Appunti rielaborati di farmacologia sperimentale

Research and development

La necessità di sviluppare nuovi farmaci nasce dal bisogno di trovare una terapia per le patologie per le quali non esiste ancora una cura efficace. Tra queste, molte malattie neurodegenerative in cui la difficoltà nel trovare nuove molecole attive è dovuta spesso alla mancanza di modelli animali su cui lavorare. Lo sviluppo dei farmaci può essere diviso in due fasi: lo sviluppo esplorativo, che consiste negli studi preclinici per assicurarsi che la molecola agisca su un determinato target, e lo sviluppo confermatorio, che consiste invece nello studio clinico sull’uomo.

Poiché questi studi non vengono necessariamente eseguiti in un preciso ordine, ma accade spesso che un farmaco approdato allo studio clinico torni allo studio preclinico, è più corretto parlare di studi clinici e studi non clinici. Lo sviluppo del farmaco deve garantire la sua efficacia e sicurezza. Dal punto di vista legislativo, le tappe maggiormente regolate sono: l’approvazione per iniziare la sperimentazione sull’uomo e l’autorizzazione per l’immissione in commercio. Durante le fasi di sviluppo bisogna seguire delle linee guida tra cui le GLP: good laboratory practices che regolano gli studi preclinici, le GMP che regolano la produzione e il controllo del medicinale.

Nel tempo la ricerca dei nuovi farmaci ha subito un sostanziale cambiamento: negli anni '40-'60 la maggior parte dei farmaci è stata scoperta partendo dall’osservazione di un effetto causato da molecole naturali senza conoscere il target su cui esse agivano. La strategia che viene oggi applicata è diversa in quanto si parte generalmente dall’individuazione di un target farmacologico sul quale vengono in seguito disegnati in maniera più o meno razionale delle molecole o vengono screenate un alto numero di molecole in maniera del tutto casuale. Questo cambiamento è avvenuto intorno agli anni '80 grazie all’avvento delle tecniche della biologia molecolare.

Ricerca in silico

Un approccio ancora più moderno consiste nella ricerca in silico: grazie alla modellistica molecolare è possibile studiare le caratteristiche chimico-fisiche di una molecola ancor prima di sintetizzarla per avere informazioni riguardanti l’interazione con il target. I vantaggi della ricerca in silico sono tanti: l’eliminazione di molecole con gruppi funzionali tossici, lo studio preventivo di parametri quali la solubilità, la lipofilia, l’assorbimento, la distribuzione.

Una volta individuato il target biologico è necessario mettere a punto un saggio biologico che deve essere rapido, sensibile, riproducibile ed economico. Con il passaggio dagli studi in vitro agli studi in vivo è necessario mettere a punto uno scale-up della sintesi della molecola. Gli studi in vivo sono essenziali per gli studi tossicologici che forniscono le seguenti informazioni: la dose massima che non induce alcun effetto su organi, il rapporto tra dose terapeutica e dose tossica, la definizione degli effetti tossici in termini di reversibilità. Tra gli studi di tossicità ci sono studi di tossicità acuta, cronica, genotossicità, immunotossicità.

Le tecniche di biologia molecolare hanno permesso il passaggio dai farmaci tradizionali ai farmaci biotecnologici. Grazie alla scoperta degli enzimi di restrizione, della DNA legasi e dei plasmidi, è stato possibile trasportare geni umani in cellule procariote ed eucariote portando alla produzione di proteine ricombinanti che possono avere valore terapeutico. Tra le proteine terapeutiche più prodotte attualmente ci sono l’insulina, l’interferone, l’Etanercept. Un esempio di sviluppo farmaceutico rapido ed efficace è stato il Gleevec detto anche Imatinib, utilizzato per trattare la leucemia mieloide cronica. Il target di questo farmaco è la proteina BCR-ABL con elevata attività tirosino chinasica che causa la proliferazione delle cellule tumorali.

La ricerca del farmaco è iniziata da una linea cellulare prelevata dai pazienti che esprimeva la proteina BCR-ABL. Venne eseguito uno screening di diverse molecole, individuato un hit-compound che venne ottimizzato attraverso delle modifiche chimiche fino a giungere al Gleevec. Lo sviluppo del Gleevec fu molto rapido in quanto esso rientrava nella categoria dei farmaci orfani, ovvero un farmaco utile nel trattamento di una malattia rara. Esistono degli incentivi per le industrie che decidono di investire su farmaci orfani, tra cui l’esclusività sul mercato per 10 anni, tasse ridotte per la richiesta di autorizzazione all’immissione in commercio e tempi ridotti per l’approvazione.

L'enzima IDO come target farmacologico

IDO (Indolamina 2,3 diossigenasi) è un enzima codificato dall’omologo gene IDO1 che si trova sul cromosoma 8. L’enzima viene prodotto inizialmente come una apolipoproteina che viene attivata in seguito a trasformazioni post traduzionali. L’enzima catalizza la degradazione dell’amminoacido essenziale triptofano in chinurenina. Esistono delle proteine IDO-omologhe: la TDO a localizzazione prevalentemente epatica e IDO 2 di cui non si conosce ancora la precisa funzione e il cui gene si trova sullo stesso cromosoma del gene IDO1.

IDO è un enzima intracellulare espresso in molti organi e tessuti tra cui: polmone, cervello, placenta e milza, ma i più alti livelli di IDO sono stati rilevati nelle cellule dendritiche che sono cellule APC e nei macrofagi. L’enzima IDO è formato da un gruppo eme e due domini: large domain in cui si trova il sito catalitico e small domain caratterizzato dalle sequenze altamente conservate ITEM1 e ITEM2.

IDO ha diversi ruoli fisiologici: nella placenta induce tolleranza materna nei confronti del feto che ha il 50% degli antigeni paterni e quindi estranei al sistema immunitario della madre. È stato infatti dimostrato che nelle topine gravide in cui c’è assenza di IDO si verifica l’aborto (rigetto del feto). IDO è coinvolto inoltre nel controllo dell’infiammazione cronica e protegge dalle malattie autoimmunitarie. L’enzima può però causare anche stati patologici: può essere impiegato dalle cellule tumorali per evadere il sistema immunitario (tumore escape).

A seconda della quantità di IDO che viene espressa dalle cellule dendritiche, il fenotipo di queste cellule può essere tollerogenico quando il linfocita T naif che incontra la cellula dendritica presentante l’antigene si differenzia in linfocita T regolatorio detto anche linfocita T soppressore in quanto spegne la risposta immunitaria e diventa responsabile della tolleranza. La cellula dendritica ha invece un fenotipo immunogenico quando il linfocita T naif che viene con essa a contatto si differenzia in un linfocita T stimolatorio.

Quando IDO è attivo, i livelli di triptofano nell’ambiente extracellulare diminuiscono e ciò limita la proliferazione dei linfociti T, inoltre si ha un aumento di chinurenine che causa l’apoptosi dei linfociti stimolatori e favorisce la differenziazione dei linfociti T naif in linfociti T reg. Si ha un profilo di immunotolleranza auspicabile in situazioni quali: malattie autoimmunitarie, gravidanza e trapianto di organi. Al contrario, è necessario sopprimere l’attività di IDO in caso di tumori che potrebbero sfruttare una condizione di immunotolleranza per evadere il sistema immunitario.

Le cellule dendritiche sono cellule APC cioè cellule che processano e presentano l’antigene al linfocita T naif. Affinché si abbia l’attività linfocitaria, non è sufficiente l’interazione tra il linfocita T naif e la cellula APC ma è necessario un secondo segnale che consiste nell’interazione tra la proteina CD28 che è espressa dal linfocita T con il costimolatore B7 della cellula dendritica. Una volta attivata la risposta linfocitaria, questa deve essere fisiologicamente spenta; i linfociti che iniziano a proliferare esprimono sulla superficie della membrana la proteina CTLA4 in quantità superiori rispetto a CD28. La proteina CTLA4 spiazza i CD28 legandosi essa stessa a B7 e ponendo fine alla risposta linfocitaria. Inoltre, il legame di CTLA4 con B7 attiva IDO e perciò induce una immunotolleranza. Questo meccanismo viene sfruttato per spegnere la risposta immunitaria in patologie autoimmuni quali l’artrite reumatoide. L’Abatacebt, un farmaco biotecnologico che consiste in una proteina di fusione composta dalla regione Fc dell’immunoglobulina IgG1 e il dominio extracellulare di CTLA4.

Nel caso di una terapia antitumorale è necessario invece sopprimere l’attività di IDO presente in vari tipi di cellule tumorali. Farmaci inibitori di IDO sono stati sviluppati grazie all’esistenza di topi da laboratorio IDO1 KO, ovvero topi che non esprimono l’enzima IDO sui quali è stata valutata la selettività dei farmaci (è stato possibile capire se gli inibitori di IDO avessero altri effetti off target). Il disegno razionale di questi farmaci, la loro RAS e l’hit to lead optimization è stata resa più semplice dalla disponibilità della struttura cristallina di IDO1. È stato successivamente abbastanza semplice valutare l’effetto di tale molecole monitorando attraverso delle analisi ematiche il rapporto tra le chinurenine e il triptofano che in caso di inibizione dell’enzima IDO doveva diminuire.

Il primo inibitore di IDO1 ad essere stato sviluppato è l’enantiomero D dell’indoximab. Il farmaco testato in vivo sui topi mostrava effetti antitumorali. In associazione ad un chemioterapico, infatti, preveniva l’aumento della massa tumorale. L’indoximab venne introdotto in terapia in seguito ai trials clinici e solo a posteriori ci si rese conto che non era un inibitore di IDO in quanto l’enzima degradava solo l’amminoacido triptofano della serie L. Ad oggi ci sono 4 molecole inibitori di IDO arrivate ai trials clinici: l’epacadostat è un inibitore competitivo di IDO somministrabile oralmente e ben tollerato fino ai 2000 mg/Kg nei topi. Il Navoximod è invece un inibitore non competitivo di IDO perché si lega alla forma enzimatica in cui il Ferro è nello stato di ossidazione Fe²⁺ mentre il triptofano si lega alla forma enzimatica in cui il Ferro è nello stato di ossidazione Fe³⁺. Flexus e Teos sono farmaci più selettivi nei confronti di IDO1. È necessaria una sola somministrazione giornaliera anziché due. Teos, essendo permeabile alla membrana ematoencefalica, viene utilizzato per il trattamento di tumori cerebrali.

Esistono altre strategie di inibizione dell’enzima IDO: una delle possibili strategie sarebbe l’impiego dei SiRNA (small interfering RNA) per il silenziamento genico di IDO. Il problema principale legato all’utilizzo dei SiRNA è la veicolazione degli stessi che hanno un’elevata instabilità. In alternativa, sarebbe possibile indurre la degradazione proteasomica di IDO sfruttando le sequenze ITEM1 e ITEM2 che contengono tirosine fosforilabili. Quando le tirosine sono fosforilate, costituiscono punti di aggancio per le proteine SOCS inibitori della via jak-stat. In seguito all’associazione di IDO con le proteine SOCS viene favorita l’ubiquitinazione e la degradazione di IDO da parte del proteasoma. È stato dimostrato che somministrando a topi che avevano sviluppato un tumore la proteina di fusione CD28-Ig, i livelli di SOCS3 aumentano, i livelli di IDO si abbassano e il tumore regredisce. Il gruppo di controllo è stato trattato con la sola Ig in maniera tale da accertarsi che l’effetto antitumorale fosse dovuto a CD28.

PCR: Polymerase Chain Reaction

La PCR è una tecnica che consente di amplificare un particolare frammento di DNA a partire da un DNA stampo. I componenti essenziali per effettuare una PCR sono: il DNA stampo, una DNA polimerasi, un buffer acquoso contenente ioni Mg, i nucleotidi e i primers.

Il DNA template (= stampo) può essere a singolo o doppio filamento, può essere un DNA genomico cioè direttamente estratto dalle cellule oppure un DNA copia che è ottenuto dalla retrotrascrizione di mRNA. La differenza tra DNA genomico e DNA copia sta nel fatto che il DNA genomico è costituito sia da introni che da esoni, mentre il DNA copia contiene soltanto gli esoni.

La DNA polimerasi che viene attualmente utilizzata nelle operazioni di PCR è una Taq polimerasi scoperta in un animale acquatico in grado di resistere ad elevate temperature. La temperatura ottimale di lavoro di questo enzima è di 72°C. In passato, l’enzima che veniva impiegato nell’allungamento della catena di DNA era la DNA polimerasi 1 estratta dal batterio E.Coli. Gli svantaggi che derivavano dall’uso di questo enzima nella PCR erano due: l’enzima doveva subire un preventivo trattamento proteolitico grazie al quale si generavano due frammenti, il frammento maggiore chiamato frammento di Klenow è dotato di attività polimerasica 5’-3’ che veniva impiegato nelle operazioni di PCR, mentre il frammento più piccolo ha un’attività esonucleasica 3’-5’ (rimuove un nucleotide alla volta partendo dall’estremità libera 3’). L’altro svantaggio legato all’uso della DNA polimerasi 1 è dovuto al fatto che l’enzima è termolabile. Di conseguenza, la prima fase della PCR che prevede la denaturazione del DNA a temperature di circa 95°C doveva essere eseguita in assenza di enzima che veniva aggiunto in un secondo momento. La PCR non era dunque una tecnica automatizzata, ma richiedeva la presenza di un operatore che aggiungesse la DNA polimerasi ad ogni ciclo di PCR. Oggi, grazie all’uso della Taq polimerasi, la PCR è diventata una tecnica totalmente automatizzata: l’enzima viene aggiunto nella provetta contenente tutti gli altri reagenti all’inizio dell’operazione e rimane stabile e funzionante per circa 30 cicli.

Il buffer acquoso contenente Mg è necessario per l’attivazione della polimerasi. La concentrazione di Mg deve essere di circa 1.5 mM. A concentrazioni maggiori è possibile ottenere dei prodotti di amplificazione non specifici, a concentrazioni minori si può avere una riduzione della resa. I nucleotidi devono essere presenti nell’ambiente di reazione ad una concentrazione compresa tra i 50 e i 200 μM.

I primers sono 2: senso e antisenso e devono essere disegnati in maniera tale da essere complementari a sequenze fiancheggianti la sequenza target. La lunghezza ottimale dei primers è di 20-30 basi; la concentrazione deve essere compresa tra 0,05 e 0,5 mM. Concentrazioni più elevate favoriscono amplificazioni non specifiche. Il contenuto di AT e CG deve essere bilanciato, non devono essere presenti sequenze autocomplementari che danno luogo a strutture secondarie; le sequenze dei primer non devono essere complementari tra loro per evitare la formazione dei dimeri.

La reazione di PCR avviene in uno strumento chiamato termociclatore e si divide in 3 fasi che formano un ciclo: la prima fase è la denaturazione dei filamenti di DNA stampo che viene condotta a temperature elevate, circa 95°C, per favorire la rottura dei legami a H che si instaurano tra le basi complementari dei due filamenti della molecola. Il secondo step è detto Annealing e consiste nella formazione di legami ad H tra i filamenti di DNA stampo denaturati e i primers senso e antisenso. Questa operazione viene condotta a temperature più basse rispetto alla temperatura di denaturazione, circa 50-60°C. La temperatura di annealing dipende dalla lunghezza e dalla composizione dei primers. Maggiore è la lunghezza dei primers e maggiore è il contenuto di Citosine e guanine, maggiore sarà la temperatura di annealing in quanto l’appaiamento C-G è stabilizzato da 3 legami H anziché 2 come nel caso dell’appaiamento A-T. Il terzo step della PCR è l’elongazione che avviene a temperature di 70-75°C. Il tempo di elongazione dipende dalla lunghezza del DNA che deve essere amplificato. Nei primi cicli di PCR l’amplificazione del DNA avviene in modo esponenziale, ma dopo circa 30-40 cicli si arriva ad una fase di plateau in cui non si verifica più alcun aumento di filamenti di DNA in quanto i primers e i nucleotidi nell’ambiente di reazione iniziano a scarseggiare e la Taq polimerasi inizia a perdere di efficacia. Raggiunto il plateau, il prodotto di amplificazione viene valutato con un’elettroforesi su gel di agarosio. Le molecole di DNA, cariche negativamente a causa della presenza di gruppi fosfato, corrono sul gel di agarosio verso il catodo a velocità differente in base alla dimensione. La rivelazione delle bande di DNA viene generalmente effettuata aggiungendo al gel l’etidio bromuro, un intercalante del DNA che è fluorescente quando esposto ai raggi UV.

Real time PCR

La PCR real time viene effettuata con gli stessi reagenti e le stesse fasi della PCR tradizionale. Con la PCR real time, il prodotto di PCR viene analizzato e quantificato durante la fase esponenziale della reazione quando l’efficienza di amplificazione è influenzata minimamente dalle variabili di reazione, mentre con la PCR classica è possibile effettuare l’analisi soltanto quando la reazione ha raggiunto la fase di plateau. I vantaggi di una PCR real time sono: risultati più veloci, accurati e precisi; inoltre vengono evitate tutte le operazioni di rivelazione post PCR. Il metodo con cui si effettua la quantificazione dei prodotti di PCR si basa sulla fluorescenza rivelata da un software. Viene costruita una curva in cui si riporta la fluorescenza in funzione del numero dei cicli della PCR.