. Nemmeno la

posizione 5 non può essere toccata poiché, in caso contrario, perdiamo l’attività. Probabilmente l’interazione con il

complesso DNA-Enzima non è più efficace. Le posizioni invece 7, 9 e 10 sono delle posizioni che possono essere

modificate mantenendo sostanzialmente la molecola in condizioni di equiattività. Possiamo quindi andare ad agire nelle

posizioni che si localizzano nella parte superiore della molecola per andare a migliorarne la solubilità. Abbiamo

sostanzialmente due tipi di Camptotecine sviluppate.

TPT È anche chiamato Topotecan. Il farmaco contiene una ammina ter ziaria in

posizione 9 e un gruppo ossidrilico in posizione 10. La molecola di Topotecan

risulta nettamente più solubile e come potenza è equiattiva alla CPT.

CPT-11

Lo stesso discorso vale per la CPT Eleven. La Camptotecina 11 che presenta una catena ca rbammidica in posizione 10

che termina appunto con una ammina terziaria ciclica. Il CPT-11 è un profarmaco che si trasforma nell’SN38, che è il

metabolita. Si ha quindi l’idrolisi del legame carbammico con la produzione di questo metabolita attivo.

Abbiamo quindi due modalità di azione che portano a questi prodotti e che permettono appunto di migliorare le

condizioni di solubilità aumentando l’efficacia del farmaco.

Sintesi

La Camptotecina è difficile da estratte dalla Camptotheca acuminata ed è sintetizzata per intero. Sono quindi state fatte

varie sintesi. La sintesi che descriviamo è estremamente interessante in quanto coinvolge l’azione dei metalli

(metallazione con Li, Zn, Sn) ed è molto efficiente in quanto presenta una resa globale piuttosto elevata.

Si parte da una Metossipiridina che viene Sililizzata. Il prodotto (Silil -Metossipiridina) è già commercializzato. Abbiamo

quindi questo prodotto che viene trattata con Butil Litio (BuLi) e con un derivato Formilico. La Diammina Formilata che

è in grado di traferire il gruppo formilico all’anello aromatico della Silil -Metossipiridina.

NICOLA MORO – APPUNTI DI CHIMICA FARMACEUTICA E TOSSICOLOGICA 1

101

La prima reazione è quella attraverso il Butil Litio. Il metallo è in grado di andare a strappare un idrogeno in α al gruppo

Metossile con la formazione di un Carbanione aromatico. Si ha sostanzialmente una reazione di sostituzione nucleofila

aromatica che va ad attaccare il carbonile del gruppo formilico che rappresenta il sito elettro n deficiente che può essere

attaccato. Abbiamo quindi il trasferimento del gruppo Formile dalla Formammide all’anello aromatico che risulterà

formilato. Attraverso lo stesso meccanismo di razione è anche possibile introdurre uno Iodio sempre con il Butil L itio

che strappa l’idrogeno in α rispetto al derivato Formammidico ottenendo la sostituzione con lo Iodio. A questo punto

abbiamo una reazione di eterificazione riduttiva. Riduciamo il quindi gruppo formile ad alcol per poi effettuare una

reazione di eterificazione con un alcol insaturo in presenza di ione idruro (situazione riduttiva).

Prima si ha la formazione dell’alcol mediante riduzione con lo ione idruro e, in seguito a questa reazione, si ha la reazione

con l’alcol insaturo e così abbiamo la formazione dell’etere con perdita di acqua. A questo punto ciclizziamo il sistema.

La presenza di Iodio da una parte di un doppio legame dall’altra consente la reazione di ciclizzazione intramolecolare

mediata da un sistema di riduzione. Otteniamo in questo modo il secondo ciclo attraverso l’attacco allo Iododerivato.

La reazione intramolecolare dà una resa molto buona.

A questo punto avviene la reazione più complicata che è quella stericamente significativa. Questa reazione permette di

dare un eccesso enantiomerico pari al 94%. È quindi una ottima reazione stereospecifica di ossidazione con Osmio

Tetrossido. In questo modo abbiamo l’introduzione di un gruppo carbonile di un gruppo idrossile al doppio legame con

una resa di reazione dell’85%.

Questa reazione avviene stereochimicamente per effetto di un catalizzatore (DHQD) asimmetrico che permette di fare

venire l’ossidazione con una direzionalità stereochimica precisa. Abbiamo quindi un catalizzatore che ci aiuta a ossidare

ottenendo la chiralità desiderata nel quinto anello della Camptotecina. A questo punto dobbiamo andare a formare i

rimanenti tre anelli. Fatta questa reazione, una volta ottenuto l’enantiomero corretto, si ha la possibilità di Iodurare

nuovamente la molecola sostituendo il Sililderivato con lo Iodio. Questa reazione è favorita con il riscaldamento. In

questo modo abbiamo introdotto la molecola di Iodio nell’anello Piridinico.

NICOLA MORO – APPUNTI DI CHIMICA FARMACEUTICA E TOSSICOLOGICA 1 102

A questo punto possiamo andare a demetilare con Trimetilsililioduro (TMDSI). Si ha la formazione di una forma

ammidica della Piridina. L’ossigeno della Piridina viene sbloccato diventando OH e si può avere la tautomeria Ammido -

Imminica.

Arrivati a questo punto abbiamo due reazioni interessanti. Una sfrutta sistemi a triplo legame. In questa reazione

abbiamo un sistema Propalchilico che attacca l’azoto. Si forma un triplo legame legato all’Azoto.

A questo punto si ha una reazione di Stagnazione. La reazione è catalizzata dal dimetilstagno. Questa è una reazione

radicalica. In questa reazione sfruttiamo un isonitrile aromatico e lo portiamo a chiudere l’anello. Questo Isonitrile

Aromatico, attraverso questa reazione che comporta la formazione di un radicale (si ha il distacco dello iodio) il quale

attacca l’Isonitrile e in questo modo si ha la chiusura della parte sup eriore della molecola con la formazione, in

contemporanea, di due anelli.

Questa è una sintesi di tipo industriale che permette di ottenere la Camptotecina con rese dell’80% circa e con una resa

enantiomerica di circa 94%.

Meccanismo d’Azione

Abbiamo capito che questo farmaco va ad interferire con la struttura del complesso Topoisomerasi I -DNA nel momento

in cui la Topoisomerasi I è legata covalentemente all’acido nucleico. Quello che si può fare è di studiare, ai raggi X, il

complesso ternario. In verde è rappresentato l’enzima che, come possiamo notare circonda il DNA. Al centro della figura

possiamo osservare il taglio del DNA. All’interno della struttura del DNA rotto abbiamo il farmaco Camptotecina che si

inserisce all’interno della doppia elica fa cendo

quella che è definita Intercalazione. In pratica la

molecola va ad inserirsi tra le coppie di basi nel

punto dove è avvenuta la rottura. La molecola ha

una specificità per la Guanina. Come sappiamo

questa molecola è planare e quindi va ad

accoppiarsi sulle superfici delle basi e si adatta al

sistema di doppia elica presente nelle vicinanze

del sito rottura. NICOLA MORO – APPUNTI DI CHIMICA FARMACEUTICA E TOSSICOLOGICA 1

103

Il vantaggio che ha la camptotecina nell’inserirsi in questa posizione è dovuto al fatto che qui il DNA è rotto.

L’inserimento della molecola tra le basi del DNA, ovviamente, provoca una distorsione della struttura e quindi è chiaro

che dove è rotto risulta più facile l’inserimento. Dal punto di vista energetico, ovviamente, è più facile l’intercalazione

nella posizione dove il DNA è già rotto in quanto l’intercalazione della Camptotecina, stericamente, corrisponde

all’inserimento di un’altra coppia di basi. Ovviamente questo allungamento della catena, dovuto all’allontanamento

delle estremità del DNA rotto, provoca l’impossibilità della ricongiunzione. Abbiamo inserito nella struttura del DNA

un’altra struttura planare e questa struttura, ovvero il farmaco, ha allontanato gli estremi di acido nucleico che si devono

ricongiungere e che invece l’enzima teneva vicini. La ricongiunzione delle due estremi tà, quindi, non avviene in quanto

non c’è più la distanza corretta tra i gruppi funzionali Fosfotirosina e Ossidrile dello zucchero per riprendere la trans -

esterificazione e concludere il processo catalitico. La frattura, quindi, avviene in assenza di farmaco mentre la

ricongiunzione è impossibilitata proprio per la presenza del farmaco. Il farmaco, naturalmente, è in grado di interferire

in maniera efficace. Le interazioni del farmaco, quindi, sono principalmente con l’acido nucleico e non con l’enzima di

per sé. Analizziamo ora le due forme della Camptotecina (aperta e chiusa).

Quando si vanno a costruire i cristalli se andiamo ad esaminare la struttura della Camptotecina legata ai cristalli nel

momento in cui si ha il complesso con l’enzima e con il DNA, una metà si trova nella forma aperta (B) mentre l’altra

metà si trova nella forma chiusa (A). Effettivamente, quindi, si genera una interazione con tutte due le forme. Le due

forme si trovano in quantità circa equivalenti (circa il 50%). Quello che possiamo vedere è che le interazioni specifiche

con l’enzima sono molto modeste e quindi le interazioni principali sono quelle di intercalazione con l’acido nucleico

fatta eccezione per l’interazione dell’idrossile in posizione 20 del farmaco con l’Acido Asp artico 533 (legame a Idrogeno).

Dall’altro lato le interazioni un pochino più forti poiché sono presenti due molecole di acqua che fanno da ponte. In ogni

caso, comunque, abbiamo sempre un’interazione indiretta e non abbiamo mai un legame diretto con l’enz ima.

Essenzialmente si ha una interazione efficace e poi si hanno una serie di legami idrofobici e anche idrogeno che sono

presente quando la parte con cui è legata è questa parte del DNA. Si hanno quindi più interazioni con l’acido nucleico e

meno con l’enzima. La giustificazione dell’efficacia del farmaco è legata alla sua inserzione tra le coppie di basi e

l’allontanamento delle estremità che non possono più essere ricongiunte nella seconda parte del processo enzimatico.

Abbiamo quindi visto una famiglia di farmaci che è l'unica finora scoperta che riesce a bloccare e stabilizzare il complesso

fra il DNA e la Topoisomerasi I che generano un complesso ternario con la camptotecina (o derivati).

TOPOISOMERASI II

Adesso vediamo una seconda tipologia di approccio derivanti dalla Topoisomerasi di tipo II. Questi enzimi non tagliano

un solo filamento di DNA (come la Topoisomerasi I) ma tagliano entrambi i filamenti creando quindi una danno anche

maggiore. Nel caso della Topoisomerasi II si ha che l’enzima permette l'attraversamento della doppia elica attraverso il

taglio di entrambi i filamenti che portano a una variazione topologica più importante e significativa. Teniamo sempre

presente che questi enzimi sono fondamentali per la vita delle cellule. In assenza di Topoisomerasi II la cellula è destinata

NICOLA MORO – APPUNTI DI CHIMICA FARMACEUTICA E TOSSICOLOGICA 1 104

a morire in quanto la forcella replicativa è impossibilitata a proseguire. Vediamo che nel caso della Topoisomerasi I

abbiamo un enzima monomerico mentre nel caso della Topoisomerasi II l'enzima è in forma dimerica . Come possiamo

osservare la struttura della Topoisomerasi è una struttura a “cuore”. Come detto è una proteina dimerica ATP

dipendente. Abbiamo quindi un sito di legame per l'ATP che viene idrolizzato e fornisce l'energia necessaria per far

avvenire le reazioni enzimatiche. Il segmento tagliato [G(ate) Segment] viene legato all'enzima che successivamente

lega due molecole di ATP che permette l’apertura dello spazio tra le due catene di acido nucleico (rottura che interessa

tutti e due i filamenti generando lo spazio necessario per il passaggio dell'altro segmento di acido nucleico. In seguito al

passaggio attraverso questa cavità l’acido nucleico viene espulso dalla parte opposta. Abbiamo quindi il passaggio fisico

(nella zona di taglio della catena) del fi lamento. Il passaggio è appunto mediato dalla Topoisomerasi II. Questa variazione

porta ad una variazione topologica della struttura dell’acido nucleico. Abbiamo un segmento target (che viene tagliato)

legato alla Topoisomerasi che, a questo punto, recluta ATP, effettua il taglio sui due filamenti e a questo un'altra parte

dell’acido nucleico ha la possibilità di passare attraverso il taglio effettuato sulla doppia elica. Si ha poi la ricongiunzi one

del doppio filamento rotto e la fuoriuscita della catena c he è passata attraverso la rottura nella parte inferiore

dell'enzima.

In pratica l'enzima accoglie il DNA lo taglia, fa passare un segmento del DNA attraverso il taglio e poi effettua la

ricucitura. È quindi un macchina enzimatica potente che nella parte superiore (dove c'è il sito di legame per l'ATP) lega

il segmento da tagliare, lo taglia, permette a un secondo segmento di

passare attraverso il taglio e lo rilascia poi dalla parte inferiore

dell’enzima. Infine ricuce il filamento tagliato. Anche in questo caso il

meccanismo è legato a due tirosine che si legano ai due diversi filamenti

dell’acido nucleico. La tirosina lega il segmento mentre l'enzima apre

uno spazio attraverso la catena. Vediamo inoltre che le due Fosfo-

Tirosine non tagliano esattamente sullo stesso livello ma c'è uno

scostamento di quattro basi tra la zona di taglio su un filamento e la

zona di taglio sull’altro. Attraverso questo passaggio è possibile che una

catena (intatta) passi attraverso il taglio effettuato cambiando così la

topologia della molecola di DNA in quanto abbiamo che il segmento che

prima si trovava sulla parte superiore passa alla parte inferiore e quindi si aggiungono o rimuovono dei

superavvolgimenti nell'acido nucleico. Abbiamo quindi una situazione in cui si ha un complesso scindibile e quindi

avremo un taglio doppio della catena di acido nucleico. L'enzima tramite la Tirosina si lega al terminale 5' dell'acido

nucleico tagliato e si crea un Gate all’interno del complesso. Ci troveremo nella situazione in cui abbiamo un frammento

di DNA legato ad una subunità, un frammento di DNA legato all'altra subunità dell'enzima e due frammenti tagliati sia

sopra che sotto. Si hanno quindi quattro pezzi di DNA di cui due legati all'enzima e due staccati e accoppiati solo per la

presenza delle interazioni tra le basi per la teoria di Watson e Crick. Interazioni, ovviamente, non covalenti. Se,

analogamente a quanto visto prima, inseriamo un farmaco che si collochi nella zona di taglio del filamento allora

NICOLA MORO – APPUNTI DI CHIMICA FARMACEUTICA E TOSSICOLOGICA 1

105

rendiamo difficile, se non impossibile, la ricongiunzione di entrambi i filamenti.

Sappiamo inoltre che la rottura di entrambi i filamenti è la peggiore possibile dal punto

di vista della riparazione in quanto è una rottura che non permette più la

ricongiunzione. La molecola intercalata provoca un disavvolgimento dell’elica del DNA

e quindi determina un allungamento della struttura dell’acido nucleico, analogamente

a quanto avverrebbe se fosse introdotta un'altra coppia di basi all'interno del DNA.

L'intercalazione può avvenire parallelamente o perpendicolarmente rispetto al sito di

intercalazione.

VELENI DELLE TOPOISOMERASI II

In questo caso abbiamo più di una famiglia di molecole. Vedremo quindi dei concetti generali che mettono in evidenza

le caratteristiche peculiari di questi farmaci. Questi farmaci sono abbastanza potenti da riuscire a intercalare gli acidi

nucleici anche senza la presenza dell’enzima. In questo modo possiamo andare a determinare anche un danno diretto.

Ovviamente, però, il danno che si viene a creare in segui to all’azione dell’enzima risulta più efficace e più facilitato.

Questi farmaci sono sempre definiti Veleni in quanto non abbiamo una inibizione completa dell’enzima ma abbiamo

l’inibizione di una parte della sua funzionalità.

ANTRACICLINE

Sono sicuramente i veleni delle Topoisomerasi II più conosciuti. Sono

caratterizzate da una struttura Diidrossiantrachinonica che poi è legata da

un ammino-zucchero che funge da interfaccia con l'enzima. L'interazione

prevede un dominio di riconoscimento del DNA, un dominio di

riconoscimento dell'enzima. Abbiamo quindi la compartecipazione di

entrambi questi domini alla formazione di un complesso stabile. Ricordiamo

che nella Camptotecina, invece, prevaleva l'interazione con l'acido nucleico.

La struttura prevede due si ti di interazione con il DNA mentre un solo sito di

interazione con l’enzima (l’ammino-zucchero). Il gruppo R può

rappresentare o un CH oppure un CH OH. La parte chinonica, quindi, sarà la

3 2

parte interagente con il DNA in quanto planare (capace di intercal arsi). In

quasi tutti i farmaci abbiamo una struttura basica protonabile. Questa struttura è estremamente importante in quanto

tramite questo gruppo basico è possibile andare a stabilire delle interazioni con i gruppi fosfato del DNA che facilita

l’intercalazione della molecola nel complesso DNA-Enzima. Nell’intercalazione, quindi, abbiamo essenzialmente due

diversi processi che agiscono. Il primo processo, che è quello che determina il legame tra la molecola e i gruppi fosfato

del DNA, è un processo governato da principi elettrostatici mentre il secondo processo, che è quello di intercalazione

vera e propria, è dominato dalle proprietà idrofobiche della molecola intercalante. Questa interazione con l'acido

nucleico rende stabile il complesso con l'enzima (complesso covalente) e impedisce appunto la ricongiunzione dei due

segmenti allontanando i domini Tirosinici dell’enzima. Le Antracicline sono prodotti naturali analogamente alle

Epipodofillotossine, alla Daunorubicina alla Doxorubicina (due

Antracicline), all’Amsacrina e al Mitoxantrone. Sono principalmente

ottenuti da ceppi batterici che si trovano nel terreno. Generalmente sono

dei sistemi colorati in rosso in quanto possiedono un sistema coniugato

piuttosto lungo. Il sistema antrachinonico è un sistema c olorato. Il

Mitoxantrone, ad esempio, è stato scoperto effettuando uno screening

parziale sui coloranti in quanto era usato come colorante per tessuti

(colorante blu). In seguito nello screening si era visto che le Antracicline

contenevano gli antrachinoni ed è stato fatto uno screening su colorati

antrachinonici. Da questi screening è emerso il Mitoxantrone che è molto

efficace ed è utilizzato in clinica.

NICOLA MORO – APPUNTI DI CHIMICA FARMACEUTICA E TOSSICOLOGICA 1 106

EPIPODOFILLOTOSSINE

Le Epipodofillotossine sono prodotti naturali e sono appunto dei sistemi leggermente

più complessi in quanto presentano una parte simil -saccaridica, una parte

trimetossifenilica e una parte centrale che è tetraciclica che non è così planare come

le altre classi di farmaci ma è più simile a un foglietto che si ripiega. Anche in questo

caso si ha la possibilità di avere un effetto da intercalatore (scarso) ma riescono a

interagire abbastanza bene a livello del sito della rottura del DNA. Mentre altri farmaci

sono in grado di interagire anche con il DNA non rotto dalla Topoisomerasi II le

Epipodofillotossine vanno a interagire in maniera specifica con il DNA rotto.

AMSACRINA

Anche in questo caso abbiamo una specie carica in grado di protonarsi. Abbiamo l’azoto

Acridinico (nucleo planare Acridina) che si protona. Anche in questo caso, qui ndi, la

molecola è carica positivamente e quindi può interagire con l'acido nucleico allo stesso

modo analogamente a quanto visto per le Antracicline. La zona che permette il

riconoscimento con l’enzima corrisponde alla catena laterale ovvero una

Solfonammide sostituita con un metossile in posizione meta. Il metossile in posizione

meta è una struttura essenziale per l’attività del farmaco. Anche in questo caso, quindi,

si ha una parte intercalante, una parte carica e una parte di interfaccia con l'enzima.

Gli antrachinoni sono soggetti anche a cicli redox. Non abbiamo, quindi, solo la possibilità di far avvenire delle reazioni

di avvelenamento enzimatico ma possiamo far avvenire delle reazioni più generalizzate di tipo redox. Ovviamente, come

sappiamo, il ciclo redox induce radicali che, come abbiamo già visto, sono specie tossiche che possono dare anche dei

problemi piuttosto gravi. Possiamo quindi pensare di formare dei radicali che possono essere utili per contrastare le

cellule tumorali ma, allo stesso tempo, questo non è utile per quanto riguarda le cellule sane. Le cellule malate, quindi,

possono subire ulteriori danni dovuti ai radicali oltre a quelli mediati della Telomerasi portando così ad un ulteriore

tossicità. Dobbiamo però tenere conto che abbiamo anche degli effetti collaterali gravi perché questa tipologia di

processi redox avviene anche per le delle cellule sane. Osservando queste reazioni possiamo osservare che una di queste

porta all’ottenimento di un Semi -Chinone in

seguito alla riduzione dell’ossigeno. Si ha

l’ottenimento di un radicale anionico e la

possibilità di trasferire un elettrone all’ossigeno

con la formazione dell’anione superossido che,

come sappiamo, è una struttura estremamente

dannosa in quanto permette la continuazione

del processo redox. Nel ciclo redox, come

vediamo, si inserisce anche il farmaco. Queste

Antracicline, infatti, provocano una elevata

cardio tossicità. Uno dei problemi principali nella somministrazione di questi farmaci, infatti, è legato ai suoi effetti

collaterali a carico del sistema cardiocircolatorio. La limitazione nel dosaggio del farmaco, quindi, non è dovuta tanto al

blocco dell’attività delle Topoisomerasi ma è dettata dalla tossicità collaterale che è legata al sistema cardiovascolare.

Le Antracicline, infatti, stimolano la produzione di anione superossido. Sappiamo che il nostro organismo possiede dei

sistemi di detossificazione dai ROS ovvero la Superossido Dismutasi (SOD) e la Catalasi. Purtroppo, a livello del tessuto

cardiaco, le SOD non sono presenti e quindi il tessuto cardiaco è particolarmente suscettibile ai danni da ROS. L’utilizzo

di questi farmaci, quindi, può provocare infarti e altri problemi al sistema cardiocircolatorio. Non è quindi possibile

andare ad effettuare un trattamento in modo massivo proprio per cercare evitare che ci siano degli effetti collaterali

anche gravi che, al posto di causare la morte per cancro portano il paziente alla morte causata da un infarto. La causa

della cardio tossicità, quindi, è la produzione di anione superossido che non viene detossificato a livello cardiaco dove

quindi può andare a creare dei danni. La somministrazione del farmaco, quindi, deve essere eseguita in maniera

particolarmente accurata. Questo può essere effettuato attraverso un dosaggio. Q uesto deve essere sufficiente da

NICOLA MORO – APPUNTI DI CHIMICA FARMACEUTICA E TOSSICOLOGICA 1

107

permettere gli effetti tossici sulla cellula cancerosa ma allo stesso tempo non deve creare (e ciò dipende da individuo a

individuo) dei problemi cardiocircolatori. Prendiamo la Doxorubicina (Adriamicina) come esempio. Ques to farmaco

riduce l’ossigeno ad anione superossido passando a una forma simil -chinonica. L’anione superossido a questo punto

reagisce con due protoni per dare l’acqua ossigenata che, attraverso la reazione di Femton, reagisce con il Fe(II) dando

origine a Fe(III) più radicale idrossilico che rappresenta il radicale più reattivo e dannoso. Attraverso questa serie di

reazioni collaterali, desiderabili se si guarda la cellula malata non desiderabile nel caso invece di una cellula sana (sono

reazioni aspecifiche che indipendentemente può andare ad agire in altre parti del corpo come il sistema

cardiocircolatorio) possiamo arrivare a danneggiare la cellula tumorale.

A questo punto abbiamo una tossicità che non è più dipendente dalla velocità di replicazione delle cellule tumorali ma

dipende soltanto dalla specie tossiche nei tessuti.

Finora abbiamo visto come possiamo andare a intervenire su forme cancerose generiche (sia di tumori liquidi sia tumori

solidi) attraverso l’utilizzo di questi farmaci, molti dei quali di origine naturale, che sono particolarmente efficaci come

citotossici. All’inizio di queste lezioni abbiamo visto che le forme di tumori più significative, sia maschili che femminili,

sono le forme tumorali dipendenti dagli ormoni (cancro alla mammella e cancro alla prostata). Possiamo intervenire a

livello di trattamento della malattia sfruttando, appunto, la dipendenza di queste cellule dalla presenza di sistemi

ormonali. Possiamo intervenire sulla crescita della cellula cancerosa (se ormone dipendente) andando a limitare la

somministrazione di ormoni. Si interviene, quindi, in maniera indiretta ma, come risultato, abbiamo comunque la

possibilità di inibire la crescita della cellula cancerosa in quanto queste cellule dipendono dall’ ormone per riprodursi.

Nel momento in cui andiamo a bloccare l’ormone allora bloccheremo anche la replicazione cellulare.

Possiamo quindi pensare a vari siti di azione farmacologica usando farmaci che vanno ad interferire con la produzione

ormonale, sempre nel caso in cui la forma cancerosa è ormone dipendente. È chiaro che occorrano fattori di crescita di

tipo ormonale per permettere alla cellula di riprodursi. Nel momento in cui andiamo a bloccare questi processi allora si

è in grado di bloccare la cres cita cellulare. Nell’immagine sono riassunti po’ brevemente i punti chiave della produzione

ormonale. Come possiamo vedere la produzione parte dalla

stimolazione delle ghiandole Pituitarie da parte di LHRH. La

ghiandola Pituitaria produce le gonadotropine (LH e FSH) che

vanno a stimolare la funzione endocrina di produzione di

Testosterone che è alla base sia degli ormoni Androgeni che di

quelli Estrogeni. La produzione di ormoni, quindi, può essere

bloccata sia a livello celebrale (inibizione della produzione di

Gonadotropine) oppure inibendo la produzione di Testosterone

(eliminazione del precursore) o ancora andando a intervenire

nella trasformazione del Testosterone in Androgeni o Estrogeni.

Possiamo quindi andare ad agire sia a monte che a valle del

processo di sintesi degli ormoni. In pratica andiamo a osservare il processo di produzione degli Estrogeni e degli

Androgeni possiamo notare che come base si parte dal colesterolo. Questo porta a due precursori comuni che sono

l’Androstenedione, ottenuto dal Progesterone, e il Testosterone che è il derivato ridotto del progesterone. Vediamo che

il Testosterone rappresenta il bivio tra gli ormoni maschili (Diidrotestosterone prodotto attraverso l’enzima 5α -

reduttasi) e quelli femminili (Estradiolo, Estrone ed Es triolo prodotti attraverso l’azione dell’enzima Aromatasi).

Partendo dal Testosterone, quindi, siamo in grado di interferire sia con gli ormoni maschili sia con quelli femminili.

NICOLA MORO – APPUNTI DI CHIMICA FARMACEUTICA E TOSSICOLOGICA 1 108

Abbiamo quindi delle possibilità che sono legate alla presenza di enzimi s pecifici che sono in grado di andare a modificare

il testosterone e lo convertono in forme ormonali più specifiche. La terapia ormonale che possiamo applicare, quindi, è

quella che si fa agendo a monte (e quindi a livello cerebrale) andando a lavorare con gli agonisti dell’LHRH oppure

lavorando con degli anti -Androgeni, lavorando nella trasformazione del testosterone in Androgeni (nel caso dell’uomo)

o ancora possiamo lavorare con anti -Estrogeni (nel caso della donna). Infine possiamo andare a lavorare con un’altra

struttura chiamata Tamoxifen.

AGONISTA LHRH

Di fatto noi dovremmo pensare a degli antagonisti per inibire la produzione delle Gonadotropine. Nel momento in cui

abbiamo che LHRH stimola la produzione di Androgeni ed Estrogeni dovremmo pensare a blo ccare il processo attraverso

delle strutture che si oppongano a questa stimolazione. In realtà, però, quello che succede è un effetto paradosso. La

produzione di queste LHRH è una produzione pulsante che è dipendente dalla necessità dell’organismo di espri mere

l’ormone. Non è, quindi, costante nel tempo. Si ha un andamento sinusoidale della produzione di Gonadotropine. Nel

momento in cui inseriamo nell’organismo un agonista questo viene tradotto come un segnale di produzione costante

che permane. Il sistema, in questo modo, si sregola in automatico rendendosi conto di avere una iperproduzione di

Gonadotropine rispetto a quelle solitamente sarebbe necessaria. In questo modo il sistema manda un segnale che porta

alla diminuzione dei recettori attraverso un’internalizzazione in modo tale da ovviare l’iperproduzione apparente legata

al fatto di somministrato un agonista. La somministrazione dell’agonista, quindi, porta a una diminuzione del numero

di recettori in superficie e, in maniera indiretta, blocca la produzione di Gonadotropine inibendo la trasduzione del

segnale stimolatorio mediato da LHRH.

L’LHRH è un ormone peptidico (decapeptide) abbastanza semplice e quindi quello che viene fatto e di andare a generare

delle Strutture Ormone Simili tali da competere in maniera efficace con la stimolazione naturale e quindi tali da agire

come agonisti del sistema. Questa azione avviene, ad esempio, attraverso la Goserelina che presenta una struttura

leggermente modificata rispetto all’LHR.

LHRH: pGlu—His—Trp—Ser—Tyr—Gly—Arg—Pro—Gly—NH 2

GOSERELINA: Glu—His—Trp—Ser—Tyr—D-Ser(tBu)—Arg—Pro—AzGly—NH 2

Abbiamo, in particolare, tre modificazioni. La mutazione più significativa è quella che avviene in posizione 6 dove

l’amminoacido Glicina viene sostituito da una D-Serinterz-butile (ovvero una serina della serie D che è derivato con un

terz-butile, un gruppo che crea un grande ingombro sterico). Questo amminoacido, essendo ingombrato stericamente

con un gruppo idrofobico, è in grado di interagire con una tasca idrofobica su cui LHRH non ha nessuna azione.

Analogamente a quanto già visto l’effetto di attivazione/disattivazione dei processi non prevede un legame molto forte

ma prevede un legame gestibile. L’effettore naturale, quindi, non deve essere esageratamente forte altrimenti il segnale

NICOLA MORO – APPUNTI DI CHIMICA FARMACEUTICA E TOSSICOLOGICA 1

109

diventa persistente. Visto e considerato che il nostro obiettivo è rendere persistente questo segnale allora andremo ad

aumentare l’affinità per il recettore. La Goserelina, quindi, legherà in una maniera più affine il recettore per LHRH

rispetto all’effettore naturale. Le variazioni intervenute sono il Piroglutammato iniziale (forma ciclica dell’acido

Glutammico) che viene sostituito da un Acido Glutammico. Abbiamo poi una variazione a livello centrale in cui la Glicina

viene sostituita da una D-Serinterz-butile e infine abbiamo un'altra sostituzione di una Glicina con il suo azoderivato

(sostituzione bioisostera). La Serina centrale viene messa per avere una interazione idrofobica in più mentre l’Azaglicile

serve per evitare che l’ormone, essendo una proteina, venga proteolizzato. Per evitare che l’ormone sia un substrato

efficace di Esopeptidasi allora sostituiamo la Glicina con l’Azaglicina in modo tale da avere un tempo di emivita della

molecola più lungo. Lunedì, 16 Novembre 2015

Il nostro percorso prende il via dalla possibilità che alcune forme cancerose (quelle che sono collegate con il genere

sessuale) siano dipendenti da ormoni e quindi dipendenti dalla produzione dei segnali codificati da questi ormoni. L’idea

che ci ha accompagnato fino ad ora è quella di verificare inizialmente l’effettiva dipendenza della forma cancerosa (non

tutte le forme cancerose al seno e alla prostata sono ormone-dipendenti) e nel caso in cui vi sia la dipendenza

conclamata allora possiamo andare a intervenire privando le cellule cancerose dell’ormone. In questo modo, in maniera

indiretta, siamo in grado di andare a inibire la crescita della massa tumorale senza un meccanismo citotossico. Abbiamo

ad esempio visto la possibilità di andare a intervenire a livello cerebrale sulla produzione delle Gonadotropine. Abbiamo

anche visto che la produzione delle Gonadotropine è stimolata da agonisti in quanto l’agonista è in grado di dare una

stimolazione costante impedendo delle fluttuazioni a livello ormonale che permette una diminuzione dei recettori.

Abbiamo quindi un iniziale effetto di aumento della produzione delle Gonadotropine seguita poi da una diminuzione

legata all’internalizzazione dei recettori. In questo modo siamo riusciti ad ottenere il nostro scopo. D’a ltro canto

abbiamo visto che c’è la possibilità di andare a intervenire a livello di modificazione del testosterone. Nel caso maschile

possiamo andare a intervenire sulla 5α-Reduttasi che è l’enzima che permette la riduzione del legame in posizione 4,5

mentre nel caso della donna possiamo intervenire sull’Aromatasi che è l’enzima in grado di trasformare il testosterone

nell’ormone femminile (Estradiolo).

Abbiamo quindi anche questi bersagli. Nel caso della forma cancerosa alla prostata abbiamo un ulteriore bersaglio

rappresentato da un recettore adrenergico che permette di rilassare la muscolatura a livello prostatico e quindi di

andare a diminuire gli effetti negativi della iperplasia. Iniziamo quindi a trattare il tema delle terapie ormonali dal punto

di vista delle modificazioni che possiamo andare a introdurre a livello delle reazioni che coinvolgono il Testosterone.

5-α-REDUTTASI

In questo caso il Testosterone è il substrato della Reduttasi che catalizza una reazione redox che porta alla formazione

del Diidroderivato. Il farmaco più utilizzato ed efficace è il Finasteride. Come possiamo osservare il Finasteride è un

analogo dell’ormone endogeno.

NICOLA MORO – APPUNTI DI CHIMICA FARMACEUTICA E TOSSICOLOGICA 1 110

Dall’analisi possiamo osservare che le due molecole hanno una ottima sovrapposizione dal punto di vista sterico (in

giallo l’ormone e in blu il farmaco). Da questo fatto possiamo facilmente capire che c’è competizione a livello del sito

recettoriale. Il farmaco, infatti, si adatta molto bene al sito catalitico. Dall’altro lato abbiamo la presenza di un gruppo

idrofobico (al posto dell’ossidrile del Testosterone) che rappresenta un sito accessorio di legame che permette

l’aumento dell’efficacia di interazione con l’enzima. Diciamo che questi tipi di interazione sono pressoché irreversibili.

Qui c’è un dibattito per capire se effettivamente ci siano delle reazioni chimiche oppure sia semplicemente la lentezza

del distacco dell’i nibitore dall’enzima. Il Finasteride, in qualche modo, rappresenta un substrato suicida poiché non

viene modificato dall’enzima. La struttura è un Lattame (ammide ciclica) e la parte ammidica posizionata in alto

rappresenta una zona idrofobica che permette un aggancio più efficace all’enzima. Abbiamo quindi una competizione

ma a vantaggio del farmaco. Quando il substrato naturale lega il suo effettore allora il substrato viene modificato. Il

legame con l’effettore, quindi, non deve essere troppo stabile altrimenti non si avrebbe la possibilità di andare a

apportare le modificazioni strutturali. Nel processo di conversione del Testosterone nel Diidroderivato, infatti, si ha una

variazione della stereochimica legato alla situazione dello stato di transizione. In questo caso l’abbassamento

dell’energia di attivazione della reazione può favorire un tipo di legame rispetto a un altro. Se noi abbiamo un farmaco

che si lega in maniera energica all’effettore allora in quel caso il complesso diventa troppo stabile e q uindi l’energia di

attivazione viene aumentata. Dobbiamo quindi abbassare l’energia di attivazione senza abbassare troppo la stabilità del

sistema iniziale ragione per cui un substrato che viene modificato da un enzima non sarà mai il miglior legante possi bile.

Durante la trasformazione del substrato, quindi, si ha una maggiore stabilità della struttura presente nello stato di

transizione. Il problema quindi è quanto si stabilizza allo stato fondamentale il complesso per l’interazione con il

substrato e quanto si stabilizza lo stato di transizione per la modificazione imposta dall’enzima sul substrato. Abbiamo

quindi una maggiore stabilizzazione dello stato di transizione e quindi anche una maggiore stabilizzazione della struttura

intermedia che e, ripetiamo, il legante migliore per l’enzima è un legante diverso da quello originario. Il farmaco quindi,

possedendo una struttura molto più affine per il recettore rispetto all’effettore naturale, non subisce una modificazione

sensibile per quanto riguarda la struttura (grazie alla presenza del sito accessorio) e quindi determinerà il blocco della

catalisi enzimatica.

SISTEMA ADRENERGICO Oltre a questo tipo di composti vi sono anche composti ormoni-simili e anche derivati

che vanno a interagire sul sistema adrenergico. Tra questi farmaci andiamo a studiare

la Terasozina. La struttura va a interferire con il recettore α-Adrenergico permettendo

così un rilassamento della muscolatura e, in particolare, a livello prostatico. I sintomi

della iperplasia che si sviluppa a livello prostatico, quindi, vengono ridotti a livello di

gravità. Andiamo quindi ad agire principalmente sulle conseguenze della malattia

piuttosto che sulla azione enzimatica. Questa molecola, quindi, viene principalmente

sfruttata nel caso di forme cancerose benigne.

AROMATASI

Per quanto riguarda l’Aromatasi abbiamo due differenti modalità di interazione in funzione del fatto che gli inibitori

siano un substrato naturale (Ormoni) o che gli inibitori non siano Ormone-simili. Abbiamo quindi le famiglie di Inibitori

a Struttura Steroidea e gli Inibitori a Struttura non Steroidea.

Tra gli inibitori steroidei troviamo (da sinistra a destra) il Formestano (1° generazione), l’Exemestano (3° generazione) e

l’Androstenedione (che è il substrato androgeno naturale). Vediamo ora gli Inibitori non Steroidei.

NICOLA MORO – APPUNTI DI CHIMICA FARMACEUTICA E TOSSICOLOGICA 1

111

Tra i farmaci di seconda generazione troviamo per esempio la Amminoglutetimmide (in alto a sinistra) mentre Letrozolo

(in alto a destra) e Anastrozolo sono farmaci di terza generazione. Possiamo quindi, come visto nel caso dell’α-Reduttasi,

intervenire con gli analoghi del Androstenedione o del Testosterone. Notiamo ad esempio che il Formestano possiede

un gruppo enolico in grado di dare tautomeria. L’Exemestano, invece, possiede un gruppo metilico che car atterizza la

sua attività irreversibile nei confronti dei target. Il gruppo metilico, infatti, può andare a interagire a livello covalente

con delle Serine con la formazione di complessi irreversibili per

legame diretto con il sito attivo. Vediamo ora il s ito attivo

dell’Aromatasi con il legame dell’Androstenedione. Vediamo che

nella parte sottostante dell’immagine abbiamo il sito attivo

dell’Aromatasi dove ci sono tutti gli amminoacidi che partecipano

al sito attivo. Al sito attivo abbiamo la struttura

dell’Androstenedione legata all’enzima. Nella parte superiore

dell’enzima possiamo osservare l’interazione della molecola con

lo ione Ferro dell’EME. Possiamo osservare inoltre che si ha una

stabilizzazione dovuta alla formazione di legami a idrogeno alle

estremità della molecola e di interazioni idrofobiche nella parte

centrale della molecola. Vediamo che nella parte sottostante si

ha la presenza di un canale di accesso che permette al substrato di attraversare l’enzima raggiungendo il sito attivo dove

l’EME agisce per aromatizzare la molecola. Se andiamo a vedere l’equivalente nell’Exemestano possiamo osservare che

la molecola occupa essenzialmente la stessa posizione e i legami che coinvolgono i gruppi funzionali polari sono identici.

La similitudine delle due molecole, quindi, è giustificata

dall’analogia funzionale. Dall’altro lato abbiamo il gruppo

metilenico nella posizione 6 che, nel caso in esame, espande la

molecola rendendola più ampia portandola ad occupare uno

spazio maggiore. Chiaramente essendo nelle vicinanze di una

Serina (in viola mezza tagliata), è possibile che la struttura della

Serina vada a interferire con il metilene dando origine a una

interazione covalente. Nel caso di inibitori reversibili, invece, si

ha una competizione con il substrato naturale per il legame al

recettore diminuendo così gli effetti del substrato naturale stesso. Dall’altro lato abbiamo anche un altro gruppo di

composti che non sono più inibitori competitivi ma vanno a legare un sito allosterico dell’Aromatasi comportan do un

ingombro tra il Ferro EME e la posizione del sito catalitico. La parte riguardante l’EME, come possiamo notare nelle

immagini, viene legata dal farmaco (Pag. 10, 11, 12 Cap. 9a) e in pratica si ha l’impedimento del processo redox che

porta all’aromatizzazione del sistema. Nel caso dell’Amminoglutetimmide possiamo osservare che si ha l’occupazione

del sito dell’EME solo nella sua parte centrale mentre gli altri due composti sono in grado di andare a legare il sito EME

dell’Aromatasi in maniera molto pi ù efficace attraverso interazioni elettrostatiche). Il Letrozolo e l’Anastrozolo, come

possiamo notare, sono degli Azolo-cianoderivati. Le strutture che presentano Azoto hanno la caratteristica di riuscire a

legarsi al gruppo EME in maniera molto efficace e possono quindi impedire il trasferimento elettronico necessario per

la reazione di Aromatasi.

NICOLA MORO – APPUNTI DI CHIMICA FARMACEUTICA E TOSSICOLOGICA 1 112

Sintesi dell’Anastrozolo

Vediamo che si parte da un bis-Bromoetilmetilbenzene che è un composto che si trova facilmente in commercio. Il

Bromoderivato subisce una reazione elettrofila da parte del gruppo Cianuro la quale porta alla formazione del

Dicianoderivato. Il Dicianoderivato possiede degli Idrogeni mobili in posizione α e quindi, in presenza di Idruro di Sodio

(base molto forte) questi possono essere strappati. A questo punto abbiamo una seconda reazione nucleofila da parte

del Carbanione generato sullo Ioduro di Metile (Iodoformio). In questo modo otteniamo il tetrametilderivato.

A questo punto possiamo andare a bromurare la posizione meta - con il Sodio Bromato ottenendo il Bromoderivato in

della molecola. Questo Bromoderivato viene direttamente modificato in Anastrozolo con il Sodio Triazolo. Il Triazolo è

un nucleofilo abbastanza forte da riuscire a reagire con il Bromo ottenendo il prodotto sostitu ito.

TAMOXIFEN

Il Tamoxifen è una farmaco che possiede una struttura molecolare che, in qualche modo,

ricorda il Dietilstilbestrolo. Questa struttura presenta un doppio legame centrale con tre

sostituenti fenilici uno dei quali presenta un Amminoetere terminale. La presenza del

doppio legame è essenziale per mantenere la struttura nella sua conformazione attiva.

Quello indicato è un profarmaco in quanto la specie realmente reattiva è la molecola

ossidrilata nella posizione para dell’anello in basso a sinistra. La molecola ossidrilata, quindi,

è il prodotto metabolico attivo. Questa molecola non va a interferire con l’Aromatasi ma va

a interferire sul recettore per gli Estrogeni. Il farmaco, infatti, si chiama ance SERM (Selective

Estrogen Receptor Modifyer) in quanto è in grado di legare selettivamente il recettore e

modificarne la struttura. In questo caso abbiamo che se la cellula tumorale è estrogeno -

dipendente in condizioni normali si ha il legame dell’estrogeno al recettore con la conseguente attivazi one della

trasduzione del segnale. Il Tamoxifen compete con l’estrogeno per il legame al recettore. In questo modo non abbiamo

un effetto di trasformazione degli enzimi deputati alla trasformazione del testosterone ma abbiamo la competizione del

Tamoxifen con l’estrogeno per il recettore. L’interazione con il recettore porta a un blocco dell’attività recettoriale e in

questo modo abbiamo il blocco della crescita della cellula tumorale. È chiaro che, essendo un competitore reversibile,

anche l’effetto del blocco sarà reversibile e quindi abbiamo un semplice rallentamento. Se la cellula, invece, non mostra

dipendenza dagli estrogeni, non si avrà alcun effetto. Come dicevamo prima di andare a fare un trattamento anti -

androgeno o anti-estrogeno è necessario veri ficare che la forma tumorale sia effettivamente ormone dipendente.

Meccanismo

Il Tamoxifen riconosce due domini principali analogamente all’ormone naturale ( Estradiolo). Il recettore presenta un

dominio N-Terminale denominato AF-1 (che è trans-attivante per il fattore di crescita e che è quindi deputato

all’attivazione del processo attraverso un diretto legame agli acidi

nucleici) e un secondo dominio, C-Terminale, denominato AF-2

che è responsabile delle interazioni con l’ormone. Abbiamo quindi

due zone che devono venire legate o dall’ormone o dal fattore di

crescita per portare l’effetto desiderato di inizio della trascrizione

e inizio della replicazione. Queste due zone sono riconosciute in

maniera diversa, con efficacia diversa e con effetti diversi dal

NICOLA MORO – APPUNTI DI CHIMICA FARMACEUTICA E TOSSICOLOGICA 1

113

substrato naturale (Agonista in entrambi i casi) e dal

Tamoxifen (Agonista per AF-1, Antagonista per AF-2).

Comportandosi da antagonista su AF-2, ovviamente,

inibisce il processo di attivazione della trascrizione. In

questo modo, bloccando parte della funzionalità del

recettore e quindi dell’attivazione della crescita, si ha il

blocco di questa. Per attivare il segnale, quindi, sono

necessari più partner che attivano il recettore in

simultanea. In seguito al primo processo di interazione

tra ormone e recettore, inoltre, si ha una modifica

conformazionale di quest’ultimo che consente il legame

di diversi fattori ad esso. Affinchè succeda questo

devono, ovviamente, essere presenti delle variazioni

conformazionali adatte ad attivare il recettore nel

legame con gli altri fattori in modo tale da avviare il

segnale di trascrizione. Questo sistema di co-attivazione prevede una variazione conformazionale nel segmento AF-2

dove una struttura elicoidale (Elica 12) si sposta. L’agonista, quindi, fa ruotare l’Elica 12 in modo tale da permetterle di

esporre una parte del recettore al co-attivatore andando così a formare il complesso attivo per la trascrizione. L’ormone,

quindi, legandosi al recettore modifica la conformazione recettoriale inducendo uno spostamento dell ’Elica 12

esponendo una zona della molecola recettoriale all’interazione con il co-fattore. Se questa interazione non ci fosse allora

non avremmo nemmeno l’attivazione del segnale. Dobbiamo quindi pensare a un sistema che inibisca questo processo.

Come abbiamo visto il Tamoxifen presenta una struttura abbastanza simile all’Estradiolo ma presenta una lunga catena.

Questa catena, nel momento in cui avviene lo spostamento dell’Elica 12, fa in modo che l’Elica 12 non riesca più a

piegarsi verso l’interno ma rimanga bloccata sulla superficie del recettore. A questo punto, quindi, il co-attivatore non

sarà più in grado di legarsi al recettore e quindi il segnale non sarà trasdotto. Il Tamoxifen, quindi, ha una struttura

abbastanza simile all’ormone naturale tale da permettergli di legare lo stesso recettore ma, possedendo un sito

accessorio ingombrante, impedisce la corretta variazione conformazionale del recettore stesso effettuando così una

azione antagonistica.

Riassumendo, quindi, abbiamo la possibilità di andare a interferire sulla modificazione degli ormoni (Aromatasi)

attraverso degli inibitori analoghi o diversi dall’ormone naturale. In alternativa abbiamo il Tamoxifen che agisce

direttamente sul recettore. Abbiamo quindi dei meccanismi differenziati in fun zione del tipo di farmaco e del tipo di

bersaglio che vogliamo andare a colpire con la terapia farmacologica.

TERAPIA INDIVIDUALIZZATA

Abbiamo visto le terapie ormonali, abbiamo visto le modalità con cui si affronta una malattia cancerosa ma quanto visto

fino ad ora non è pienamente soddisfacente in quanto andiamo a sfruttare delle proprietà generali del tumore che però

sono anche tipiche di alcune cellule sane. Le terapie viste fino ad ora provocano degli effetti collaterali anche molto

gravi se non danni all’organismo. Spesso queste terapie non sono curative ma si limitano a far convivere il paziente con

la malattia. Ci sono addirittura delle forme di cancro che non siamo ancora in grado di affrontare e quindi la strada da

percorrere è ancora molta con delle difficoltà elevate. D’altro canto una malattia quantitativa è complicata da trattare

poiché se abbiamo solo una variazione di intensità della produzione di un prodotto genico (come può essere ad esempio

una proteina che segnala la crescita e la proliferazione cellulare) e lo stesso prodotto genico è presente anche in una

cellula sana è evidente che, se andiamo a indurre degli effetti dannosi sulla cellula malata, in contemporanea avremo

degli effetti anche nelle cellule sane. L’ultima parte delle modali tà degli approcci terapeutici anticancro verrà dedicata

a quella che viene chiamata Terapia Individualizzata e che prevede anche l’analisi genetica. È chiaro che possiamo

andare a individualizzare la terapia nel momento in cui sappiamo quali sono le mutazi oni che hanno causato la malattia

stessa. La terapia individualizzata, quindi, prevede delle analisi genomiche che ci consentono di capire quali sono stati

gli insulti subiti dal DNA e se questi sono riparabili e soprattutto se abbiamo la possibilità di in tervenire mediante delle

cure specifiche e indirizzate a quella particolare tipologia di danno in modo tale da personalizzare l’approccio

terapeutico. Le terapie mirate devono guardare alla tipologia di malattia contratta dal paziente, a quali sono i danni

cellulari intervenuti a livello del genoma e poi ai meccanismi specifici sui quali è possibile andare a intervenire. Abbiamo

visto che spesso usiamo dei meccanismi che normalmente sono accelerati nelle cellule cancerose ma sono co -presenti

anche nelle cellule sane. Non possiamo quindi fare altro che aspettarci degli effetti collaterali. Sfruttiamo quindi dei

NICOLA MORO – APPUNTI DI CHIMICA FARMACEUTICA E TOSSICOLOGICA 1 114

farmaci selettivi che siano in grado di andare ad agire solo sulle cellule malate. Parleremo in particolare degli Inibitori

Tirosin Chinasici e successivamente tratteremo gli Anticorpi Monoclonali come farmaci biotecnologici che permettono

di indirizzare la terapia su dei determinanti strutturali che sono presenti solo e unicamente nella cellula cancerosa.

CROMOSOMA PHILADELPHIA

Partiamo da un esempio per capire come i farmaci selettivi siano stati sviluppati a partire da ragionamenti logici e non

in maniera casuale. L’esempio che portiamo è quello del Cromosoma Philadelphia. Questo tipo di cromosoma si

presenta molto spesso in alcune forme di Leucemia Mieloide Cronica. Il cromosoma Philadelphia è una modificazione

del cromosoma 22 e dipende da una traslocazione che avviene quando la zona Abl del Cromosoma 9 viene giustapposta

alla zona Bcr del Cromosoma 22. Abbiamo quindi questo

cromosoma che contiene la sequenza Bcr-Abl che codifica per

una proteina chimerica che ha attività Tirosin Chinasica e quindi

di trasduzione del segnale. Sappiamo infatti che tutti i processi

che abbiamo in seguito all’internalizzazione del segnale (che

partono dal recettore e che, attraverso una cascata di eventi,

arrivano al nucleo) avvengono mediante una serie di

fosforilazioni a carico delle Tirosine. In pratica questi processi

catalitici che trasducono il segnale derivano dalla fosforilazione

degli Amminoacidi Tirosina. Questa mutazione, che è estremamente specifica, porta a una attività Tirosin Chinasica

costante il che significa che la via di segnalazione dovuta a questa proteina è costitutivamente attiva. Ovviamente questo

porterà a una continua proliferazione cellulare in quanto il sistema di attivazione non può essere inibito. Come detto

questo tipo di modificazione è una modificazione unica e specifica.

CHINOMA

Se andiamo a osservare le varie proteine fosforilanti ne troveremo circa 500 nel nostro organismo. Capiamo qui ndi che

il meccanismo che viene attivato è estremamente complicato e quindi andare a interagire con esso per bloccarlo non è

un procedimento banale. Abbiamo principalmente due tipologie di Tirosin Chinasi attive nella trasduzione del segnale

oltre alle Serin Treonin Chinasi che sono coinvolte in altre funzioni cellulari. A noi, come detto, interessano

principalmente la prima categoria. Le Chinasi, bene o male, hanno tutte una struttura abbastanza simile le une con le

altre per quanto riguarda gli aspetti strutturali e quelli di attivazione/disattivazione. Abbiamo ad esempio la zona

superiore dell’enzima che è deputata a legare l’ATP che

fornisce l’energia necessaria al trasferimento del gruppo

fosfato (Elemento di Controllo). Abbiamo poi un secondo

gruppo che consente l’interazione tra ATP e Substrato in

modo tale che la prima sia in grado di andare a trasferire il

gruppo fosfato al secondo. Immaginiamo di avere una specie

di canale che permette l’ingresso del substrato. Il Loop di

Attivazione è una struttura flessibile che, modificando la sua

conformazione, varia anche la capacità da parte del substrato

di legarsi alla chinasi. Esisterà quindi una forma attiva della

struttura Loop (quando è spostata verso l’interno) e una

forma inattiva in cui il Loop di Atti vazione si posiziona in una

zona che corrisponde alla zona di legame del substrato impedendo al substrato, di fatto, di inserirsi nel sito attivo.

GLEEVEC

Vediamo ora il farmaco usato nella terapia. Il Gleevec ha

cambiato la storia dei farmaci selettivi i n quanto è il primo

farmaco selettivo ad azione inibitoria sulle Tirosin Chinasi.

Questo composto è stato completamente sviluppato per via

sintetica in maniera razionale. Il Gleevec ha una struttura

Ammino Pirimidinica (in alto a sinistra) a cui è legata una

struttura Piridinica (in basso). All’ammina dell’Ammino

Pirimidina è legato un anello aromatico a sua volta connesso

NICOLA MORO – APPUNTI DI CHIMICA FARMACEUTICA E TOSSICOLOGICA 1

115

attraverso un legame ammidico a una struttura Metil Piperazinica. Abbiamo quindi un sistema pentaciclico con cicli non

fusi tra loro. La molecola, come possiamo osservare, ha un certo grado di flessibilità in quanto i vari anelli sono connessi

da legami semplici.

Evoluzione

La sintesi di questo farmaco si sviluppò nel periodo della chimica combinatoriale. In quegli anni si erano sviluppati degli

screening per le Protein Chinasi C su ampie librerie di composti. Questi studi, che si basavano su analisi di librerie di

composti come abbiamo detto, portarono all’individuazione della struttura Ammino Pirimidinica che aveva, però, una

scarsa attività e una minima selettività. La molecola, infatti, era attiva in quasi tutte le Chinasi e aveva una modestissima

selettività per le Serin Treonin Chinasi. La molecola a disposizione, però, era estremamente versatile per quanto

riguardava le sostituzioni all’anello e quindi c’era la possibilità di portare la molecola a evolversi notevolmente. Dallo

screening iniziale sono iniziate le modifiche. Si notò che in seguito all’addizione di un ciclo Pirimidinico sii aveva un

notevole aumento della potenza del farmaco.

La sostituzione, tuttavia, non permetteva un aumento della selettività del farmaco. L’aumento di potenza ha permesso

di continuare la fase di ricerca cercando di andare a intervenire sull’anello aromatico legato all’Ammino Pirimidina.

Sull’anello aromatico si andò a effettuare una conversione che portò alla formazione di una ammide.

È chiaro che, trasformando la molecola in un ammide, abbiamo la possibilità di inserire una notevole quanità di composti

(Acidi Carbossilici). L’introduzione dell’ammide, quindi, permise di cominciare a osservare una certa selettività per le

Tirosin Chinasi che inizialmente era completamente assente. La svolta significativa, tuttavia, si ebbe solo nello step

successivo ovvero nel momento dell’introduzione, alla posizione 6 dell’anello aromatico legato all’Ammino Pirimidina,

di un gruppo metilico.

Il metile in posizione orto è riuscito a cambiare completamente il quadro della selettività. In pratica il metile rende la

molecola selettiva solo per le Tirosin Chinasi eliminando quindi l’attività sulle Ser/Thr Chinasi. In particolar modo la

molecola risulta estremamente specifica per la proteina codificata da Bcr -Abl. Il gruppo metile permette una variazione

notevole della selettività perché va ad ingombrare stericamente il doppietto presente sull’Azoto riducendo così la

planarità. La riduzione di planarità, quindi, diminuisce l’affinità per Ser/Thr Chinasi ma aumenta la selettività per le

Tirosin Chinasi. A questo punto, dal punto di vista della farmacodinamica, la molecola era molto buona (attività nm) ma

risultava estremamente idrofobica. Era necessario quindi andare a inserire delle modificazioni che garantissero un

aumento della idrofobicità in modo tale da migliorare la farmacocinetica.

NICOLA MORO – APPUNTI DI CHIMICA FARMACEUTICA E TOSSICOLOGICA 1 116

Per migliorare la farmacocinetica si è andati a modificare l’anello con il sostituente ammidico inserendo come

sostituente R1 una Metilpiperazina. Abbiamo anche un altro ragionamento che ha permesso l’ottenimento di questa

struttura. Possiamo osservare che tra l’anello aromatico e la Piperazina è presente un sostituente metilenico. Questo è

stato inserito perché le ammine aromatiche, solitamente, portano a carcinogenesi. L’inserimento del metile, quindi, è

essenziale per diminuire gli effetti cancerogeni sull’organismo.

Sintesi

Vediamo che la sintesi parte da una Acetilpiridina che è un prodotto commerciale. Questa viene trattata con il Metil

acetale delle Dimetilammina. Questo Dimetilacetale va a costituire una Cheto-Dimetilammina che entra a far parte del

ciclo Piridinico.

A questo punto la molecola viene fatta reagire con uno Ione Guanidinio che porta alla chiusura dell’anello con la

formazione dell’Amminopirimidina. Si ha l’uscita di un gruppo amminico terziario.

A questo punto abbiamo il nostro composto di partenza che possiamo fa r reagire con un Nitrobromotoluene. In questo

modo otteniamo, per sostituzione del Bromo, il nitroderivato.

Il nitrogruppo è stato inserito in modo tale che, con una semplice riduzione mediante Idrazina, siamo in grado di

ottenere l’Ammina corrispondente.

L’ammina ottenuta, a questo punto, può venire acilata attraverso il cloruro di un acido. Partendo dal Cloruro di Tionile

andiamo a sostituire al gruppo che ci interessa il Cloruro in modo tale da attivare l’Acido Carbossilico da far reagire con

la molecola di interesse. NICOLA MORO – APPUNTI DI CHIMICA FARMACEUTICA E TOSSICOLOGICA 1

117

Possiamo inoltre notare che effettuando questo tipo di sostituzione siamo riusciti ad ottenere già un alogenu ro capace

di dare la reazione finale per completare la struttura del nostro farmaco. A questo punto il Cloroderivato può andar e a

interagire con la Metilpiperazina per darci il Gleevec.

I passaggi industriali che portano alla sintesi del farmaco, come possiamo osservare, non devono essere complicati.

Devono essere il più semplici possibili e allo stesso tempo devono essere poco costosi. Il prodotto finale, tra l’altro, è

ottenuto con un’ottima resa.

Fondamentalmente il Gleevec si lega al sito dell’ATP della proteina codificata dal gene Bcr -Abl (che normalmente è una

proteina costitutivamente attiva dando segnali di crescita continui) impedendo di fatto la fosforilazione del substrato

naturale e inibendo così i segnali di crescita cellulari. Come vedremo, infatti, il legame del Gleevec porta a una richiusura

del Loop di attivazione che, in presenza del legame con il Gleevec, si modifica conformazionalmente determinando

l’impossibilità di accesso al sito attivo dell’enzima per il substrato.

Mercoledì, 18 Novembre 2015

Abbiamo visto il caso della proteina derivante dal gene Bcr -Abl che ha permesso lo sviluppo di un farmaco selettivo che

ha la proprietà di interagire con la Protein Chinasi che era costitutivamente nella forma attiva e quindi continuava a

trasdurre il segnale di crescita impedendo alla cellula, di fatto, di trovare un equilibrio nella proliferazione. Analizziamo

ora le proprietà strutturali che permettono l’interferenza con la proteina e andiamo a vedere quali sono i meccanismi

possibili per il blocco dell’attività chinasica. Dicevamo che la struttura della chinasi possiede essenzialmente due domini

ovvero il dominio di legame dell’ATP (che è quello che permette il trasferimento del gruppo fosfato) e il dominio di

legame del substrato che verrà fosforilato. Il substrato ha accesso alla Tirosin Chinasi solo nel caso in cui il loop di entr ata

si trova in una forma adeguata (che chiameremo forma ON). Se il loop di entrata, invece, cambia la sua conformazione

allora questa variazione conformazionale porta a una impossibilità del substrato a legarsi. In quel caso, anche in

presenza di ATP legato all’enzima, la fosforilazione non sarà possibile. Abbiamo quindi due possibili meccanismi di azione

per i nostri farmaci. Il primo meccanismo riguarda il blocco

della struttura della chinasi in una forma inattiva (blocco del

Loop) mentre il secondo meccanismo prevede di andare a

interferire con il legame con l’ATP. Possiamo anche usare dei

meccanismi in simultanea. Dicevamo, ad esempio, che il

Gleevec lega preferenzialmente il sito di legame dell’ATP ma

solo una parte del sito attivo. L’ATP, quindi, potenzialmente

potrebbe spiazzarlo. Il legame del Gleevec, tuttavia, permette

una variazione conformazionale che determina il blocco della

chinasi nella forma inattiva impedendo al substrato di legarsi

mediante il blocco del loop di attivazione. Nell’immagine

possiamo osservare che quando si ha l’attivazione dell’enzima nel sito attivo abbiamo la fosforilazione di una Tirosina

(Tyr 394) che si oppone a una Arginina (Arg 387) creando una interazione elettrostatica che determina lo schiacciamento

del loop di attivazione verso l’esterno aprendo così la struttura al legame con il substrato naturale.

NICOLA MORO – APPUNTI DI CHIMICA FARMACEUTICA E TOSSICOLOGICA 1 118

Vedremo anche che i vari inibitori esistenti non vanno ad occupare tutti la stessa posizione ma scorrono intorno alla

zona dell’ATP. Alcuni la occupano quasi completamente mentre altri la occupano in modo minore. A questo punto

possiamo capire che possiamo anche andare a evidenziare quali sono le interazioni significative del Gleevec con il sito

di legame. Nell’immagine in rosso sono rappresentate le interazioni idrofobiche mentre in blu sono indica te le

interazioni idrofiliche. Con le linee tratteggiate in rosso

possiamo osservare i legami a idrogeno che si vengono a

formare tra la struttura del Gleevec e l’intorno amminoacidico

del sito di legame del farmaco. Il complesso quindi, proprio per

effetto delle interazioni che si vengono a formare, è molto

stabile. Qual è, però, il problema di questi farmaci? Queste

tipologie di farmaci funzionano bene fino a un certo punto e,

successivamente, cominciano a perdere di efficacia. Il farmaco,

quindi, crea facilmente delle resistenze in quanto più specifica

è la molecola più il danno sarà localizzato e quindi la pressione

per riparare questo danno, da parte della cellula, sarà elevata.

Una molecola selettiva, quindi, induce un danno selettivo che

verrà contrastato dalla cellula in modo molto rapido. Di

conseguenza basterà anche una mutazione molto semplice (che sia compatibile con l’attività ovviamente) per rendere

inefficace la molecola. Dobbiamo tener conto, inoltre, che la zona che il farmaco va a colpire no n è il sito catalitico e

quindi le mutazioni potranno avvenire molto più facilmente. Da un lato, quindi, il farmaco selettivo è estremamente

desiderato in ambito terapeutico in quanto permette un minor numero di effetti collaterali. Dall’altro lato, tuttav ia,

questo rappresenta uno svantaggio in quanto stimoliamo la cellula a modificarsi in quel particolare sito e, facendo

questo, basteranno delle piccole variazioni per rendere il farmaco meno efficace. In particolare la mutazione che

interviene è la sostituzione della Treonina 315 con l’Isoleucina 315.

IRESSA Il farmaco è una Chinazolina e quindi prevede un doppio anello

condensato. Se osserviamo le caratteristiche del farmaco

noteremo che sono differenti rispetto al Gleevec ma allo stesso

tempo abbiamo molte similitudini. Possiamo osservare che nel

farmaco è presente una catena laterale (Morfolina) che non è

funzionale al riconoscimento ma è necessario per aumentare la

solubilità e quindi la farmacocinetica. Se osserviamo l’immagine ai

raggi X possiamo osservare che il farmaco va ad occupare proprio il

sito dell’ATP e quindi sarà un inibitore competitivo per l’enzima

EGFR. Per quanto riguarda la selettività il farmaco sarà sicuramente

meno selettivo rispetto ai farmaci che vanno a bloccare il loop di

attivazione delle Chinasi (es. Gleevec) in quanto il sito di riconoscimento dell’ATP nelle varie chinasi è abbastanza simile

da una all’altra. Come dicevamo in precedenza, però, a volte

essere specifici rappresenta quasi un danno in quanto andiamo

a stimolare in maniera troppo attiva la risposta cellulare al

danno. Iressa, come possiamo vedere nell’immagine, è un

farmaco che agisce impedendo l’autofosforilazione del recettore

per EGF che, quando avviene, attiva una cascata di segnale che

termina con l’inibizione dell’apoptosi e lo stimolo della

proliferazione cellulare, metastatizzazione, invasione e

angiogenesi. Questo effetto è appunto permesso dal legame del

farmaco al sito di legame per ATP. I farmaci inibitori delle Tirosin

Chinasi sono classificati in due tipologie. I farmaci di Tipo II sono

i farmaci analoghi al Gleevec che agiscono sulle Tirosin Chinasi

attive andando a bloccare l’accesso al sito attivo per l’ATP

mentre gli Inibitori di Tipo I sono quelli che legano la forma

inattiva dell’enzima impedendone l’attivazione mediante la stabilizzazione della forma inattiva. Il farmaco non agisce

selettivamente solo sul recettore EGF ma questo recettore è quello per cui la IC è minore (33 nM). Su altri recettori

50

NICOLA MORO – APPUNTI DI CHIMICA FARMACEUTICA E TOSSICOLOGICA 1

119

Tirosin Chinasici Iressa va ad agire con concentrazioni dell’ordine delle µM/L (HER2 e KDR 3700 nM, c -flt 100.000 nm).

Lo stesso vale sulle Ser/Thr Chinasi. Anche per Iressa, inoltre, si sviluppano delle resistenze al farmaco in maniera

abbastanza rapida. Un fatto interessante, che può anche essere compreso per via logica, è il fatto di andare a combinare

queste terapie con sistemi citotossici in modo tale da avere una possibile sinergia tra i vari effetti. In pratica vogliamo

ottenere da un lato degli inibitori delle Tirosin Chinasi e andarlo a co-somministrare a farmaci citotossici. Un esempio è

dato dall’Iressa con il Tassolo. Se osserviamo il grafico vediamo con una linea azzurra la crescita tumorale in funzione

del tempo senza trattamenti di alcun tipo. Se facciamo un trattamento basato solo su un inibitore delle Tirosin Chinasi

(curva in verde) vediamo che si ha un abbassamento della curva che si sposta pur mantenendo lo stesso tipo di

andamento. In questo modo andiamo a prolungare la vita del paziente ma non abbiamo l’inibizione completa della

crescita tumorale. Se andiamo a somministrare il Tassolo in co-somministrazione con Iressa possiamo vedere che

l’effetto è molto più eclatante in quanto la massa tumorale, di fatto, non cresce. Da qui possiamo immaginare che di

poter sfruttare delle terapie basandoci su farmaci che possiedono dei target differenti tra loro. In questo modo i tassi di

sopravvivenza arrivano a essere anche di molto superiori.

Nel caso degli inibitori del I tipo notiamo che è spesso presente il nucleo Chinazolinico (in particol are nell’Iressa e

nell’Eriotinib) mentre nel caso del Sunitinib possiede una struttura Cheto-Indolica. Abbiamo poi una parte solubilizzante

e una parte in cui vi sono anelli aromatici che, essenzialmente sono insolubili. Abbiamo quindi la possibilità di av ere una

zona aromatica in cui solo due anelli risultano condensati.

Questi farmaci sono chiaramente utilizzati in presenza di resistenze. Questo discorso ci permette di continuare la terapia

con effetti positivi. Abbiamo però un altro concetto da considerare. Abbiamo detto che una selettività elevata porta a

una diminuzione degli effetti collaterali ma non è auspicabile per i discorsi di resistenza. Come potremmo affrontare

questo problema in modo tale da avere risultati almeno parzialmente positivi (migliorare la selettività con una bassa

probabilità di sviluppare delle resistenze)? Il metodo migliore sarebbe preparare una molecola che porta a una certa

selettività su più target che rientrano nello stesso pathway che vogliamo inibire. In questo modo, pra ticamente, avremo

una diminuzione della selettività ma allo stesso tempo avremo un aumento della probabilità di bloccare il pathway

intracellulare con una quantità minima di resistenze sviluppate. Nel momento in cui una cellula viene colpita su più

target differenti allora è più probabile che si abbia la sua morte per disfunzioni multiple. In pratica è impossibile andare

NICOLA MORO – APPUNTI DI CHIMICA FARMACEUTICA E TOSSICOLOGICA 1 120

a sviluppare un farmaco perfetto e quindi torniamo indietro con il nostro ragionamento, prendiamo una molecola non

selettiva di per sé ma che sia in grado di andare a colpire su un gran numero di fronti la cellula tumorale in modo tale

da indurre danni gravi e multipli. Chiameremo questi farmaci Multitarget. Giovedì, 19 Novembre 2015

INIBITORI DI 2° GENERAZIONE

Siamo arrivati alla conclusione che una molecola specifica è utile ma questo porta problemi in quanto più specifica è la

modalità di azione di un farmaco più il farmaco avrà la tendenza a sviluppare resistenza nelle cellule che entrano in

contatto con il farmaco stesso. Abbiamo quindi cambiato il paradigma iniziale della “Magic Bullet” e abbiamo detto che,

in qualche modo, è preferibile avere quelle che sono definite come “Dirty Drugs” ovvero dei farmaci meno selettivi (con

più effetti collaterali) ma con una maggiore tendenza a dura re e ad essere efficaci nel tempo in quanto la cellula non

riesce a evolversi (sviluppando resistenza) in presenza di danni multipli creati su più target differenti. L’idea, quindi, è

quella di sviluppare degli inibitori delle Tirosin-Chinasi che vadano ad agire su più di una Chinasi e quindi,

contemporaneamente, interferiscono con un numero maggiore di percorsi biochimici di trasduzione del segnale. I

Farmaci di seconda, ma anche di terza generazione, sono farmaci che da un lato devono affrontare il proble ma della

resistenza ai farmaci di primo utilizzo (quelli di prima generazione) e dall’altro dovranno essere in grado di andare ad

agire su più chinasi contemporaneamente. Questi farmaci, nella loro struttura, presentano tutti quanti degli anelli

aromatici e che possiedono o una Piridina o una Pirimidina come struttura di base. Vediamo ad esempio il caso del

Nilotinib si ha la parte destra che è analoga al Gleevec (Piridin Pirimidina) mentre la parte di sinistra possiede un gruppo

Trifluorometilico legato a un anello aromatico che presenta un sostituente ammidico e un sostituente Imidazolico (che

è un bioisostero della Piperazina). Con il Dasatinib abbiamo un anello tiazolico centrale al posto dell’ammina aromatica

ma abbiamo la presenza della Piperazina (a s inistra) e della Pirimidina come strutture analoghe a quelle del Gleevec.

Nel Sorafenib invece abbiamo un derivato dell’Urea (Difenilurea modificata) che ha la Piridina come struttura

solubilizzante protonata. Questi anelli, analogamente al caso del Gleevec, non sono condensati e quindi tendono a

rendere la molecola più flessibile che permette una adattabilità maggiore alle strutture di varie Chinasi (loop o sito di

legame dell’ATP) permettendo così l’effetto multi -target e quindi una minore sensibilità. Le flessibilità, quindi, è

indicativa generalmente di una specificità minore con un numero di target possibili sicuramente maggiore rispetto a

quello di una struttura rigida.

TERAPIA IMMUNOLOGICA

La terapia immunologica si è avviata intorno alla fine del secolo scorso quando si ipotizzò che le cellule cancerose

avessero dei determinanti strutturali particolari e quindi che si differenziassero sufficientemente dalle cellule sane tanto

da poter essere riconosciute dal sistema immunitario. L’idea è stata quella di trovare dei determinanti strutturali che

permettessero il riconoscimento da parte del sistema immunitario. Questa tendenza allo sviluppo della immuno -terapia

aveva avuto inizialmente un grande successo ma ci vollero quasi 30 anni per riuscire a svilupp are delle terapie

significativamente efficaci. Il cancro, infatti, causa una certa immunosoppressione che, ovviamente, non permette al

sistema immunitario di rispondere come dovrebbe alla malattia cancerosa. Nel frattempo si svilupparono dei sistemi di

immuno-stimolazione che poteva permettere di aumentare la forza del sistema immunitario e migliorarne la capacità

di eliminare le cellule cancerogene. Si sviluppò la metodica delle Citochine che sono dei particolari fattori che stimolano

il sistema immunitario. Gli approcci per la stimolazione del sistema immunitario sono di tre tipi ovvero l’utilizzo di

Citochine, di Anticorpi Monoclonali e con i Vaccini (che è anche una via preventiva). Nel caso dei vaccini si immettono

nell’organismo delle cellule cancerose inattivate per stimolare il sistema immunitario del paziente a eliminare le cellule

malate

CITOCHINE

Sono dei modulatori della risposta biologica di tipo peptidico che stimolano il sistema immunitario facendolo lavorare

in maniera più efficace. Sono dei piccoli peptidi di struttura elicoidale. Quelli principali sono l’Interleuchina II e

NICOLA MORO – APPUNTI DI CHIMICA FARMACEUTICA E TOSSICOLOGICA 1

121

l’Interferone. Questi peptidi agiscono più su una risposta quantitativa piuttosto che qualitativa e quindi si avranno degli

effetti non selettivi per le cellule cancerose. Gli interferoni (α, β, γ) sono sistemi compatti elicoidali (6 -7 eliche) che

presentano uno ione Zinco collegante due sub-unità. Queste sostanze non hanno altre logiche terapeutiche se non

quelle di stimolazione del sistema immunitario (non hanno attività farmacologica propria). Sono inoltre utilizzate per

combattere gli effetti collaterali della chemioterapia in quanto sono in grado di andare a stimolare la crescita di globuli

rossi (Coadiuvanti della Chemioterapia Classica). Stimolano il complesso maggiore di Istocompatibilità.

Interferone

La maggior parte delle indagini cliniche coinvolge IFN-α;

IFN-α induce regressione tumorale nel caso di Leucemie, Linfomi, Melanomi e Cancro al Seno;

Tutti i tipi di IFN incrementano l’espressione di MHC-I (Complesso Maggiore di Istocompatibilità);

IFN-α aumenta l’espressione di MHC-II su macrofagi e l’attività dei Linfociti T Citotossici, Macrofagi e Natural

Killer.

ANTICORPI

Sono l’attuale classe più venduta e ampiamente considerata tra i farmaci biotecnologici. Abbiamo detto che i farmaci

biotecnologici, dal punto di vista economico, rappresentano una grossa fetta dei farmaci attualmente usati e

commercializzati. Tra i 10 farmaci più venduti al mondo abbiamo che 7 di questi sono farmaci biotecnologici (peptidi,

proteine e anticorpi usati come farmaci). Per quanto riguarda i farmaci biotecnologici ci sono alcuni aspetti da

considerare. Per prima cosa le proteine prodotte dalle cellule non sono mai perfettamente uguali, anche per il fatto che

la cellula invecchia. In secondo luogo nei farmaci biotecnologici abbiamo la possibilità di trovare degli inquinanti biologici

che dobbiamo eliminare quindi sarà necessario sviluppare delle tecniche di purificazione adeguate. Dobbiamo inoltre

tenere conto che è necessario che la proteina sviluppata possieda una certa fun zionalità e non risulti denaturata

altrimenti quest’ultima non può dare i suoi effetti. Se la cellula che origina la proteina di interesse presenta delle

modificazioni genetiche, inoltre, abbiamo la possibilità di ottenere delle proteine tronche che non ci sono assolutamente

utili. Possiamo anche avere degli inquinamenti batterici e/o virali. Le metodiche biotecnologiche, quindi, presentano

tutta una serie di problemi non tanto legati alla sintesi del composto di per sé ma legati a tutto l’intorno della pro duzione

del farmaco stesso. Ne consegue che, per evitare tutte queste complicanze, un farmaco biotecnologico necessiterà di

un numero di processi molto più elevato per arrivare alla sua produzione, sia dal punto di vista del controllo sia dal

punto di vista operativo. Teniamo anche conto che la proteina prodotta dovrà essere separata dalla cellula produttrice

in quanto possiamo “insegnare” alla cellula a secernere la proteina ma a quel punto questa dovrà essere purificata dal

brodo di coltura. Abbiamo altri due tipi di problematiche che sono connesse con le modificazioni post-traduzionali.

L’Insulina, ad esempio, presenta tre ponti disolfuro che si vanno a sviluppare in seguito alla produzione della proteina e

questi dovranno essere sviluppati artificialmente ma nella maniera corretta altrimenti la proteina non risulta più

funzionale. Spesso inoltre le proteine di cui necessitiamo sono delle Glicoproteine e quindi necessitiamo del processo

di Glicosidazione che, ovviamente, è un processo post-traduzionale. La produzione di questi farmaci, quindi, necessita

di un elevato numero di step sia dal punto di vista preparativo sia dal punto di vista estrattivo. Essenzialmente possiamo

suddividere i farmaci biotecnologici in quattro categorie ovvero:

Farmaci che replicano proteine naturali (es. Insulina);

Farmaci rappresentati da Proteine Modificate a scopi farmaceutici (es. Insulina ad azione ritardata);

Anticorpi Monoclonali (sviluppati con il metodo dell’Ibridoma);

Farmaci Oligonucleotidici.

Gli anticorpi monoclonali sono dei farmaci biotecnologici che sono in grado di riconoscere dei determinanti strutturali

(Antigeni) mediante delle strutture estremamente specifiche (Epitopi) che sono presenti sulla proteina stessa

permettendo la distruzione della cellula che presenta questi determinanti andando ad attuare un contatto con i sistemi

di difesa del nostro organismo (Macrofagi, Cellule NK). L’anticorpo, quindi, si forma in presenza di una certa struttura

non fisiologica presente a livello cellulare o all’interno dell’organismo. Se abbiamo una proteina mutata possiamo

pensare che questa proteina abbia delle caratteristiche strutturali tali da poter essere riconosciuta come estranea e

quindi tale da suscitare la formazione di anticorpi. Normalmente la formazione di anticorp i è ottenuta a livello murino.

In pratica si inietta la proteina per cui si vuole creare l’anticorpo. L’antigene iniettato, in questo modo, suscita

nell’animale la produzione di anticorpi che sono formati in particolare a livello della milza. A questo punt o di isolano

delle cellule della milza dell’animale e si ibridizzano con un cellula cancerosa che, come sappiamo, è immortale. Così

NICOLA MORO – APPUNTI DI CHIMICA FARMACEUTICA E TOSSICOLOGICA 1 122

facendo facciamo in modo che le linee cellulari perdurino nel tempo (le cellule normali durano al massimo 4 -5

replicazioni. Nel cartoon identifichiamo la cellula che origina dalla milza con un

colore giallo. Come abbiamo detto questa ha la capacità di

sopravvivere al massimo per 4-5 cicli replicativi e quindi otterremmo

una quanità troppo piccola di anticorpi da questa cellula. Andiamo

quindi a formare un Ibridoma con una cellula cancerosa che, come

abbiamo detto, è immortale e quindi sarà in grado di replicarsi più

volte. L’Ibridoma ha la caratteristica di produrre anticorpi e di

replicarsi innumerevoli volte senza mai morire. In questo modo

possiamo ottenere quantità elevate di anticorpi lasciando replicare

queste cellule. Sappiamo che gli anticorpi sono prodotti dai Linfociti

B ma un Linfocita B permette la produzione di un solo tipo di

anticorpo. Se prendiamo una cellula i brida e la moltiplichiamo allora

le cellule che derivano da questa produrranno una serie di anticorpi

tutti uguali tra loro in quanto derivano dallo stesso clone. In questo

modo abbiamo ottenuto gli Anticorpi Monoclonali che sono in grado

di riconoscere un determinante strutturale ben preciso e specifico che è presente in un sistema che l’anticorpo va a

riconoscere. Questo ci permette di evitare problemi di riconoscimento multiplo che porterebbe portare ad attaccare

anche le cellule sane.

Vediamo ora la struttura di un anticorpo. Abbiamo una struttura a Y in cui è presente una

catena leggera e una catena pesante. I determinanti strutturali si vanno a collocare sulla

catena leggera mentre la catena pesante si legherà a quei sistemi che permettono

l’identificazione della cellula riconosciuta dall’anticorpo (linfociti, macrofagi) e che sono

deputati alla sua eliminazione. Ogni linfocita, come detto, è specializzato nel riconoscere un

determinante strutturale ben specifico. Se abbiamo uno xenobiotico, o una muta zione a

livello cellulare, questi sono riconosciuti attraverso la produzione di un tipo ben preciso di

anticorpo generato da un tipo ben preciso di linfociti. L’anticorpo si legherà allo Xenobiotico

e i Linfociti si attiveranno per distruggere il prodotto. L’anticorpo può anche essere usato

come inibitore di legame, ad esempio nel caso in cui venga prodotto un anticorpo che è in grado di riconoscere e legare

un recettore. Se l’anticorpo lega il recettore l’effettore naturale andrà a competere con l’anticorp o e quindi avremo la

possibilità di andare a modulare la trasduzione di un segnale facendo gli anticorpi contro il recettore. Il problema

principale degli anticorpi monoclonali è il fatto che, essendo murinici, possono dare problemi di compatibilità con

l’organismo umano in quanto vengono riconosciuti anch’essi come Xenobiotici dal nostro sistema immunitario. Nel

momento in cui vengono somministrati, infatti, si vengono a creare quelli che sono definiti come anti-anticorpi. L’idea,

quindi, è quella di andare a modificare la struttura dell’anticorpo andando a creare una struttura, per quanto possibile,

simile alla struttura degli anticorpi umani. Sono stati portati a buon fine quattro passaggi fondamentali. Gli anticorpi

oggi utilizzati sono sicuramente più costosi ma sono anticorpi umani mediante topi geneticamente modificati. In pratica

vengono creati dei topi transgenici che hanno il sistema immunitario umano. Possiamo avere anche delle situazioni

intermedie dove le catene pesanti dell’anticorpo sono umane mentre le catene leggere sono murine.

Nomenclatura

Per quanto riguarda la nomenclatura riconosciamo un farmaco rappresentato da un anticorpo monoclonale

direttamente dal suffisso. Tutti i farmaci che sono basati su anticorpi monoclonali possiedono un nome che termina con

il suffisso –mab (Monoclonal AntiBodyes). Altre parti del nome permettono di capire a quale malattia è destinato

l’anticorpo e se questo è di origine umana (o-ostessuto osseo, vi-virvirus, co-coltumore del colon e così via), se

deriva da animali, se è ibrido o se è chimerico. Abbiamo inoltre un prefisso variabile che viene scelto dalla ditta

produttrice. Prima del suffisso –mab abbiamo un’ultima parte che descrive l’origine dell’anticorpo:

-u-: uomo;

-o-: topo; NICOLA MORO – APPUNTI DI CHIMICA FARMACEUTICA E TOSSICOLOGICA 1

123

-a-: ratto;

-e-: criceto;

-i-: primate;

-xi-: chimerico

-zu-: umanizzato;

-axo-: ibrido ratto/topo.

Vediamo infine un elenco degli Anticorpi Monoclonali approvati (a Luglio 2014) e vediamo che sono numerosi ma in

continua crescita. Ad oggi, come detto, rappresentano un repertorio fa rmaceutico molto importante.

Mercoledì, 25 Novembre 2015

Abbiamo detto che oggi ci sono dei farmaci biotecnologici molto efficaci e che spesso si rifanno a delle strutture che

riconoscono degli Epitopi funzionali delle cellule cancerose che permettono di s viluppare degli anticorpi. Gli anticorpi,

fondamentalmente, sono delle sostanze che riconoscono in maniera specifica una anomalia della cellula cancerosa

oppure vadano a sfruttare la iperespressione di un particolare recettore che, in seguito alla loro azi one, verrà bloccato.

Come al solito in questo caso agiamo su una situazione quantitativa e non qualitativa. Abbiamo visto che gli anticorpi

monoclonali sono tanto efficaci quanto costosi. La tabella presente nelle slide mette in evidenza gli anticorpi

monoclonali approvati dagli enti preposti (FDA) e che sono quelli usati in terapia. Molti di questi sono ancora in fase di

approvazione. È chiaro che l’anticorpo monoclonale è un elemento di riconoscimento molto efficace e quindi il suo

indirizzamento è molto specifico e selettivo. Dall’utilizzo di questo farmaco, quindi, ci aspettiamo un numero molto

limitato di effetti collaterali. Il problema principale degli anticorpi è che questi sono delle molecole di grosse dimensioni

e quindi i loro bersagli si limitano alla superficie cellulare (proteine e recettori extracellulari). L’internalizzazione di un

anticorpo, quindi, non è realizzabile. Dobbiamo quindi considerare questa limitazione che, in ogni caso, ci permette

comunque di andare a operare in maniera terapeuticamente efficace. Dall’altro lato possiamo immaginare l’anticorpo

come un vettore per il farmaco tradizionale. Possiamo infatti immaginare di legare all’anticorpo una tossina che verrà

accompagnata al sito di riconoscimento. A questo punto la tossina agi sce in maniera molto efficace. Analogamente

possiamo anche legare all’anticorpo un radioelemento (che è una struttura molto reattiva) che andrà a distruggere la

cellula per effetto delle radiazioni. Un altro uso molto interessante potrebbe essere quello di legare all’anticorpo un

enzima che sia in grado di trasformare un profarmaco in farmaco. In pratica l’anticorpo conduce l’enzima nelle vicinanze

del bersaglio legandosi alla superficie cellulare della cellula riconosciuta. Una volta arrivato al target l’enzima può

svolgere la sua funzione sul profarmaco che diventerà un farmaco solo nelle vicinanze del bersaglio evitando la tossicità

generalizzata comunemente indotta dal farmaco stesso.

HERCEPTIN & HER2

Ci sono delle forme cancerose del seno che esprimono, in particolare, il recettore HER2.

La sua espressione è quindi tipica di alcune forme tumorali. È chiaro che il

funzionamento di un anticorpo su HER2 è subordinato alla iperespressione del

recettore stesso. Se la forma cancerosa che esaminiamo non presenta questa

sovraespressione allora evidentemente non saremo nemmeno in grado di andare ad

effettuare questo trattamento terapeutico. È quindi necessario andare a determinare

la presenza del bersaglio in quella particolare forma cancerosa. Nel momento in cui

questo recettore è sovraespresso allora potremo andare ad intervenire sul recettore

attraverso un anticorpo detto Herceptin.

RITUXIMAB & CD20

Lo stesso meccanismo vale anche nelle forme leucemiche. In questo caso andiamo a sfruttare l’espressione di una

proteina di superficie chiamata CD20. L’anticorpo riconosce le cellule CD20+ permettendone l’eliminazione attraverso i

macrofagi o le cellule NK. Le cellule CD20+ sono spesso presenti nei linfociti quando si hanno neoplasie liquide.

L’anticorpo che riconosce le cellule CD20+ è chiamato Rituximab o Rituxan. L’antigene CD20 ci permette quindi di andare

a riconoscere le cellule malate e di andare a presentarle al sistema immunitario dell’organismo. Anche in questo caso

abbiamo che nel 90% dei casi di neoplasi e dei linfociti B si ha la sovraespressione di questa proteina. Nel restante 10%

dei casi non è possibile agire attraverso questi anticorpi. Capiamo, quindi, che sono necessari degli specifici Biomarkers

per agire con queste terapie. Prima di andare ad effettuare una terapia individualizzata sarà necessario andare a definire

NICOLA MORO – APPUNTI DI CHIMICA FARMACEUTICA E TOSSICOLOGICA 1 124

la presenza di specifici Biomarkers. Il CD20, inoltre, viene espresso in quantità minori anche dalle B-Cell sane. Le quantità

di proteina espressa sono talmente infinitesimali che prati camente l’effetto collaterale è irrisorio.

VACCINI PER IL CANCRO

Questa procedura potrebbe essere una forma di prevenzione verso questo tipo di malattie. Teniamo presente che la

forma cancerosa, solitamente, reprime il sistema immunitario dell’organismo. Attraverso il vaccino dovremmo riuscire

a stimolare il sistema immunitario a produrre degli anticorpi propri che siano in grado permettere l’eliminazione delle

cellule cancerose. Questo tipo di terapia è ancora in fase iniziale. L’idea è quella di sviluppa re vaccini a DNA che

contengano direttamente la sequenza codificante per gli anticorpi per permettere di sviluppare questi anticorpi in

maniera efficace. Allo stesso modo possiamo sfruttare dei geni codificanti delle proteine (presenti normalmente sul

cancro) che vanno ad attivare il sistema immunitario. Generalmente tendiamo a non usare delle cellule inattivate ma

cerchiamo di sfruttare dei determinanti antigenici (proteine o frammenti di DNA che codificano per andare a stimolare

il sistema immunitario).

Abbiamo visto alcune possibilità di trattamento della malattia in maniera selettiva andando a sfruttare delle proprietà

particolari delle cellule cancerose. Una delle necessità dei tumori solidi è quella, ovviamente, di nutrirsi. La forma

tumorale infatti, nel caso in cui non riesca a nutrirsi, entra in fase ipossica che precederà la morte delle cellule per

necrosi. Raggiunta una certa dimensione, quindi, la massa tumorale tende ad auto -nutrirsi attraverso la produzione di

vasi sanguigni propri (Angiogenesi). È chiaro che l’Angiogenesi non è un processo caratteristico delle sole cellule

cancerose ma è un processo caratteristico di tutte le cellule del nostro organismo. In generale, quindi, la problematica

dell’Angiogenesi non è limitata alla mala ttia ma è un problema di carattere generale in cui è necessario regolare il

tessuto (per cause di vario tipo) affichè si abbia lo sviluppo di vasi sanguigni accessori che permettano di irrorare il

tessuto in maniera alternativa rispetto alla situazione ori ginaria. Questi stimoli allo sviluppo di vasi sanguigni si

realizzano anche nelle forme tumorali quando la dimensione della massa tumorale raggiunge dimensioni tali da non

essere più in grado di trarre nutrimento dai vasi circostanti. Fino a che la forma tumorale è piccola, quindi, questa riesce

a procurarsi il nutrimento dalle cellule sane che la circondano ma nel momento in cui la massa cresce si può arrivare a

una dimensione tale che questo processo non sia più sufficiente e quindi viene stimolata la pro duzione di vasi sanguigni

che possano portare nutrimento attraverso delle vie alternative.

Anche in questo caso abbiamo delle vie di segnalazione che sfruttano dei fattori di crescita (come EGF) che si legano ai

rispettivi recettori. A quel punto si ha l’internalizzazione del segnale e la trasduzione di questo attraverso un

meccanismo a cascata mediato dalle chinasi. Il processo di angiogenesi è in speculare al processo della trasduzione del

segnale che abbiamo già visto. Alcuni farmaci che abbiamo già a nalizzato possono essere sfruttati anche per inibire il

processo di angiogenesi tumorale. NICOLA MORO – APPUNTI DI CHIMICA FARMACEUTICA E TOSSICOLOGICA 1

125

Nel momento in cui si ha la creazione di una forma tumorale primaria, e questa viene irrorata, è chiaro che avrà la

possibilità di avere una crescita incontrollata e continuativa. Abbiamo inoltre un'altra possibilità. I vasi sanguigni

neoformati, infatti, possono essere il veicolo attraverso cui le cellule cancerose hanno la possibilità di andare a dislocare

in altri distretti dell’organismo. I vasi sanguigni neoforma ti, quindi, sono anche vettori di Metastasi. Affinchè questo

avvenga è necessario che la cellula tumorale entri in circolo e che quindi riesca a perforare la parete vascolare per

migrare nel nuovo distretto. Questo è reso possibile dalla produzione di particolari fattori connessi alla cellula tumorale

che possono rappresentare dei bersagli per dei potenziali farmaci. Abbiamo quindi una serie di potenziali bersagli che

ci permettono di mantenere la forma tumorale sotto controllo. I fattori che possiamo andar e a controllare, ovviamente,

non eliminano la malattia ma la rendono praticamente innocua.

Vediamo ora qual è la differenza tra una classica e una terapia anti -angiogenesi. Analizziamo, per la precisione, il

trattamento con Endostatina che è un naturale si stema di blocco dell’Angiogenesi. Naturalmente, come detto prima,

nel momento in cui andiamo a bloccare l’Angiogenesi tumorale siamo anche in grado di andare a bloccare l’espansione

della massa tumorale in quanto le cellule non trovano più il nutrimento per riprodursi. La forma tumorale può quindi

essere limitata nelle sue dimensioni che non riescono ad aumentare. In questo modo rendiamo il tumore meno invasivo

sia in sede sia a livello dei distretti lontani dalla sede del tumore primario. Il trattamento co n Endostatina, quindi, blocca

la crescita dei vasi sanguigni e quindi la forma tumorale regredisce a una massa compatibile con l’autosostentamento

tramite le cellule circostanti. In pratica il trattamento viene effettuato per un certo periodo. Al termine d el trattamento

le cellule tumorali ricominciano a moltiplicarsi ed espandersi. A quel punto andiamo a intervenire con un altro

trattamento e così via. Naturalmente in questo modo non siamo in grado di eliminare completamente il tumore ma

riusciamo a mantenere sotto controllo la crescita della massa in modo tale da impedire che si abbia l’invasione e la

metastatizzazione.

La differenza che abbiamo nella chemioterapia è chiara. Nel caso della chemioterapia, infatti, andiamo a selezionare le

cellule resistenti. Facciamo quindi un iniziale trattamento con una mortalità delle cellule pari al 99.9%. Lo 0.01% di

cellule che sopravvivono rappresentano una popolazione di cellule resistenti al trattamento farmacologico. In questo

modo andiamo a selezionare una popolazione resistente che, nel momento in cui riesce a moltiplicarsi, non risulterà più

sensibile alla terapia utilizzata e quindi non avremo più una risposta al trattamento farmacologico.

In un caso abbiamo quindi la possibilità di andare ad effettuare un a terapia ricorrente che sia in grado di mantenere

ridotte le dimensioni della massa tumorale mentre nell’altro caso siamo in grado di avere una elevata risposta iniziale

che però nel tempo gioca a nostro svantaggio in quanto determina la selezione di clon i cellulari resistenti alle terapie

conosciute. Vediamo ora quali sono le differenze principali tra un normale vaso sanguigno e uno neoformato da cellule

tumorali. La prima cosa che possiamo notare sono le differenze a livello della permeabilità. Il vaso s anguigno derivante

NICOLA MORO – APPUNTI DI CHIMICA FARMACEUTICA E TOSSICOLOGICA 1 126

dall’angiogenesi tumorale è meno stabile e meno impermeabile dei vasi sanguigni “normali” e quindi permette un

passaggio di sostanze e cellule più facilitato. I vasi sanguigni formati in seguito ad angiogenesi tumorale, inoltre,

presentano un numero maggiore di fattori di crescita (tra cui vEGF) e inoltre è più fragile in quanto presenta un numero

minore di cellule di sostegno. Presenta infine delle proteine, dette Integrine, che invece non sono presenti nei vasi

sanguigni normali.

Abbiamo quindi dei bersagli di elezione che possono essere sfruttati, a partire ad esempio dai fattori di crescita. I fattori

di crescita, come abbiamo detto, si legano al recettore che internalizza il segnale. Potremmo ad esempio ad andare a

impedire l’interazione tra il fattore di crescita e il recettore. Un esempio è la Tecnica del Recettore Solubile. Questa

tecnica prevede l’emulazione della parte del recettore che si presenta all’esterno della cellula (responsabile

dell’interazione con il fattore di crescita) attraverso un processo di sintesi. In questo modo il fattore di crescita si legherà

al recettore solubile al posto di quello che si trova a livello della membrana. Il recettore tronco non è in grado di legarsi

alla membrana e quindi andremo a bloccare l’internalizzazione del segnale di crescita mediato dal fattore. Il recettore

solubile, quindi, può essere visto come una specie di competitore che sottrae il fattore di crescita al recettore naturale.

Un altro modo è quello di andare a interagire con il recettore attraverso un Anticorpo Monoclonale. In questo modo

l’anticorpo compete con il fattore di crescita inibendo l’internalizzazione del segnale. Allo stesso modo possiamo andare

a generare un anticorpo che agisca contro il fattore di crescita. In questo caso possiamo paragonare l’anticorpo contro

il fattore di crescita al recettore solubile. L’anticorpo contro il fattore di crescita, infatti, lega con alta affinità ques to

fattore impedendogli di andare a legarsi al suo recettore. In questo modo siamo in grado di andare a inibire il segnale.

Abbiamo quindi varie modalità di approccio che ci permettono di andare a inibire l’internalizzazione del segnale

impedendo, di fatto, che abbia luogo il processo di angiogenesi.

Possiamo anche andare a lavorare sulle Chinasi che subentrano a livello della trasduzione del segnale che. Una volta che

il fattore di crescita viene legato al recettore, infatti, abbiamo la cascata di segnalazione mediata dalle Chinasi che

permettono di andare ad attivare la trascrizione dei geni. In questo caso le chinasi deputate alla trasduzione del segnale

intracellulare possono essere utilizzate come bersagli di farmaci che abbiamo già visto che però in questo caso andranno

a inibire il processo di angiogenesi. In generale quindi, il processo può essere modulato in senso positivo e in senso

negativo in funzione dei fattori presenti. Abbiamo quindi dei fattori in grado di attivare l’angiogenesi e dei fattori in

grado di inibirla. NICOLA MORO – APPUNTI DI CHIMICA FARMACEUTICA E TOSSICOLOGICA 1

127

Come sempre avremo un equilibrio tra l’attivazione e la disattivazione di un processo fisiologico. Nel caso in cui serva

una stimolazione allora avranno la prevalenza i fattori che si trovano nella colonna a destra della tabella mentre nel caso

in cui l’angiogenesi non sia più necessaria allora andremo a bloccare il processo grazie ai fattori che troviamo nella

colonna sinistra della tabella.

FATTORI INIBENTI (-) FATTORI STIMOLANTI

Angiostatina vEGFs (fattori di crescita vascolari endoteliali)

Endostatina Angiogenina

sFlt (recettore vEGF) FGFs

SbFGFR (Fibroblast GFR) TNFα (Tumor Necrosis Factor)

TIMPs (Tissue Inhibitor Metallo Proteinase) TGFα (Transforming Growth Factor)

Interferone α TGFβ

Protammine PIGF (placenta)

Le metallo proteasi (TIMPs) sono necessarie per la cellula per essere in grado di attraversare le membrane vasali. Sono

delle proteine Zinco dipendenti deputate alla formazione di fori nei vasi sanguigni resistenti in modo tale da creare dei

punti di aggancio per i vasi neoformati. Queste metallo proteasi hanno anche delle proprietà importanti quando

parliamo di metastasi in quanto le cellule metastatiche sono in grado di estravasare e quindi di usare queste TIMPs per

la formazione di fori a livello dei vasi sanguigni che permettono la fuoriuscita della cellula cancerosa dal torrente

circolatorio. Il legame tra angiogenesi e metastasi, quindi, è evidente. Andare a stimolare l’angiogenesi corrisponde a

mettere in contatto la massa tumorale con la circolazione fisiologica. Una volta che questi sono entrati in contatto allora

c’è la possibilità che le cellule tumorali entrino nel circolo e vadano a colonizzare altre zone. Inibendo l’angiogenesi,

quindi, siamo in grado di andare a bloccare anche la metastatizzazione. I fattori negativi, quindi, sono interessanti dal

punto di vista del blocco del processo angiogenetico mentre i fattori positivi sono ovviamente dei fattori di crescita. In

questo modo possiamo da un lato andare a bloccare i fattori di crescita mentre dall’altro lato andiamo a stimolare i

processi fisiologici del blocco dell’angiogenesi per creare le condizioni per un trattamento terapeutico efficace.

Esistono quindi più approcci terapeutici che hanno lo scopo di andare a limitare l’angiogenesi con l’obiettivo di andare

a tenere sotto controllo la massa tumorale. Possiamo quindi blocc are i fattori di crescita che stimolano la produzione

del vaso, possiamo bloccare i fattori di invasione (metallo proteasi) attraverso degli inibitori. Gli inibitori delle metallo

NICOLA MORO – APPUNTI DI CHIMICA FARMACEUTICA E TOSSICOLOGICA 1 128

proteasi impediscono a questi enzimi di andare a creare le condizioni tali p er cui sia possibile l’estravasazione. Questo

comporta l’impedimento del vaso sanguigno neoformato di andare a collegarsi alla circolazione. Come abbiamo visto

esistono inibitori endogeni delle metallo proteasi che sono in grado di andare a bloccare la rip roduzione delle cellule

endoteliali. Ovviamente se impediamo alle cellule endoteliali di crescere allora queste non saranno più in grado di

andare a formare un vaso sanguigno. Abbiamo numerosi farmaci in commercio in quanto la ricerca è molto attiva sotto

questo punto di vista.

INIBITORI TISSUTALI DI METALLO PROTEASI

Gli Inibitori Tissutali delle Metallo Proteasi sono in grado di bloccare la capacità di andare a creare dei fori sulle pareti

dei vasi sanguigni impedendo torrente circolatorio di andare a for mare un legame angiogenetico con la massa tumorale

oltre a rendere impossibile alla massa tumorale di distribuirsi ulteriormente nell’organismo dando origine a metastasi.

Nel momento in cui blocchiamo la metastasi abbiamo risolto per il 90% il problema del la malattia. Quando riusciamo a

isolare la massa in un’area ben definita, se questa è raggiungibile, allora abbiamo risolto completamente il problema

del tumore. Gli inibitori tissutali, quindi, sono molto efficaci e la ricerca è in continua attività per r iuscire a trovare nuovi

composti che riescano a bloccare questi sistemi metallo dipendenti. La problematica di queste sostanze deriva dal fatto

che queste inibiscono anche i processi fisiologici. Molto spesso, ad esempio, accade che con l’utilizzo di questi farmaci

le articolazioni si irrigidiscano (le metallo proteasi sono sfruttate dall’organismo per rimodellare continuamente le

cartilagini). Quindi da un lato abbiamo il vantaggio di riuscire a trattare la malattia ma dall’altro abbiamo anche questi

gravi effetti collaterali. È quindi necessario trovare dei sistemi il più selettivi possibili per permettere di interferire con

le metallo proteasi tissutali legate all’angiogenesi e non quelle legate al rimodellamento delle cartilagini ad esempio.

FARMACI CONTRO L’ANGIOGENESI

NEOVASTAT Il Neovastat è un inibitore a struttura peptidica che lega in maniera efficace lo Zinco.

L’inibitore, quindi, ha la possibilità di inibire l’enzima complessano lo ione metallico e

impedendo che questo metallo funga da catalizza tore per i processi di proteasi.

SUNITINIB Un altro esempio di farmaco che inibisce l’angiogenesi è il Sunitinib che è un farmaco

in grado di andare a bloccare i segnali del recettore EGF e che quindi è anche in grado

di andare a interferire con l’angiogenesi mediante un meccanismo di inibizione delle

Tirosin Chinasi. Oltre a vEGF è anche in grado di andare a inibire i segnali mediati da

FGF e PDGF.

AVASTIN (Bevacizumab)

Un farmaco approvato è l’Avastin (vedi scandalo Avastin-Lucentis) che è un anticorpo monoclonale. Il farmaco viene

usato come antitumorale ma è possibile utilizzare la stessa tipologia di approccio per andare ad affrontare altre malattie

correlate ad angiogenesi come ad esempio come ad esempio la Degenerazione Maculare. L’Avastin è in grado di andare

a legare vEGF bloccando l’interazione con i recettori e quindi inibendo l’attivazione della trasduzione del segnale

inducendo così la regressione della vascolarizzazione tumorale.

ANGIOZIMA, ENDOSTATINA, SQUALAMINA

L’Angiozima è una sequenza di RNA (Ribozima) che è in grado di interferire con VEGF ma fino ad ora ha dato scarsi

risultati. È una struttura a RNA auto-catalitica. In pratica andando a riconoscere come bersaglio l’mRNA codificante il

vEGF impedisce l’attivazione del bersaglio andando a bloccare l’mRNA. In precedenza abbiamo anche analizzato gli

effetti dell’Endostatina che, come abbiamo visto, è un inibitore fisiologico dell’angiogenesi. Queste molecole sono

considerati farmaci di fase I o fase II quindi sono ancora sotto fase di studio.

NICOLA MORO – APPUNTI DI CHIMICA FARMACEUTICA E TOSSICOLOGICA 1

129

m-TOR (Ser-Thr CHINASI)

m-Tor è una Serin Treonin Chinasi. Il nome TOR deriva da Target of Rapamicine. È un enzima che si assembla in complessi

con altre proteine che vengono chiamati m-TORC1 e m-TORC2. Questi complessi sono collegati con il meta bolismo dei

lipidi, con i processi angiogenetici, con processi metabolici ecc. Il sistema, quindi, è molto variegato e le interazioni sono

numerose. Questi processi, in ogni caso, sono collegati con la proliferazione cellulare, con la crescita e con i proc essi

energetici in generale. All’inizio la Rapamicina veniva usata

come antifungino in quanto aveva delle caratteristiche

strutturali simili a delle strutture antifungine. Si scoprì solo in

seguito che era una sostanza attiva contro i processi cancerosi

e contro l’internalizzazione dei segnali biochimici di

proliferazione. Si è capito quindi che mTOR poteva essere

interessante dal punto di vista di trattamenti terapeutici contro

le forme tumorali. In particolare si è visto che è attiva sia sul

sistema immunitario sia sulla angiogenesi. I complessi mTORC1

e mTORC2 sono degli insiemi di varie proteine e di varie chinasi

che possono, collegandosi individualmente tra di loro,

stimolare angiogenesi (HEF), interferire con il metabolismo

mitocondriale (PGC1a), interferire con l’Adipogenesi (PPAR).

Riesce ad agire in maniera analoga su altri fattori che

determinano la crescita e la proliferazione cellulare. Ci troviamo

davanti, quindi, un sistema multivalente i cui inibitori possono

essere usati anche contro adiposi e altre patologie prima tra

tutte il cancro ovviamente. La Rapamicina ha una struttura macrociclica (Macrolide) e possiamo notare che questa

struttura ciclica corrisponde a un ammide. Possiede una zona di doppi legami coniugati che è in grado di riconoscere m-

TOR e possiede vari analoghi semisintetici. Questi analoghi non sono solo precursori del farmaco ma possiedono anche

una attività propria. Si pensava infatti che gli esteri, come il Temsirolimus, fossero dei profarmaci mentre in seguito si è

notato che questa molecola possiede essa stessa una certa attività. Vediamo che la struttura ciclica è estremamente

ossigenata nella sua parte superiore mentre tutta la zona dei doppi legami si trova nella parte inferiore. Il cicloesano

presente nella parte superiore della molecola può essere un sito dove è possibile andare ad effettuare delle sostituzioni

inserendo gruppi esterei o fosfoesterei che possono da una parte essere dei gruppi protettori della funzionalità della

molecola ma dall’altra sono essi stessi del le molecole attive. Più recentemente si sono anche trovati degli inibitori del

sito ATP di m-TOR. Abbiamo infatti visto che m-TOR partecipa anche a tutti i processi energetici della cellula e quindi

possiamo andare ad agire su di esso attraverso delle inibizioni.

INIBITORI DI m-TOR

Gli inibitori di m-TOR sono delle strutture policicliche che hanno una struttura comunque flessibile. Sono delle molecole

modestamente attive e modestamente selettive. Messe insieme agli inibitori di I° generazione (quelli visti prima) sono

in grado di dare un effetto sinergico elevato. Sono dei sistemi relativamente recenti pur essendo stati scoperti molto

tempo fa. Questi farmaci sono particolarmente indicati per le forme tumorali a livello renale.

PICCOLI CENNI SULLE TELOMERASI

Le Telomerasi sono degli enzimi che sono espressi nelle cellule germinali e, in seguito alla trasformazione in cellule

somatiche, vengono silenziati. Nel 90% delle cellule tumorali, invece, troviamo questi enzimi attivi. Questo enzima, una

NICOLA MORO – APPUNTI DI CHIMICA FARMACEUTICA E TOSSICOLOGICA 1 130

volta attivato, consente alla cellula di replicarsi indefinitamente senza morire. L’enzima, quindi, contiene una sequenza

di RNA che funge da stampo necessario per l’allungamento dei Telomeri (le strutture terminali dei cromosomi) che sono

ripetitivi. Man mano che la cellula si replica le strutture terminali si consumano e quindi si ha un accorciamento del DNA.

A un certo punto è chiaro che le cellule, continuando a perdere i Telomeri, arrivano al punto di non essere più in grado

di sopravvivere. Si crea quindi una situazione di crisi cellulare che porta alla morte della cellula. Con le Telomerasi

costitutivamente attive non si ha l’accorciamento dei Telomeri e proprio per questo motivo la cellula tumorale risulta

immortale. Con le Telomerasi inibite, infatti, una cellula può effettuare al massimo 25 replicazioni circa. Chiaramente

nel caso in cui riuscissimo a trovare un inibitore delle Telomerasi riusciremmo a rendere mortale la cellula tumorale e

quindi saremmo in grado di eliminare la malattia. Questo, quindi, è un b ersaglio importante e fondamentale.

Attualmente non esistono farmaci efficaci in questo senso. Il blocco dell’enzima potrebbe essere effettuato o a livello

dell’RNA (con una sequenza complementare a questo stampo) oppure andando a bloccare la funzionalità enzimatica.

Un’altra possibilità che si era pensata era quella di

andare a bloccare il Telomero in una struttura tale da

non essere suscettibile all’elongazione da parte della

Telomerasi che necessita di un innesco di DNA. Se il DNA

si ripiega su sé stesso allora non è più un substrato

adatto per la Telomerasi. Si sono quindi sviluppati dei

potenziali farmaci che agivano sui Telomeri rendendoli

incapaci di legare la Telomerasi. In questo modo

abbiamo bloccato il substrato dell’enzima e non

l’enzima di per sé. Questi fatti però, ovviamente,

comportano una certa tossicità anche nei confronti

delle cellule sane poiché il Telomero esiste anche nelle

cellule sane. Le modificazioni che sono apportate dal

farmaco sulla struttura del Telomero, evidentemente,

comportano un rischio in quanto rende le cellule

instabili dal punto di vista del cromosoma. Venerdì, 27 Novembre 2015

Un recente sviluppo della ricerca sul cancro è legato all’Epigenetica ovvero una modalità di regolazione dell’espressione

genetica dipendente da fattori esterni e non dal patrimonio genetico dell’individuo. Ognuno di noi, pur avendo un

patrimonio genetico corretto, è soggetto a dei processi che regolano l’espressione genica in maniera diversa. Alcuni

fattori, tra cui fattori esterni, sono in grado di andare a modificare il fenotipo rendendolo specifico per ciascun individuo.

Passiamo quindi dal concetto di genotipo (sequenza genetica e danno genetico all’acido nucleico) come elemento

scatenante della la malattia ad altri fattori che sono invece collegati con delle modificazioni epigenetiche (al di fuori

della genetica) che però sono in grado di modulare l’espressione genica. Vediamo come possiamo approcciare il

concetto di epigenetico per quanto riguarda lo sviluppo di nuovi farmaci razionali indirizzati alla malattia cancerosa.

ESPRESSIONE GENICA

Ricordiamo brevemente che la Cromatina, quando non è in una conformazione funzionale, si trova in una condizione

condensata e questa condensazione è dovuta a delle proteine basiche chiamate Istoni. Gli istoni, quindi, sono delle

proteine basiche (per permettere il legame con l’acido nucleico) che condensando la struttura della Cromatina la

rendono inaccessibile alla traduzione e alla trascrizione. Esistono quindi due situazioni. La prima è una situazione

compatta in cui la Cromatina non può essere letta e tradotta (forma inattiva) in cui la traduzione è impedita da due

processi ovvero la metilazione delle Citosine e la deacetilazione degli Istoni. Gli istoni, infatti, essendo gruppi basici

possono essere acetilati ma, nel momento in cui vi è una acetilazione, si ha la perdita delle proprietà basiche della che

sono quelle proprietà che garantiscono la condensazione della Cromatina. Gli Istoni condensano la Cromatina quando

questi sono carichi. Quando abbiamo l’acetilazione, quindi, l’Istone vede la sua carica annullata e quindi. Nel momento

in cui l’Istone non ha più la carica opposta rispetto all’acido nucleico allora la Cromatina si distende e si rende disponibi le

per la trascrizione. Abbiamo qui ndi due stati per la Cromatina che corrispondono allo stato “On” (che prevede le Citosine

non metilate e gli Istoni acetilati) e allo stato “Off” (che prevede le Citosine metilate e gli Istoni de-acetilati).

NICOLA MORO – APPUNTI DI CHIMICA FARMACEUTICA E TOSSICOLOGICA 1

131

Lo stato di acetilazione/deacetilazione degli istoni, e quindi l’espressione genica, varia con stato di malattia. Potremmo

pensare che i processi esterni alla sequenza genomica sono influenti ai fini dello sviluppo della forma cancerosa ma in

realtà non è così. Molte forme cancerose sono correlate al la espressione di geni e in particolare geni Oncosoppressori

e che sono deputati alla riparazione dell’Acido Nucleico. Abbiamo quindi due tipologie di intervento che tendono a

reprimere dei geni che invece dovrebbero risultare attivi. La forma Off della cromatina, in particolare, ha a che fare con

l’espressione mancata di geni Oncosoppressori (che ci interessano per bloccare lo sviluppo della malattia) e di Enzimi di

riparazione del DNA (la cui espressione è necessaria per risolvere i danni al genoma). Poss iamo pensare di far tornare il

fenotipo normale attraverso l’inibizione delle HDAC (Istone Deacetilasi). Nel momento in cui l’HDAC funziona allora

abbiamo una de-acetilazione che corrisponde a una condensazione della Cromatina. Se invece impediamo la

condensazione della Cromatina allora permettiamo che avvenga il processo di traduzione e quindi permettiamo

l’attivazione dei fattori Oncosoppressori o di Riparazione del DNA. Possiamo quindi pensare di intervenire

terapeuticamente sull’Epigenetica inibendo le HDAC. Nel momento in cui inibiamo le HDAC allora impediamo la

deacetilazione e quindi inibiamo l’espressione genica. L’acetilazione dell’Istone è mediato dall’Enzima Istone Acetil

Transferasi (HAT) e quindi questo è l’enzima deputato all’attivazione della Cromatina. A questo punto, quindi, la

Cromatina si apre in seguito alla non metilazione e alla Acetilazione. L’apertura della Cromatina, ovviamente,

corrisponde alla possibilità di andare ad attivare la trascrizione dei geni. Viceversa nel momento in cui a bbiamo la de-

acetilazione allora condensiamo la Cromatina e quindi la otteniamo nella forma condensata. In questo modo

l’espressione genica viene repressa. La repressione dell’espressione genica dei geni Oncosoppressori e dei geni deputati

al riparo della sequenza di acido nucleico è una condizione sfavorevole dal nostro punto di vista in quanto andiamo a

inibire dei meccanismi essenziali per il controllo della crescita cellulare. L’idea, quindi, è quella di andare a inibire la

Deacetilasi impedendo così la condensazione della Cromatina. In questo modo i geni Oncosoppressori e i geni deputati

alla riparazione del DNA possono essere espressi e quindi possono regolare la funzionalità cellulare. In una cellula in cui

abbiamo un eccesso del funzionamento dell’Enzima HDAC allora il DNA risulta super-condensato e questo impedisce la

trascrizione di geni Oncosoppressori. L’equilibrio tra deacetilazione e acetilazione, ovviamente, è regolato sia dalla HDAC

sia dalla HAT.

NICOLA MORO – APPUNTI DI CHIMICA FARMACEUTICA E TOSSICOLOGICA 1 132

Osservando l’immagine possiamo notare che nel caso in cui l’immagine sia verde allora l’espressione genica è attiva

mentre nel caso in cui il segnale sia rosso allora l’espressione genica è bloccata. Come possiamo notare, infatti, nelle

cellule normali si ha la prevalenza della colorazione verde mentre nelle cellule tumorali la colorazione dominante è

quella rossa. Il nostro obiettivo è quello di andare ad attivare l’espressione genica di quei geni repressi in modo da

andare a sbilanciare, a livello di fenotipo, la forma tumorale verso la forma no rmale della cellula. Una delle possibilità,

quindi, è quella di andare a inibire HDAC. Con HDAC non intendiamo un solo enzima ma una famiglia di enzimi (18 noti)

che sono suddividi in quattro classi tre delle quali sono metallo dipendenti. Si hanno, ovviamente, delle specificità per i

vari tipi di istoni e i vari tipi di deacetilazione. Le classi I, II e IV sono le classi metallo -dipendenti (Zn) e sfruttano come

+

cofattori il NAD . La classe III non è metallo dipendente. La metallo dipendenza ci fa pensare c he ci sia la possibilità di

andare a sviluppare dei farmaci in grado di inibire l’attività dell’enzima attraverso dei processi di complessamento dello

ione metallico. Un ottimo complessante per quanto riguarda lo Zinco è l’Acido Idrossammico. Sono stati sv iluppati,

quindi, una serie di farmaci che possiedono queste caratteristiche adatte a complessare questi ioni.

VORINOSTAT

Possiamo notare che nel caso del Vorinostat abbiamo una struttura Benzammidica con una catena lineare che termina

con l’Acido Idrossammico ovvero un Acido Carbammico che presenta un

ossidrile legato all’amminogruppo. L’Acido Idrossammico presenta una

struttura chelante che è in grado di andare a legare in maniera efficace

lo Zinco. Come possiamo notare la molecola presenta una catena

possedente due gruppi ammidici. In pratica la parte Benzammidica e la

catena lineare sono tali da adattarsi al sito attivo enzimatico mentre il

gruppo Idrossammico è deputato al complessamento dello ione metallico. Abbiamo quindi una zona di riconoscimento

del bersaglio e una zona di complessamento dello Zinco. In questo modo si ha l’inattivazione dell’enzima.

ENTINOSTAT e PANOBINOSTAT

I due farmaci sopra rappresentati, come possiamo notare, sono differenti a livello strutturale in confronto al Vorinostat

ma il principio di base è sempre lo stesso. Anche nel caso del Panobinostat, ad esempio, abbiamo il gruppo

Idrossamminico terminale che complessa lo ione Zinco. In questo caso abbiamo un derivato Indolico. Nel caso

dell’Entinostat, invece, abbiamo un deriva to amminico che presenta la struttura carbammica centrale e quindi, ancora

una volta, abbiamo una benzammide con un sistema in grado di andare a complessare efficacemente lo ione Zinco.

ROMIDEPSINA

La Romidepsina è un prodotto naturale derivante da una s erie di amminoacidi.

Come possiamo osservare è presente un ponte disolfuro derivante da due

Cisteine. È una struttura “a canestro” che “incamera” lo Zinco e agendo quindi

da chelante. NICOLA MORO – APPUNTI DI CHIMICA FARMACEUTICA E TOSSICOLOGICA 1

133

Ovviamente non tutte le HDAC sono sensibili a questi farmaci. Le HDAC di tipo III, infatti, non risentono degli effetti di

queste molecole in quanto non sono enzimi Zinco dipendenti e quindi non possono andare a formare dei complessi.

L’unica reattività che danno con la forma III di HDAC è dovuta al gruppo carbammico.

Se andiamo a osservare il sito catalitico di una HDAC vediamo, ad

esempio nel caso della SAHA, come il farmaco riesca a interagire in

maniera estremamente efficace con il nucleo metallico dell’enzima.

La Benzammide si adatta all’avvallatura corrispondente a lla zona

catalitica mentre lo Zinco viene chelato. In questo modo siamo in

grado di garantire la funzionalità attraverso un legame idrofobico

(parte centrale della molecola) e un legame chelante allo ione

metallico nella parte terminale (Acido Idrossammico).

Uno dei primi farmaci ad essere stato sviluppato come inibitore è stato il Sodio Butirrato.

in funzione della struttura dei vari farmaci abbiamo selettività differenti per una classe

rispetto ad un'altra. Le strutture, come possiamo notare, mantengono quasi sempre una

porzione idrofobica (Benzammide solitamente). Un altro farmaco interessante è la

Tricostatina A. Questa molecola possiede

una struttura chetonica che porta un acido Idrossammico nella sua parte

terminale. Abbiamo poi l’MS275 che, anche in questo caso, contiene un

nucleo Benzammidico.

Abbiamo quindi dei farmaci efficaci che danno dei buoni risultati.

SIRTUINE

Le Sirtuine sono una classe farmacologica che comprende sia degli attivatori sia degli inibitori. Abbiamo quindi, in un

certo senso, una situazione contraddittoria in quanto il nostro obiettivo è prevalentemente quello di anadare a inibire

le HDAC. Tuttavia è vero che nel caso in cui inibiamo le HDAC allora attiviamo i vari geni Oncosoppressori ma è anche

vero che vengono attivati anche gli Oncogèni. Il processo, infatti, non è specifico per i geni Oncosoppressori, diciamo

che al massimo sono i geni che vengono più colpiti nel caso in cui si abbia una attivazione delle HDAC. Nel momento in

cui inibiamo una HDAC, quindi, abbiamo un effetto di stimolazione dei geni Oncosoppressori che è un fatto positivo ma,

contemporaneamente, abbiamo una attivazione degli Oncogèni che è un fatto

negativo. La situazione di attivatore e inibitore potrebbe essere utilizzata, in

funzione delle forme tumorali, per attivare da un lato i geni Oncosoppressori e

dall’altro per reprimere gli Oncogèni. Tra queste strutture ricordiamo il

Resvelatrolo (attivatore delle HDAC).

Abbiamo quindi un’altra via che non è più una via che ha a che fare con processi di replicazione cellulare dipendenti dal

patrimonio genetico della cellula ma da attività influenzate da altri fattori. In questo caso, in pratica, dovremmo sfruttare

delle terapie individualizzate.

Non esiste un farmaco perfetto in quanto ogni farmaco, nel tempo, perde la sua attività non a causa di modifiche

strutturali ma per il fatto che il sistema biologico al quale era diretto si riorganizza per eliminare gli effetti del farmaco

che, come sappiamo, dal nostro corpo è riconosciuto come uno xenobiotico. L’organismo, quindi, cera di ripristinare la

funzionalità della cellula anche se quest’ultima è malata. Inevitabilmente nel tempo ogni farmaco noto porta a

resistenza e in particolare questi farmaci contro la proliferazione. La resisten za rappresenta l’incapacità da parte del

farmaco di mantenere la sua attività nel tempo a causa di modificazioni intervenute a livello cellulare. La resistenza non

NICOLA MORO – APPUNTI DI CHIMICA FARMACEUTICA E TOSSICOLOGICA 1 134

è un fenomeno che si instaura improvvisamente ma si avvia e, un po’ alla volta, fa in modo d i aumentare l’IC ovvero

50

la concentrazione efficace del farmaco che viene portata sopra il limite di tossicità. Come sappiamo non possiamo

spingerci oltre questa concentrazione limite in quanto, se ciò avvenisse, gli effetti tossici prevarrebbero su quell i

terapeutici. Questo fenomeno, quindi, porta inevitabilmente all’inutilizzabilità del farmaco per quella terapia specifica

e per quel paziente specifico. Uno dei metodi che possono essere usati per ovviare a questi problemi è quello di

attaccare più bersagli contemporaneamente. Se abbiamo la possibilità di somministrare farmaci multi target, infatti,

siamo in grado di attaccare la cellula su più vie e quindi è più probabile che le cellule, invece che adattarsi, muoiano per

via apoptotica. Vorremmo essere i n grado, quindi, di sviluppare dei sistemi che provochino l’apoptosi cellulare senza

prima andare a sviluppare una resistenza il che ci permetterebbe di protrarre il trattamento terapeutico. Le cellule

sviluppano resistenza per il fatto che, quando agiamo su di esse con una terapia farmacologica, andiamo a selezionare

dei cloni cellulari che sono via via sempre più resistenti all’effetto del farmaco. In questo modo, involontariamente,

portiamo il tumore a non essere più sensibile al trattamento farmacologic o. Dall’altro lato possiamo tentare di invertire

la tendenza alla resistenza attraverso delle logiche che verranno illustrate. La resistenza, però, è un fatto inevitabile che

mentre da un lato ci limita nel nostro approccio terapeutico dall’altro ci stimol a a sviluppare sempre nuovi farmaci (NCE)

che permettano di fare un passo avanti e quindi di superare la resistenza attraverso un approccio innovativo. La

trattazione sulla resistenza non vale solo per i farmaci antineoplastici ma anche per gli antivirali e per gli antibatterici.

Non ci sarà mai, quindi, una struttura farmacologica perfettamente insensibile alla resistenza. È quindi necessario

trovare un equilibrio tra l’efficacia del farmaco, la sua capacità di riconoscere il bersaglio e la capacità del bersaglio di

modificarsi variando alcune proprietà della cellula per sopravvivere ed evitare l’azione tossica promossa dal farmaco.

Per quanto riguarda i meccanismi di resistenza possiamo intervenire in vari modi che sono affrontabili utilizzando

farmaci che hanno altri meccanismi d’azione. Tuttavia esiste una forma di resistenza che è molto più subdola e viene

chiamata resistenza pleiotropica (multi farmaco). Questa resistenza multi farmaco diventa largamente indipendente

dalla natura del farmaco e si attua in una maniera che non permette un trattamento alternativo. In pratica tutti i farmaci

di quel tipo terapeutica non sono più capaci di svolgere il loro effetto su quella particolare forma tumorale.

MECCANISMI DI RESISTENZA

RIDOTTO INFLUSSO DEL FARMACO

È un concetto essenzialmente fisico. Se il farmaco non riesce a raggiungere il bersaglio, infatti, la sua azione viene meno.

In quel caso avremo bisogno di una maggiore concentrazione della specie a livello del sito di azione. Se il farmaco trova

un ostacolo nell’internalizzazione nella cellula, ovviamente, questo ostacolo rappresenta una resistenza. Questo, però,

è un processo raro.

AUMENTATO EFFLUSSO DEL FARMACO:

È quello che in precedenza abbiamo definito come processo pleiotropico. È un tipo di difesa cell ulare che prevede

l’attivazione di pompe (contro gradiente) che spingono il farmaco verso l’esterno della cellula. In pratica si somministra

il farmaco, entra nella cellula e, una volta entrato, incontra pompe che agiscono per estruderlo dalla cellula. All ’interno

della cellula, quindi, non si raggiunge la concentrazione efficace perché queste pompe di efflusso fanno eliminano la

capacità del farmaco di raggiungere la concentrazione efficace al sito di azione.

RIDOTTA ATTIVAZIONE METABOLICA DEL FARMACO

In seguito a un ridotto metabolismo si ha anche una riduzione della capacità del farmaco ad essere attivato.

AUMENTATA INATTIVAZIONE DEL FARMACO

Se abbiamo un farmaco che è già attivo di per sé allora sarà l’aumentato metabolismo a portare a un minore effetto del

farmaco poiché si ha la formazione di metaboliti inattivi.

SOVRAESPRESSIONE DEL BERSAGLIO

Abbiamo visto un meccanismo d inattivazione di questo tipo quando abbiamo parlato delle Topoisomerasi. In questo

caso si ha una iperespressione di enzimi che, ovviamente, richiederà una maggior quantità di farmaco affinchè questo

promuova lo stesso effetto tossico per la cellula. NICOLA MORO – APPUNTI DI CHIMICA FARMACEUTICA E TOSSICOLOGICA 1

135

MUTAZIONE DEL BERSAGLIO

Anche nel caso in cui si abbia una singola mutazione puntiforme si può avere una inattivazione del farmaco . In questo

caso, infatti, è probabile che si abbia un’incapacità da parte del farmaco di legarsi al bersaglio. Solitamente il tipo di

amminoacido (polare, apolare, carico ecc.) non varia ma cambiano gli ingombri sterici che diminuiscono l’affinità del

recettore per il farmaco.

AUMENTATA RIPARAZIONE DEL DANNO PRODOTTO DAL FARMACO

Se i sistemi di riparazione vengono modulati in maniera eccessiva da parte della cellula malata è chiaro che il danno del

farmaco viene minimizzato dal meccanismo di riparazione che permette alla cellula di sopravvivere.

Una volta che il bersaglio viene mutato allora non possiamo più agire in nessun modo su di esso e quindi saremo costretti

a cercare un altro farmaco. Se l’enzima viene iperespresso, invece, l’iperespressione determina la necessità di avere

dosi maggiori di farmaco. Anche in questo caso sarà necessario agire andando a modificare il farmaco e andando ad

agire, quindi, su un altro tipo di bersaglio. La resistenza multipla, come possiamo intuire, è quella che ci dà p iù difficoltà

nell’agire. Se avessimo una resistenza specifica, infatti, potremmo semplicemente andare a modificare il target

terapeutico risolvendo così (almeno temporaneamente) il problema. Nel caso della resistenza multipla, invece, si è in

difficoltà perché qualsiasi sia il farmaco somministrato non avremo alcun tipo di effetto in quanto si ha l’attivazione

della pompa di esclusione che impedisce al farmaco di raggiungere i bersagli terapeutici. A quel punto non si è più in

grado di intervenire perché non abbiamo più alcun mezzo efficace. Non ci sono ancora farmaci nuovi che possano

invertire la tendenza all’MDR (Multiple Drug Resistance) ma ce ne sono alcuni in fase di sperimentazione (Fase Clinica

III). È quindi chiaro che la resistenza crociata è il problema chiave. I geni MDR non sono dei geni che nascono in seguito

all’azione del farmaco. Sono infatti dei geni già presenti nel nostro organismo come geni di difesa ma, solitamente, sono

disattivati. Certe forme sono delle forme di resistenza intrinseca dovute alla tipologia di malattia oppure possiamo avere

delle forme di resistenza acquisita in cui, man mano che tratto pazienti malati con un farmaco, questi sviluppa una

resistenza con una mutata risposta al farmaco stesso con esito infausto per il pazi ente.

ABC (ATP BINDING CASSETTE)

Abbiamo i geni MDR che codificano per proteine che sono dette ABC (ATP Binding

Cassette). Sono quindi delle proteine che, in qualche modo, hanno una zona di legame

con ATP. La cellula necessita di ATP perché va il meccanismo di estrusione è un

meccanismo che va contro gradiente e quindi richiede energia per avvenire. In generale

queste ABC sono delle Glicoproteine classificate come:

P Glicoproteina(Pgp): la più nota.

Proteine legate all’MDR (MRP: Multi Drug Resistance Related Proteins): Ce ne

sono di vario tipo (MRP1, MRP2, MRP3, MRP4).

Proteine legate alla resistenza di specifiche forma tumorali: come le forme tumorali polmonari (LRP) e al seno

(BCRP). Sono particolari proteine specifiche che vengono appunto prodotte solo in alcune forme di cancro.

Facendo comunque parte della classe delle ABC hanno delle caratteristiche globali simili.

E’ evidente che se noi riusciamo in qualche modo ad inibire le glicoproteine allora siamo in grado di inibire una tipo di

resistenza che non più trattabile terapeuticamente. Nel momento in cui siamo in grado di impedire il processo che porta

all’eliminazione del farmaco dall’interno della cellula allora saremo anche in grado di andare a ricostituire le

concentrazioni intracellulari efficaci e saremo quindi in grado di portare a termine il trattamento terapeutico senza

preoccuparci della resistenza. Una grossa fetta della ricerca oncologica è destinata allo studio di modalità di intervento

per produrre l’inversione del processo MDR. Quando rius ciremo a fare questo avremo un’ottima probabilità di avere

farmaci efficaci e di mantenerli tali per lungo tempo. Le Glicoproteine, ad esempio la P-Glycoprotein, è codificata dal

gene mdr1. Ha un PM di 170kDa ed è una pompa di efflusso per i farmaci ATP d ipendente. È espressa da quasi tutti i

tessuti ed impedisce l’accumulo dei sostanze terapeutiche all’interno della cellule. Questa Glicoproteina è caratteristica

nei casi di resistenze alle Antracicline, alle Camptotecine, agli Alcaloidi della Vinca, al Tassolo e agli Antibiotici

Antitumorali. In pratica tutti questi processi caratterizzati da meccanismi diversi, portano allo stesso risultato in quanto

tutti i composti sopra citati sono substrati della P-Glycoprotein e quindi tutti possono essere bloccati nella loro attività.

Questa Glicoproteina porta a una resistenza minore per composti come il Cis-Platino, gli Agenti Alchilanti, e quelli che

NICOLA MORO – APPUNTI DI CHIMICA FARMACEUTICA E TOSSICOLOGICA 1 136

abbiamo definito come Antimetaboliti. Possiamo quindi notare

che si ha una maggiore resistenza verso i prodotti di origine

naturale. Il prodotto naturale, quindi, è più soggetto a

resistenza se lo mettiamo a confronto con i prodotti di sintesi.

Normalmente il farmaco non entra nella cellula con

meccanismi attivi. Il farmaco quindi permea la membrana ed

entra nella cellula. A questo punto la Glicoproteina P in pratica

lega il farmaco e in seguito ad idrolisi di ATP lo fa uscire dalla

cellula. Il meccanismo di entrata, quindi, può essere diverso in

funzione del tipo di farmaco ma il meccanismo di estrusione è

estrusione è sempre lo stesso. Come possiamo osservare tutti i

composti che conosciamo sono tutti soggetti a una certa

resistenza da parte di una a più strutture. Come anticipato,

quindi, non esiste alcun farmaco che non abbia blocco da una

di queste Glicoproteine.

Possiamo agire cercando di eliminare le cellule malate attraverso massicce dosi terapeutiche. In pratica cerchiamo di

eliminare tutte le cellule prima che queste riescano a sviluppare una qualsiasi resistenza. Spesso, infatti, nei farmaci

antineoplastici si usano dosi sub-letali in modo tale che la cellula venga eliminata prima che riesca ad esprimere i geni

di difesa. Un altro metodo utilizzato è quello di utilizzare combinazioni di farmaci (es. Iressa con il Tassolo) in modo TALE

che la cellula non faccia in tempo ad attivare i geni deputati alla difesa. Cercheremo, ovviamente, di essere sempre un

passo avanti a questi meccanismi andando a sviluppare sempre nuovi composti (NCE) che possiedano meccanismi

differenti da quelli già noti.

CHEMIO-SENSIBILIZZANTI

L’ultimo aspetto riguarda sostanze che non agiscono come farmaci di per sé ma che co -somministrati con il farmaco in

qualche modo si legano preferenzialmente alla Glicoproteina in modo tale da agire come substrato suicida andando a

bloccare la pompa permettendo al farmaco di continuare la sua azione. L’idea dei chemio-sensibilizzanti in realtà è stata

sviluppata in seguito a una osservazione sul Verapamil (farmaco anti-vascolare che quindi non agisce come

antineoplastico). Si era notato che i pazienti trattati anche con questo farmaco sviluppavano la resistenza più

lentamente di altri pazienti e quindi lo si è correlato al processo di

blocco della Glicoproteina. La struttura corrisponde a una struttura

metossibenzenica con un’ammina terziaria centrale e con due zone

idrofobiche ai due lati. Purtroppo non abbiamo strutture

dimensionali valide per la Glicoproteina in quanto è una proteina di

membrana. Nel momento in cui la isoliamo e la cristallizziamo allora

la struttura che otteniamo è diversa da quella fisiologica e quindi è difficile trasferire i dati ottenuti dal punto di vista

biofisico rispetto alla situazione reale. Comunque si sono sviluppati, oltre a questi farmaci di prima generazione, le

Ciclosporine, strutture Fenotiaziniche e Chinoliniche. In generale sono strutture aromatiche con un sistema ad uno o

due anelli (anche eterociclici) e una zona centrale polare,

protonabile, che è data dall’ammina terziaria. Notiamo le stesse

proprietà generali anche nella MS-209, che è sempre un farmaco di

prima generazione. I farmaci di prima generazione sono i primi

composti che sono stati approvati avevano altre finalità.

Generalmente questi composti danno problemi sia di selettività che

di tossicità e quindi sono stati praticamente abbandonati. Per questo

motivo si è andato avanti con le generazioni e si sono ottenuti sistemi

NICOLA MORO – APPUNTI DI CHIMICA FARMACEUTICA E TOSSICOLOGICA 1

137

come il Valspodar che è una struttura ciclica associabile alle Ciclopurine. Questa

molecola era principalmente usata nei trapianti per mitigare rigetti e poi si sono

dimostrati capaci di interferire con un enzima MDR. Il problema del prodotto naturale

è sempre un problema per la reperibilità del prodotto e anche in termini di efficienza

nel tempo per cui si sono sviluppati dei prodotti nuovi con delle strutture ramificate (es.

Biricodar). Queste sostanze stanno dando de buoni risultati in fase clinica. Queste

sostanze presentano vari anelli aromatici (anche eterociclici) e possiamo notare

che si tende a mantenere una zona protonabile. Queste zone protonabili,

infatti, permettono un bilanciamento con l’idrofobicità elevata (dovuta alle

catene alifatiche e aromatiche). I gruppi protonabili, inoltre, permettono anche

di aderire con le proteine di membrana bloccando così la struttura dell’enzima.

La zona aromatica e alifatica del gruppo idrofobico, invece, si blocca su

superficie Glicoproteina impedendo il legame con i farmaci.

Vediamo ora l’ultima generazione (che è quella della fase clinica) che come abbiamo detto sta dando buoni risultati e

notiamo che si preferisce una struttura abbastanza allungata le cui estremità sono apolari mentre la parte centrale si

hanno dei gruppi amminici protonabili. Si notano sempre dei cicli e degli eterocicli anche condensati. Notiamo che dal

punto di vista chimico fisico le proprietà generali sono comunque si mili (gruppi apolari e ammine protonabili).

Questi farmaci, appunto, danno molto meno tossicità e sono abbastanza selettivi per le proteine MDR senza dare

tossicità elevate. Sono quindi farmaci potenzialmente molto potenti.

NICOLA MORO – APPUNTI DI CHIMICA FARMACEUTICA E TOSSICOLOGICA 1 138

NICOLA MORO – APPUNTI DI CHIMICA FARMACEUTICA E TOSSICOLOGICA 1

139 Mercoledì, 9 Dicembre 2015

Anche i farmaci a DNA fanno parte della famiglia dei famaci biotecnologici. I farmaci biotecnologici possono essere

suddivisi in quattro categorie:

Proteine Naturali: copiano le proteine già presenti in natura attraverso tecniche ricombinanti. Un esempio è

l’Insulina. Solitamente vanno a incrementare i livelli fisiologici della proteina che viene prodotta dall’organismo

in quantità non soddisfacenti. Il farmaco viene quindi somministrato in sostituzione del prodotto naturalmente

sintetizzato dall’organismo. Sono chiamati Farmaci biotecnologici di Tipo 1.

Modificazioni introdotte su proteine fisiologiche: le modificazioni effettuate su queste proteine donano a loro

delle proprietà specifiche. Una proteina di II tipo è modificata per avere delle caratteristiche farmacologiche

specifiche. Un esempio è l’insulina a rilascio ritardato che permette di avere una copertura più estesa. Sono

prodotti ingegnerizzati che si ottengono sempre con metodi ricombinanti.

Anticorpi Monoclonali: ampiamente discussi.

Acidi Nucleici usati come farmaci: è un capitolo particolare che viene suddiviso in base a vari approcci. Abbiamo

il DNA Decoy, gli Oligonucleotidi Antisenso (che sono composti indirizzati all’mRNA), Ribozimi, RNA ad

interferenza e gli Aptameri (equivalenti agli anticorpi monoclonali). Il problema principale, ma allo stesso tempo

il vantaggio di questi composti è che sono tutti composti che possono essere ottenuti per sintesi chimica. Siamo

quindi in grado di andare a costruire catene di acido nucleico (DNA e RNA) sinteticamente andando ad evitare

tutti i problemi derivanti dalle tecniche ricombinanti che sfruttano l’utilizzo di cellule.

I prodotti biotecnologici di I, II e III tipo sono tutti prodotti che, dal punto di vista della sintesi, dell’analisi e dell’estrazione

richiedono un lavoro e un controllo maggiore. Teniamo presente che affinchè una proteina sia attiva non è sufficiente

il fatto che la sequenza sia quella corretta ma è anche necessario che la struttura tridimensionale sia quella corretta.

Dobbiamo quindi verificare che il prodotto biotecnologico sia corrispondente alla struttura che ci interessa. Gli acidi

nucleici sono in grado di denaturarsi e rinaturarsi abbastanza facilmente e quindi non corriamo i rischi di alterazioni

irreversibili come avviene nel caso delle proteine. Abbiamo quindi dei vantaggi notevoli ovvero quello della sintesi

chimica (non sono necessarie analisi biologiche), un peso intermedio tra farmaci classici e farmaci proteici e infine il

vantaggio portato dal fatto che gli acidi nucleici possono essere facilmente denaturati e rinaturati. Usare un acido

nucleico come farmaco può comportare alcuni problemi. Il primo problema che possiamo individuare è che sono

facilmente digeriti da Nucleasi e questo aspetto, ovvero la stabilità dell’acido nucleico, è la problematica principale.

Questi farmaci, quindi, devono essere protetti dall’attacco di Esonucleasi ed Endonucleasi. Ricordiamo che le

Esonucleasi sono le nucleasi più efficaci poiché sono in grado di andare a degradare la catena dall’esterno mentre le

Endonucleasi agiscono all’interno della molecola. Le Esonucleasi rappresentano circa l’80% del totale di nucleasi

disponibili. Nel momento in cui andiamo a bloccare le estremità dell’acido nucleico, quindi, la catena riesce ad essere

più stabile. I costi, attualmente, sono assolutamente compatibili con una terapia poiché si stanno avvicinando ai costi

dei farmaci tradizionali. Siamo in grado di produrre sequenze di acido nucleico in quantità elevate e a costi modesti

(circa 10 centesimi per ogni base aggiunta). Teniamo conto che, in contemporanea, abbiamo avuto una riduzione

notevole del costo della sequenziazione del genoma. La riduzione dei costi dei due processi, quindi, consente una

valutazione della condizione del genoma dell’individuo con costi molto limitati. In questo momento ci sono molti trial

clinici in corso che si basano appunto su questi farmaci.

Nel momento in cui abbiamo una sequenza di un gene sovraespressa abbiamo la necessità di diminuire la produzione

della proteina. In altri casi, invece, abbiamo la necessità di andare a bloccare la sintesi di una proteina modificata. Queste

condizioni dipendono dal fatto che la sequenza del gene modificato viene trascritta in RNA che viene tradotto a sua

volta in proteina. Essenzialmente abbiamo un passaggio mediato dalla RNA Polimerasi (traduzione DNARNA) e un

secondo passaggio mediato dai Ribosomi (trascrizione RNAProteina). Idealmente, per quanto abbiamo visto fino ad

ora, il nostro obiettivo è quello di interagire con le proteine mutate bloccandole. Attualmente, però, l’obiettivo è

cambiato e si cerca di operare a monte bloccando o fattori di trascrizione impedendo così la trascrizione del DNA in

RNA. Se non siamo in grado di bloccare la trascrizione, che è un processo abbastanza complesso, possiamo cercare di

andare a bloccare la traduzione dell’RNA in proteina. Possiamo quindi agire sull’mRNA inibendo l’interazione con il

Ribosoma e bloccando così la produzione della proteina di interesse. Invece di lavorare sul prodotto del gene andiamo

lavorare o sulla sequenza genica oppure sulla sequenza di mRNA che deriva da esse. Nel momento in cui riusciamo a

interferire su questo processo possiamo andare a bloccare la proteina prima che venga prodotta. Il farmaco quindi,

NICOLA MORO – APPUNTI DI CHIMICA FARMACEUTICA E TOSSICOLOGICA 1 140

invece di interagire a livello del prodotto, andrà a interagire a livello del percorso che permette di ottenere il prodotto

stesso. L’altro concetto ragionevole è che, essendo l’mRNA un unico filamento, possiamo andare a sfruttare una

sequenza complementare che sia in grado di bloccarlo. Possiamo quindi interferire sulla doppia elica di DNA agendo sui

Fattori di Trascrizione impedendo che essi si leghino. Nel momento in cui i fattori di trascrizione non si legano allora non

è possibile dare origine all’mRNA poiché non si ha il reclutamento dell’RNA Polimerasi. Dall’altro lato, se non riusciamo

a interferire su questo step, possiamo immaginare di fare interagire con l’mRNA delle sequenze di acido nucleico

complementari a quel particolare mRNA e che siano in grado di bloccare la struttura dell’mRNA. È chiaro che questo

concetto può essere applicato su qualsiasi processo

patologico che preveda un problema genetico all’origine

della malattia. La potenzialità di questo metodo, quindi, è

estremamente elevata ed è applicabile su numerose

patologie. Infine abbiamo gli Aptameri che corrispondono,

in qualche modo, al farmaco che agisce sulla proteina.

L’ultimo aspetto che possiamo immaginare è che l’acido

nucleico possa andare ad agire sul prodotto proteico. Nel

momento in cui non siamo in grado di bloccare la

trascrizione e la traduzione, quindi, possiamo bloccare la

proteina analogamente ai farmaci tradizionali sfruttando

delle sequenze di acido nucleico che sono appunto

chiamate Aptameri e che sfruttano la stessa logica degli

Anticorpi Monoclonali con la differenza che gli Aptameri

derivano da una sintesi chimica e non da una biosintesi. Il

frammento dell’acido nucleico, per riconoscere in maniera

specifica una singola sequenza, deve avere una sequenza di circa 20 basi (PM = circa300 Da). Nel momento in cui

abbiamo un farmaco che lavora su un mRNA, infatti, è necessario che vada a interagire in maniera specifica sull’mRNA

di interesse e non sulle altre sequenze che invece sono fisiologiche. Dobbiamo quindi essere in grado di andare a

bloccare un processo senza che, in contemporanea, ne vengano bloccati altri. Il numero delle basi che devono comporre

la sequenza deriva da un ragionamento statistico. Supponendo che la basi siano equi -distribuite, la probabilità di trovare

una certa base in una certa posizione della sequenza dell’acido nucleico è pari al 25% (0.25). Per avere la stessa base in

duplice copia una adiacente all’a ltra la probabilità scende al 6.25% (0.25x0.25) mentre per averne tre adiacenti la

percentuale scende ancora all’1.56% (0.25x0.25x0.25) e così via. La probabilità di ottenere la sequenza voluta, quindi, è

calcolata come:


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Corso di laurea: Corso di laurea magistrale in chimica e tecnologia farmaceutiche (laurea a ciclo unico - 5 anni)
SSD:
Università: Padova - Unipd
A.A.: 2018-2019

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher Markuser di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Chimica farmaceutica e tossicologia e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Padova - Unipd o del prof Chilin Adriana.

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