Apunti di Chimica Farmaceutica e Tossicologica I Completo

ACIDO FOLICO

Un componente metabolico estremamente importante è l’acido

Folico ovvero una molecola as sunta attraverso l’alimentazione e

che partecipa a un ciclo metabolico che è detto Ciclo dei Folati. Il

Ciclo dei Folati è essenziale per il nostro organismo in quanto esso

termina con la sintesi di Pirimidine che sono anche alla base della

sintesi delle Purine. L’Acido Folico, quindi, è essenziale in maniera

più o meno diretta affinchè si possa avere una sintesi del DNA.

L’Acido Folico possiede un anello condensato detto Pteridina che

contiene quattro atomi di Azoto. Alla Pteridina è legato l’Acido p-

Aminobezoico a cui legata una molecola di Acido Glutammico. Abbiamo quindi un sistema biciclico planare, uno snodo

in corrispondenza dell’Acido p-Aminobenzoico e infine un Acido Glutammico terminale. L’Acido Folico, come detto, è

assunto attraverso la dieta e rientra nel Ciclo dei Folati che utilizza un enzima chiamato Diidrofolato Reduttasi nel primo

passaggio. L’Acido Folico viene ridotto due volte

con una reazione NADPH dipendente inizialmente

in Acido Diidrofolico e in seguito in

Tetraidrofolato che è un ulteriore forma ridotta

dell’Acido Folico. La riduzione dell’anello

Pteridinico è condotta entrambe le volte dalla

Diidrofolato Reduttasi. Il Tetraidrofolato è in

grado di ricevere un gruppo metilenico in

posizione 9 tra i due azoti. Questa reazione, che

porta alla formazione di un ponte metilenico, è

catalizzata dall’enzima Idrossimetiltranferasi. Il

5 10

prodotto della reazione è chiamato N , N -

Metilen-Tetraidrofolato. È chiaro che il gruppo

metilenico legato ai due azoti è un gruppo molto

reattivo. In virtù della sua reattività il gruppo

metilico può essere ulteriormente trasferito

attraverso l’enzima Timidilato Sintetasi alla

Deossiuridina Trifosfato rendendola Deossitimina

Monofosfato. Attraverso questo ciclo, quindi, abbiamo iniziato a costruire le prime str utture necessarie per la sintesi

dell’acido nucleico. Dalla Timidina, attraverso ulteriori processi enzimatici, è possibile arrivare ad altre basi azotate. È

chiaro che però se riusciamo a bloccare la sintesi della Timidina blocchiamo anche tutta la costru zione dell’acido nucleico

in quanto la Timidina stessa rappresenta quel “mattone” fondamentale che permette la sintesi delle altre basi. L’idea è

quella di andare a interferire con questo ciclo catalitico. Esistono infatti dei farmaci che reagiscono sia co n la Diidrofolato

Reduttasi sia con la Timidiato Sintetasi. NICOLA MORO – APPUNTI DI CHIMICA FARMACEUTICA E TOSSICOLOGICA 1

71

METOTRESSATO

La logica dello sviluppo del farmaco Metotressato è relativa al fatto che l’Acido Folico potrebbe essere organizzato in

due forme tautomeriche (Tautomeria Ammido-Imminica).

Dal punto di vista logico si è pensato di andare a congelare la struttura imminica dell’Acido Folico pensando che l’Acido

Folico si legasse in quella forma al recettore. L’idea è stata quella di generare una sostituzione Bioisostera (l’ossidrile

della forma imminica diventa un amminogruppo in modo tale da impedire la tautomeria) seguita da una metilazione

dell’azoto centrale per renderla metabolicamente più stabile in quanto l’Azoto centrale non può essere ossidato.

L’acido folico è stato quindi congelato in una struttura che, al tempo, si pensava fosse più adatta a legare la Diidrofolato

Reduttasi (DHFR) e soprattutto che la legasse con una affinità maggiore rispetto al suo substrato naturale. In seguito,

tuttavia, si dimostrò che le teorie sviluppate sul legame alla forma imminica erano errate e in particolare la forma attiva

era proprio quella Ammidica. Nonostante tutto, fortunatamente, il farmaco funziona lo stesso.

Sintesi

Per sintetizzare il Metotressato si parte da una Tetra-Amminopirimidina che reagisce con la Dibromopropionaldeide.

L’aldeide, inizialmente, forma una Base di Shiff reagendo con l’amminogruppo della Pirimidina e in seguito si avrà una

sostituzione del Bromo con un processo che favorisce la reazione intramolecolare. Abbiamo quindi la forma zione del

ciclo Pteridinico-simile in cui abbiamo il Bromo che appunto è stato sostituito dall’azoto con una successiva ossidazione

della molecola.

Dall’altro lato dobbiamo andare a costruire il legame tra l’acido p-Aminobenzoico con l’Acido Glutammico e la reazione

è analoga alle reazioni viste nella sintesi di Peptidi. Adiamo a proteggere il gruppo amminico dell’Acido p -Aminobenzoico

e vogliamo che non subisca a sua volta una reazione e quindi cerchiamo di andare a formare un alogenoderivato

dell’Acido p-Aminobenzoico con l’Azoto protetto tramite una metilazione.

NICOLA MORO – APPUNTI DI CHIMICA FARMACEUTICA E TOSSICOLOGICA 1 72

Nella reazione abbiamo indicato come X il gruppo protettore e con Y il gruppo attivante (es. alogeno). Abbiamo quindi

l’acido attivato che reagisce con l’Amminogruppo α dell’Acido Glutammico andando a formare l’Ammide. L’Ammide

verrà poi sbloccata (in funzione del sostituente si useranno condizioni blande quindi leggermente acide o leggermente

basiche) portando alla formazione di un Amminogruppo libero.

A questo punto l’Amminogruppo libero derivante dalla deprotezione può andare a reagire con il Bromoder ivato

sintetizzato precedentemente attraverso un meccanismo di sostituzione nucleofila andando a costruire la molecola

finale con uscita di Acido Bromidrico.

Interazione con l’Enzima (Diidrofolato Reduttasi)

Vediamo ora in che modo il Metotressato e l’Acido Folico vanno a interagire alla

Diidrofolato Reduttasi in modo tale da capire quali sono i determinanti strutturali di

riconoscimento del substrato. In pratica la

struttura più rilevante dal punto di vista

elettrostatico è l’Acido Carbossilico (Glu30) che si

oppone alla parte basica della Piridina del

Metotressato. L’anello Pteridinico, inoltre, risulta

essere stabilizzato da interazioni π. Se andiamo a

vedere il legame del Metotressato alla DHFR

(immagini sottostanti) possiamo osservare che

questo occupa più o meno la stessa posizione

dell’Acido Folico e quindi possiamo chiaramente

capire i motivi della competizione che c’è tra le

due strutture. La competizione, infatti, è

giustificata dalla posizione del nostro sistema.

Ancora una volta la zona acida dovuta alla

presenza dell’Acido Carbossilico derivante

dall’Acido Aspartico si oppone all’anello

Pteridinico. Se analizziamo le due immagini

possiamo notare che le due strutture, dal punto

di vista conformazionale, non sono equivalenti e

possiamo vedere che c’è un differente collegamento tra il carbossilato del sito

attivo e la struttura del Metotressato. NICOLA MORO – APPUNTI DI CHIMICA FARMACEUTICA E TOSSICOLOGICA 1

73

Nel caso dell’Acido Folico, infatti, l’interazione coinvolge l’Amminogruppo in posizione 2 e l’Azoto in posizione 3 per

andare a formare un legame a Idrogeno. Nel caso del Metotressato, invece, si ha il coinvolgimento dell’Azoto in

posizione 1 per la formazione del legame a Ponte di Idrogeno. Fondamentalmente, quindi, abbiamo una rotazione

attorno al legame, che comporta una variazione di circa 90° della posizione relativa dell’anello Pteridinico. In virtù di

questa situazione, quindi, avremo delle differenti organizzazioni dei legami idrogeno. In seguito a questa differente

organizzazione dei legami a Idrogeno avremo quindi l’inibizione del funzionamento dell’Enzima DHFR.

5-FLUORO URACILE

Un altro possibile stadio su cui possiamo andare a interferire è quello che coinvolge la Timidilato Sintetasi (TS). In questo

caso siamo a valle del processo di sintesi. In questo caso il

substrato corrisponde al N , N -Metilen-Tetraidrofolato.

5 10

Questo enzima è in grado di trasferire il gruppo metilenico

presente nel substrato all’Uridina Monofosfato attraverso

una reazione di attacco alla posizione 5 dell’Uridina. In pratica

la reazione è una processo n cui il gruppo Ti olico della TS

(Cisteina) attacca la posizione 6 della Deossiuridina portando

alla formazione di un intermedio covalente che permette di

polarizzare il doppio legame in posizione 5-6 e facendo in

modo che il gruppo metilenico venga trasferito. Al termine

della reazione la TS si stacca dal complesso e si ha la

liberazione della Timina che si è formata in seguito al processo

descritto. È un processo relativamente semplice che appunto

prevede l’intermedio covalente costituito dall’enzima e dal

Tetraidrofolato. La sostituzione dell’Idrogeno in posizione 5

con u Fluoro porta alla formazione della specie chimica

denominata Fluoro Uracile. Il Fluoro Uracile, una volta

coinvolto nella reazione, porta alla formazione di un intermedio molto stabile in cui non si

ha il trasferimento del metile alla posizione 5. Si ha quindi l’incapacità da parte della TS di

costruire la base corretta. Il processo, quindi, viene interrotto in seguito a questo substrato

che corrisponde a un substrato suicida in quanto si lega in maniera c ovalente all’enzima

stesso. Il Fluoro Uracile è il substrato degli enzimi che fosforilano e quindi può subire i

processi di fosforilazione che lo portano ad esistere in forma mono fosforilata, difosforilata

o trifosforilata. Ricordiamo inoltre che gli enzi mi che presiedono al processo di

incorporazione delle basi al DNA lavorano con i nucleotidi trifosfati. Il Fluoro Uracile è

abbastanza simile all’Uracile da poter subire la reazione di fosforilazione in maniera analoga dopo essere trasformato

in un nucleoside (Fluoro Uridina). A questo punto se il Fluoro Uracile viene fosforilato avremo che questo processo

permette anche l’incorporazione di questa base non corretta nell’Acido Nucleico in crescita. Avremo quindi un Acido

Nucleico modificato per effetto dell’incorporazione di questo nucleotide che impedisce, come detto, una ulteriore

NICOLA MORO – APPUNTI DI CHIMICA FARMACEUTICA E TOSSICOLOGICA 1 74

crescita della macromolecola e quindi, di fatto, si avrà una troncatura della sintesi della macromolecola. In pratica

abbiamo una prima fase che corrisponde alla fase di aggancio tra il Nucleoside e la catena polinucleotidica. Il passaggio

immediatamente successivo vede il Nucleotide sbagliato e, di conseguenza, la Polimerasi non riconosce più il suo

substrato e quindi non riesce ad andare a legare un’altra base alla catena in cres cita. Ricordiamo però che, come ogni

danno al DNA, possiamo avere l’intervento degli enzimi di riparazione che annullano l’effetto della reazione che, pur

esse