Appunti presi a lezione di microbiologia

Microbiologia

Struttura e caratteristiche delle cellule procariote

Una cellula è l’unità fondamentale in cui è organizzata la materia vivente. Nella cellula procariote non si riconosce un nucleo definito. La cromatina risulta essere dispersa nel citoplasma in un complesso DNA-proteine detto nucleoide. I granuli all’interno sono i ribosomi, non si osservano organelli delimitati da membrane (anche per fattori strutturali).

Il tutto è contenuto in una membrana citoplasmatica, la quale è sormontata da uno strato (verde), la parete. A sormontare può esserci, come si vede in giallo, la capsula. Ci possono essere appendici superficiali chiamati pili o fimbrie. È facoltativa la presenza di un apparato addetto al movimento detto flagello. Il tipo di movimento degli eucarioti è simile a una frusta/remo, nel caso dei procarioti ruota.

Le dimensioni sono nettamente minori rispetto a una cellula eucariote, si tratta di 1-5 µm contro 10-100 µm.

I mitocondri sembrano essersi formati da un’evoluzione di una cellula procariote in grado di respirare → teoria endosimbiosi.

I procarioti e gli eucarioti condividono alcune proprietà fondamentali, strutturali, biochimiche e funzionali degli organismi viventi. Si basa tutto sul metabolismo, volto a mantenere una certa identità e integrità della cellula. È volto anche a riprodursi. Nell’attività di riproduzione si tende a mantenere l’identità, durante il processo c’è anche la possibilità che insorgano delle mutazioni, quindi la tendenza verso l’identità viene meno.

Nel binomio identità-riproduzione bisogna tenere conto che c’è la possibilità di mutazione. Le cellule sono in interazione con l’ambiente che risulta selezionare a favore o contro e l’insorgenza delle mutazioni insieme alla pressione ambientale genera un’evoluzione. In generale una cellula presenta attività che mantengono l’identità, che la fanno riprodurre e che la fanno evolvere.

Il metabolismo della cellula esiste dal momento che si tratta di un sistema non in equilibrio né con l’ambiente esterno né con se stesso. Per le funzioni di mantenimento ed evoluzione, le cellule sono attraversate da flussi di energia, materia e informazione.

Classificazione degli organismi

Gli organismi sono divisi in batteri e Archei. Questi organismi sono perlopiù unicellulari ma esistono procarioti che vivono in associazioni pluricellulari.

• Tradizionale: Animali e piante a capo di tutto. Le piante comprendono funghi, alghe, batteri e piante.
• Haekel: creò un nuovo gruppo dei protisti che raggruppava protozoi, funghi, alghe e batteri. Ma i batteri non avevano il nucleo, motivo che ha spinto a formare la classe procarioti e eucarioti.
• Whittaker: è stato introdotto il gruppo dei Monera dove sono stati fatti rientrare i batteri. I protisti comprendevano protozoi e alghe e i funghi avevano una classe a sé.
• Woese 1990: rivoluzione nella classificazione. Classificazione su base filogenetica molecolare. È stato creato un albero filogenetico dove si sono analizzati gli RNA ribosomiali di microorganismi viventi. Ci si è resi conto che questi organismi di fatto sono suddivisibili in Bacteria e Archea.

La classificazione moderna comprende Archea e Bacteria nei procarioti, organismi unicellulari, e gli Eukarya, pluri e unicellulari (ex. Protisti/lieviti). Questo raggruppamento ha la pretesa di essere una classificazione naturale, ovvero le differenze si basano su relazioni filogenetiche dei tre gruppi.

Ogni organismo deriva da un altro o da due organismi. Gli organismi naturali differiscono da quelli che esistevano tempo fa → evoluzione. È possibile ricostruire una filogenesi a livello molecolare. In base a questo si ricostruisce una classificazione naturale. L’unitarietà del mondo vivente fa ritenere che tutti gli organismi naturali derivino da un progenitore comune. Il progenitore comune viene chiamato LUCA (Last Universal Common Ancestor). L’albero universale si basa sugli RNA. Inizialmente si hanno due rami che partono: sx porta alla diversificazione di bacteria, dx porta a una diramazione in Archea e Eukarya.

Caratteristiche dei procarioti

Assenti nei procarioti:

• Nucleo (membrana nucleare, cromosomi, ..)
• Organelli delimitati da membrana (mitocondrio, cloroplasto..)
• Meccanismi di divisione cellulare (esiste nei procarioti la divisione binaria)

Differenze:

• Parete cellulare
• Membrana cellulare (composizione, sia tra eucarioti e procarioti, sia tra batteri e archea)
• Apparato per la replicazione del DNA
• Apparato per la trascrizione
• Apparato per la traduzione

Le differenze tra bacteria e Archea → I bacteria sono più numerosi, includono i procarioti più importanti da un punto di vista medico, non si conoscono archea patogeni. Poche specie vivono in ambienti estremi. Nessuna specie nota produce metano, una caratteristica di Archea infatti è produrre metano. Il gruppo Bacteria include le specie note che fanno fotosintesi.

Storia della microbiologia

La microbiologia è la disciplina che si occupa di microorganismi, prevalentemente unicellulari. La microbiologia si occupa anche di virus. La microbiologia ha contribuito nella storia della biologia per capire il fenomeno della vita. Si è appreso come utilizzare microrganismi a proprio vantaggio, come difendersi dai patogeni e capire i rapporti tra il mondo vivente e non vivente e gli organismi. Si collega dunque a molti ambiti.

Con cellule di E. coli è possibile dare una base alla teoria dell’evoluzione di Darwin. La microbiologia consapevole è nata dopo l’invenzione del microscopio ottico. Van Leeuwenhoek si è reso conto dell’esistenza di organismi non visibili ad occhio nudo.

Pasteur → si rende conto che le fermentazioni sono opera di microorganismi, che essi possono causare delle malattie e che possono essere utilizzati come vaccini. Teoria della generazione spontanea: si pensa che da una materia inanimata si possano generare organismi viventi. Pasteur fece un esperimento: scaldando del brodo in un’ampolla, storcendo il collo dell’ampolla, ha sterilizzato il tutto. Secondo la teoria dovrebbe generarsi qualcosa ma il liquido rimane sterile per molti anni.

Postulati di Koch

• L’agente causale deve essere presente in tutti i casi della malattia di cui è stato ritenuto responsabile, e deve essere assente in tutti gli individui sani.
• L’agente causale deve essere isolato da un individuo affetto e posto in coltura, deve dare origine a una popolazione omogenea cellulare.
• L’inoculo di una coltura pura dell’agente causale in individui sani deve dar luogo alla comparsa della malattia.
• L’agente causale può essere re-isolato dall’organismo infettato.

Soddisfatti i postulati si può assumere che l’agente è l’agente eziologico di una determinata malattia.

Dimensioni e forme dei batteri

Esistono i nanobatteri, che presentano una dimensione di circa 0.2 µm. Le dimensioni sono quindi variabili. Non tutti i batteri hanno una forma bastoncellare come la cellula prototipo ma possono essere delle sfere. Possono esistere forme diverse:

• Cocchi: forma sferica
• Bastoncelli
• Spirilli: bastoncello ritorto
• Spirochete: forma ritorta e allungata
• Prostecati: possono avere forme o bastoncellari o tondeggianti che hanno una sorta di peduncolo per l’aderenza al substrato
• Filamenti: batteri che hanno una forma filamentosa

I batteri possono trovarsi isolati o in aggregati di poche cellule. Soprattutto le forme a cocco tendono ad aggregarsi. Se si hanno due cellule divise che rimangono attaccate si parla di diplococco, nel caso di un'unione di più cellule a formare una catenella si parla di forma a streptococco. Se si dividono le cellule e rimangono unite formando una massa a 8 cellule, si parla di forma a sarcina. La formazione di una masserella di forma irregolare si tratta di stafilococco. Possono esserci aggregazioni che prendono la forma di ife, come quelle dei funghi. Possono anche trovarsi in aggregati caratterizzati da un elevato numero di cellule, come il caso dei miceli, biofilm o colonie.

Coltura batterica

Le colonie si formano per divisione di singole cellule. La massa che si forma diventa visibile ad occhio nudo. Quando si ha un’alta proliferazione le colonie vanno in confluenza e non è possibile su petri osservare i confini di ognuna. Ad ogni colonia corrisponde una cellula, è quindi facile risalire al volume che abbiamo nel nostro campione. Composizione chimica elementare dei procarioti.

Allestimento di una coltura batterica: si inocula del terreno di coltura con una colonia batterica. Dalla piastra petri si possono facilmente ricavare migliaia di cellule. Incubando in condizioni appropriate, quindi a 37° con aerazione, si osserva dopo 24h una coltura torbida per la presenza di cellule batteriche. Identiche alle cellule iniziali per forma, struttura e composizione. Seminando in piastra 1 ml di diluzione appropriata, si possono contare il numero di cellule formatasi. Prelevando un campione, attraverso diluizioni seriali, si piastra e si procede alla misurazione.

Composizione chimica dei procarioti

La diluizione che è stata effettuata sarà elemento fondamentale per il calcolo finale. Nel caso di 10^-9, si moltiplica per il fattore di diluizione, 100, per arrivare a 10 batteri per mL. Ma noi vogliamo il numero complessivo: teniamo conto del volume totale, 1 litro. Nella beuta, alla fine della crescita, si hanno 1210 cellule. Si possono raccogliere le cellule attraverso centrifugazione, si elimina il sovranatante, ovvero il terreno di coltura e si va a pesare il pellet, ovvero il sedimento di cellule. Si ottiene circa 1 g di batteri come peso umido, togliendo l’acqua si hanno dai 0,2 a 0,3 g di peso secco. Tornando al concetto di materia, 1 g di peso umido o 0,3 di peso secco di materia presente nel terreno di coltura sono state trasformate in cellule batteriche. Per descriverne la composizione chimica elementare, si procede con un’analisi chimica elementare.

Si ricercano gli elementi chimici che compongono la materia cellulare. Gli elementi chimici presenti sono: carbonio, ossigeno, azoto, idrogeno, fosforo e zolfo. Essi risultano essere costituenti integrali delle macromolecole biologiche, per questo vengono chiamati Macro elementi. Possono essere presenti anche altri elementi in forma ionica e non presenti legati covalentemente, chiamati microelementi. Essi sono potassio, calcio, magnesio, ferro, manganese, cobalto, zinco, rame, Mo, Se. La composizione chimica è molto simile a quella degli eucarioti. Ci sono alcune differenze che riguardano macromolecole che compongono la membrana di bacteria e Archea.

L’analisi elementare fornisce dettagli solo sulla presenza o meno di certi elementi, non quantitativa. Da un punto di vista quantitativo ci si aspetta un’alta concentrazione di carbonio. Il carbonio, calcolato su peso secco, è il 50%. Per la coltivazione in laboratorio dei batteri, bisogna fornire le fonti di ciascun elemento che costituisce il materiale cellulare. Il carbonio fornisce il materiale cellulare, la sua origine deriva dal composto organico e dall’anidride carbonica. Il 20% corrisponde all’ossigeno, costituente dei composti organici e dell’acqua cellulare. È un accettore di elettroni nella respirazione aerobia. La sua possibile origine o fonte sono i composti organici, l’acqua, Sali inorganici. L’idrogeno è fondamentale per la creazione del gradiente transmembrana.

Per quanto riguarda i microelementi, si osservano basse concentrazioni e la loro origine è il sale corrispondente. Funzionano da cofattore per molteplici enzimi, sono indispensabili al metabolismo. Da un punto di vista dell’analisi molecolare → il 96% del peso cellulare risulta essere costituito da macromolecole, con le proteine in cima alla scala di abbondanza, seguito da RNA, lipidi, polisaccaridi e DNA. È presente un 3% di precursori delle macromolecole. Solo l’1% è costituito da ioni inorganici.

Le proteine, la classe più abbondante, vanno a comporre l’involucro, i flagelli, i pili, il citosol, i ribosomi e associate al nucleoide. Per la formazione di macromolecole sono necessari dei monomeri, tra cui acidi grassi, zuccheri, aminoacidi e nucleotidi. Le cellule sono attraversate anche da flussi di energia. Per la sintesi dei monomeri per la formazione delle macromolecole, è necessaria la presenza di metaboliti precursori. È anche necessaria energia metabolica sotto forma di ATP e NADH. Per quanto riguarda i portatori di energia metabolica, si ha l’ingresso del fosforo.

Le fonti di carbonio sono essenziali, possono essere carbonio organico, parlando di eterotrofi, o carbonio inorganico, CO₂, quindi si tratta di autotrofi. Le fonti di energia possibili possono essere molteplici: la luce, per organismi Fototrofi, composti inorganici, prendono il nome di Chemio inorganotrofi o Chemiolitotrofi, composti organici, i chemio organotrofi. Nel mondo procariotico non si associa sempre alla luce l’autotrofia, possono esserci fototrofi che sono eterotrofi, che usano come fonte di carbonio un carbonio organico. E. coli è chemio organotrofo eterotrofo.

Membrana esterna dei batteri

Nel caso della parete dei batteri si avrà una divisione in Gram negativi e Gram positivi.

Bacteria. Analizzando l’involucro da un punto di vista dell’elettrodensità si notano delle differenze tra neisseria e bacillus. Il bacillus presenta una membrana più elettrondensa, nel caso della neisseria sembra esserci un distacco col citoplasma. Bacillus è Gram positivo.

Lo spazio tipico dei batteri Gram negativi si chiama periplasma o spazio periplasmico. Questo spazio contiene un foglietto di peptidoglicano, la mureina, la cui funzione è mantenere la forma della cellula e resistere alla pressione osmotica citoplasmatica. Lo spazio periplasmico delimita la membrana citoplasmatica, posta al di sotto, dalla membrana esterna, che contiene i lipopolisaccaridi. La presenza dei LPS discrimina le due membrane, si collocano infatti nel foglietto esterno della membrana esterna. Chiamiamo parete, nel caso dei Gram negativi, tutto quello che va dalla superficie esterna della membrana citoplasmatica fino alla superficie della cellula (strato verde nella cellula prototipo). La parete è formata dallo spazio periplasmico e dalla membrana esterna.

Nel caso dei Gram positivi, come il caso di bacillus, l’elettrondensità è dovuta a uno strato di peptidoglicano. Esso è più spesso rispetto ai gram negativi e la parete va dalla superficie esterna della membrana citoplasmatica alla superficie della cellula.

Membrana citoplasmatica

Per quanto riguarda bacteria si ha una struttura con una composizione simile a quella degli eucarioti. Un doppio strato lipidico, fosfolipidi, in cui sono presenti proteine che possono essere integrali o periferiche o associate alla membrana. Sono presenti lipoproteine con una porzione lipidica attaccata all’N-terminale. Esempi di proteine di membrana sono i canali.

Il glicerolo fosfato è l’enantiomero D, legato a due catene di acidi grassi non ramificati mediante un legame di tipo estere. A livello della zona gialla si hanno sostituenti che possono essere etanolammina, serina, etc. Per quanto riguarda gli acidi grassi, che sono esterificati, possono andare da 14 a 18 atomi di carbonio. I fosfolipidi di Bacteria sono quindi molto simili agli eucarioti. Sono disposti in un doppio strato fosfolipidico, andando a costituire una regione interna idrofobica, mentre il glicerolo fosfato forma una regione idrofilica, a contatto col citoplasma e con la porzione esterna della cellula.

Da cosa dipende la fluidità del doppio strato lipidico?

1. Dal tipo di acido grasso esterificato al glicerolo (la lunghezza e il grado di saturazione); gli acidi grassi possono essere sia saturi che insaturi, per quanto riguarda il grado di saturazione, ci si aspetta che un doppio strato ricco di acidi grassi sia più fluido per una maggioranza di insaturi. Il grado di saturazione influisce sulla fluidità della membrana.
2. Il tipo di sostituente R.
3. Dalla presenza di altri lipidi di membrana.

Nel caso degli eucarioti, il colesterolo (famiglia steroidi) è un altro lipide di membrana, che rende la membrana più rigida. In Bacteria le membrane non contengono steroidi ma molecole molto simili, che prendono il nome di opanoidi. C’è una risposta rispetto alla temperatura nel caso della fluidità, ad alte temperature aumenta la fluidità. Ma essa andrebbe mantenuta il più possibile costante. Vengono a esserci dei meccanismi che permettono di variare la lunghezza degli acidi grassi, il grado di saturazione e la quantità di opanoidi presenti.

In Archea i lipidi di membrana hanno una composizione molto particolare. In archea le catene sono isoprenoidi e sono ramificate.

1. La componente lipidica è composta da catene ramificate di isoprene.
2. La chiralità del glicerolo è ulteriore elemento di differenza, che in questo caso è l’enantiomero L.
3. La componente lipidica è legata al glicerolo attraverso un legame di tipo etere. Gli eteri tra due catene isoprenoidi e un glicerolo: di eteri oppure le catene si affrontano e formano la regione idrofobica mentre le teste stanno all’esterno. Si hanno eteri tra due catene isoprenoidi (fitanile) e un glicerolo.

Può succedere che si formino i tetra-eteri: non si forma un doppio strato fosfolipidico ma un unico strato lipidico dove si hanno due Bifitanile che uniscono due molecole di glicerolo a formare un tetraetere. Si forma una situazione con doppio foglietto di-eteri o un monostrato con tetra-eteri. Si possono formare anche delle situazioni miste come quella rappresentata nelle membrane degli Archea. Si pensa che un’organizzazione con i tetra eteri, sia un adattamento degli Archea alle alte temperature. Questo permette la vita in ambienti estremi caratterizzati da alte temperature.

La somiglianza tra eucarioti e batteri → deriva dal progenitore in comune? No, archea e Eukarya.