Appunti di Farmacologia cellulare e molecolare e farmacologia sperimentale

INTEGRITA’ DELLE RICERCHE

È l’aderenza al 100% a principi etici e standard essenziali: definisce le regole e i principi che devono

caratterizzare la ricerca scientifica, garantendo trasparenza, sicurezza e riproducibilità degli

esperimenti. Un dato sperimentale deve essere replicato da altri laboratori nel mondo per essere

convalidato, altrimenti ha una valenza molto limitata. I principi e le regole sono:

• Onestà: nella comunicazione dei risultati ottenuti;

• Riproducibilità del disegno sperimentale: tutti i dettagli sperimentali devono essere

riportati nell’articolo affinché altri laboratori possano riprodurre l’esperimento;

• Imparzialità e indipendenza: non deve essere influenzata da conflitti di interesse.

Importante è anche il rispetto per tutti gli esseri umani e viventi coinvolti nella ricerca. È importante

anche il rispetto per l’ambiente: l’esperimento non deve produrre sostanze chimiche tossiche che

vengano rilasciate nell’ambiente.

10 anni fa è stato dimostrato che molte pubblicazioni scientifiche non erano corrette e sono state

ritirate dagli autori. La dichiarazione di Helsinki è fondamentale, ma si limita a fissare l’etica nella

ricerca clinica e non nella ricerca di base (biochimica) e nella ricerca preclinica.

L’European Code of Conduct for Research Integrity è stato messo a punto nel 2013 e fissa i principi

e le regole elencate precedentemente. Inoltre, stabilisce l’aperta comunicazione per condividere in

modo semplice e comprensibile a un pubblico allargato le informazioni ottenute dalla ricerca

scientifica. Ciò comprende anche che i dati grezzi: devono essere correttamente confermati e

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disponibili per chi li richieda. L’ultima versione di questo codice europeo risale al 2017, ma non ha

un valore legale (è una linea guida).

La 1° legge italiana sull’integrità della ricerca risale al 1941: in un paragrafo di una legge si

condannava il plagio. Nel 2010 la legge Gelmini non contiene un codice di condotta, ma obbliga ogni

Università e organizzazione che effettua ricerca scientifica a scrivere un codice etico che fissi le

regole per l’integrità della ricerca. Nel 2011 L’UNIMI ha emanato un codice etico molto ristretto (13

articoli) in cui si occupa della ricerca scientifica solo in due articoli: uno relativo al plagio e uno

relativo al comportamento in laboratorio. Nel 2019 è stato emanato un nuovo codice etico che si

occupa di tutti i principi della ricerca scientifica: dalla progettazione alla scrittura dell’articolo. Il

codice etico fissa anche le sanzioni e i procedimenti da seguire in caso di irregolarità.

La research misconduct (ricerca scorretta) può essere intesa su diversi livelli: fabbricazione dei dati,

falsificazione dei dati oppure plagio di una ricerca. La ricerca scorretta non comprende l’errore

onesto e le differenze di opinione. Può avere conseguenze per la scienza e per la società: aggiunta

di dati sbagliati e inutili per la comunità scientifica, spreco di risorse, riduzione della fiducia

dell’opinione pubblica e diminuzione dei fondi pubblici. Le conseguenze per gli scienziati dipendono

dalla gravità della mancanza: alcuni scienziati sono stati incarcerati per frode. 55

12-COLTURE CELLULARI

Le fasi dello sviluppo di nuovi farmaci prevedono studi preclinici e studi clinici. I primi test di

screening che si eseguono per valutare l’efficacia e l’eventuale tossicità dei farmaci si effettuano su

modelli in vitro, cioè colture cellulari. I modelli in vitro però non permettono di riprodurre tutte le

caratteristiche e la cinetica in vivo di una cellula, perciò successivamente bisogna effettuare degli

studi in vivo. Quindi la 1° parte della fase preclinica viene effettuata su colture cellulari, la 2° sui

modelli animali. Durante gli studi preclinici vengono scoperte e selezionate le molecole. Dopo aver

ottenuto l’autorizzazione alla sperimentazione iniziano gli studi clinici, che comprendono:

• Fase I su volontari sani per valutare la farmacocinetica e l’eventuale tossicità;

• Fase II su un numero ridotto di pazienti;

• Fase III su un numero maggiore di pazienti.

Poi si richiede l’autorizzazione all’immissione in commercio agli enti regolatori (EMA in Europa).

Quando il farmaco entra in commercio inizia la fase IV: la fase di farmacovigilanza, in cui si valutano

gli eventuali effetti collaterali non riscontrati durante gli studi preclinici e clinici.

Durante gli studi preclinici, il numero di molecole promettenti si riduce drasticamente: su circa

10.000 molecole generalmente ne vengono mantenute 10. È importante usare i modelli corretti

nella fase preclinica per selezionare le molecole più efficaci e promettenti. Gli obiettivi della ricerca

preclinica sono: individuazione di targets per nuovi farmaci, individuazione di una molecola con

attività farmacologica verso il target, valutazione delle caratteristiche in vitro e in vivo della molecola

(stabilità e durata d’azione) e valutazione della sicurezza-tossicità. Quindi si vogliono individuare i

target che possono modificare il decorso della patologia, e le molecole che interagiscono con essi.

Nelle colture cellulari le cellule procariotiche o eucariotiche che derivano da un organismo vengono

cresciute in condizioni controllate. Nel 1878 Bernard suggerì che fosse possibile mantenere in

coltura i sistemi fisiologici di un organismo anche dopo la morte. Nel 1885 si riuscirono a mantenere

in un mezzo di coltura delle cellule embrionali di pollo e nel 1897 venne dimostrato che è possibile

mantenere in vita delle cellule isolate dal sangue e dal tessuto connettivo. Nel 1903 Jolly osservò la

divisione cellulare dei leucociti di salamandra in vitro. Nel 1907 Harrison mantenne in coltura le

cellule nervose della rana e notò l’espansione dei dendriti e degli assoni. Nel 1910 ci furono le prime

osservazioni della mitosi e della divisione cellulare. Nel 1951 venne messa in coltura la 1° linea

cellulare stabilizzata umana di origine tumorale: la linea Hela (vennero prelevate delle cellule dal

tumore epatico dalla paziente Henrietta Lacks).

Quindi nelle colture cellulari avvengono mantenimento e crescita di un tessuto o di cellule

disgregate in un ambiente artificiale al di fuori dell’organismo vivente. Si dividono in:

• Colture di organi: un frammento di organo viene mantenuto per preservare parzialmente

la struttura e le funzioni ex vivo;

• Colture organotipiche: pezzi di organo vengono messi in coltura su particolari filtri per

mantenere la struttura 3D e le connessioni tra le cellule;

• Colture di cellule dissociate: il tessuto viene dissociato per separare i diversi tipi cellulari,

che vengono utilizzati per ottenere la coltura cellulare. Ad esempio, partendo dal cervello

si dividono le cellule gliali dalle cellule neuronali.

Le fettine organotipiche di ippocampo vengono preparate con il cervello di ratti che hanno 7-10gg.

Si possono preparare fettine di ippocampo anche a partire da animali adulti (fettine acute), ma non

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è semplice mantenerle in coltura per più di un paio d’ore, quindi vengono usate per studi di

elettrofisiologia o trattamenti acuti. Procedimento: i due emisferi del cervello vengono separati e

l’ippocampo viene dissezionato; l’ippocampo viene posizionato sotto il chopper (strumento con

lametta) che taglia le fettine con lo spessore desiderato; le fettine vengono poste sotto il

microscopio e vengono selezionate quelle rimaste integre; le fettine vengono messe in coltura nel

medium adatto e poste su filtri appostiti (mantenute poi per 2-3 settimane).

Per ottenere colture di cellule dissociate si usano le cellule embrionali al giorno 18-19 di gestazione

per i ratti, e cellule che derivano da animali al giorno P0 (giorno della nascita, al massimo il giorno

dopo) per i topi. Le cellule che si trovano a uno stadio di sviluppo precoce sono quelle che si adattano

meglio alle condizioni ex vivo.

Una coltura primaria è ottenuta da un espianto o da una biopsia o da cellule del sangue.

Una sub-coltura è il trasferimento di cellule che hanno raggiunto la confluenza da una piastra a un

diverso numero di piastre. Le cellule vengono staccate dalla piastra usando tripsina (“splittare”). Il

numero di passaggi è il numero successivo di sub-coltura da una coltura primaria.

La linea cellulare comprende cellule con sopravvivenza illimitata (in condizioni appropriate)

ottenute da colture primarie trasformate, cellule del sangue trasformate, cellule tumorali...

Un clone è una popolazione di cellule che derivano da una cellula singola.

Le colture cellulari sono utili per evitare i problemi etici e morali legati alla sperimentazione animale.

Vengono usate in:

• Modelli in vitro per lo studio della biologia e della biochimica di base, delle interazioni tra

agenti patogeni e cellule, studi sull’invecchiamento e nutrizione;

• Test di tossicità;

• Ricerca sul cancro: studio delle differenze tra cellule normali e cellule tumorali,

trasformazione delle cellule normali mediante radiazioni, virus o cancerogeni, studio

degli effetti dei farmaci o di terapie antitumorali;

• Saggi di proliferazione cellulare;

• Saggi per misurare la migrazione cellulare;

• Saggi per misurare la differenziazione cellulare e la morfologia cellulare;

• Saggi metabolici: consumo di energia e funzionalità degli organelli;

• Microarray e altri test per valutare l’espressione genica;

• Tissue engineering;

• Virologia: replicazione di virus da utilizzare nella produzione di vaccini, studi per capire i

meccanismi con cui i virus infettano le cellule e si replicano al loro interno, analisi clinica,

isolamento e determinazione dei virus patogeni;

• Produzione di molecole su larga scala: la 1° applicazione è stata la produzione di sostanze

di interesse (proteine, ormoni e anticorpi monoclonali) mediante cellule ingegnerizzate;

• Rimpiazzo di tessuti o organi danneggiati;

• Diagnosi genetica, prenatale, determinazione di alterazioni cromosomiche, mutazioni.

Colture primarie

Si ottengono da cellule che discendono direttamene dal tessuto di origine. Le cellule possono essere

prelevate mediante biopsia o digestione enzimatica dei tessuti (con tripsina o papaina). Le colture

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primarie permettono di mantenere le caratteristiche delle cellule in vivo però permettono un

numero finito di cicli (quindi le cellule raggiungono la senescenza) e si ottiene una popolazione

eterogenea perché deriva direttamente dal tessuto.

Durante la crescita avviene una selezione in base al grado di proliferazione: aumentano le cellule

attivamente proliferanti e restano stazionarie le cellule in grado di sopravvivere ma non di duplicarsi,

altri tipi di cellule sono incapaci di re