Appunti di microbiologia generale

Microbiologia generale

Microbiologia: è la scienza che studia i microrganismi, il loro ambiente e la loro attività. Ha per oggetto la forma, la struttura, la riproduzione, la fisiologia, il metabolismo e l'identificazione dei microrganismi. Comprende lo studio della loro distribuzione in natura, delle relazioni tra loro e con gli altri esseri viventi, degli effetti benefici e dannosi che hanno sugli esseri umani, delle modificazioni fisiche e chimiche che provocano nel loro ambiente. I microrganismi sono i batteri, i virus, i funghi, i protozoi e le alghe.

Tipi di microrganismi

Fondamentalmente ne esistono di due tipi: gli archea e gli eubatteri; alcuni aggiungono i virus giganti all'albero filogenetico. Filogeneticamente derivano da LUCA (Last Common Universal Ancestor); questo è stato costruito, come ogni albero filogenetico, confrontando le sequenze che codificano per le funzioni più comuni, i geni housekeeping come quelli per la trascrizione e la duplicazione.

I microrganismi si trovano praticamente ovunque, gli unici ambienti sterili naturali sono gli organi interni. Studieremo principalmente batteri, che sarebbero la cellula procariota. Questa differisce dalla procariota perché sono organismi con struttura cellulare semplice ed un nucleo primitivo non separato da alcuna vera membrana dal citoplasma. Ma qualunque sia la cellula che studiamo questa deve avere delle caratteristiche di base comuni:

• Capacità di ingerire o assimilare sostanze alimentari e di metabolizzarle per ricavarne energia ed accrescersi.
• Capacità di espellere prodotti di rifiuto.
• Capacità di riprodursi.
• Capacità di differenziarsi (le cellule procariote non dovrebbero essere differenziate di regola; con questo punto ci rifacciamo principalmente alla sporulazione, infatti una spora è una cellula altamente differenziata e metabolicamente ferma).
• Capacità di comunicare.
• Capacità, chiamata talvolta irritabilità o eccitabilità, di reagire ai cambiamenti che insorgono nel loro ambiente.
• Capacità di muoversi.
• Capacità di evolversi (ruolo delle mutazioni).

Importanza dei microrganismi

Ultimo concetto introduttivo è l'importanza dei microrganismi (solo pochissimi sono patogeni). Ad esempio, basti pensare ai batteri azoto-fissatori/solfobatteri o alla facilità con cui si modificano per produrre sostanze per l'utilizzo umano (es. insulina). La microbiologia è una scienza giovane che deve la sua nascita a Antony van Leeuwenhoek, colui che per primo scoprì i microrganismi grazie a un microscopio rudimentale. La teoria rudimentale della microbiologia era la teoria denominata generazione spontanea (quindi che la vita nasce spontaneamente). Questa teoria fu confutata da Pasteur grazie all'esperimento con le fiasche a collo di cigno.

Impiegò per i suoi esperimenti dei matracci a collo di cigno, che permettevano l'entrata dell'ossigeno, ma impedivano che il liquido all'interno venisse a contatto con agenti contaminanti come spore e batteri. Egli bollì il contenuto dei matracci, uccidendo così ogni forma di vita all'interno, e dimostrò che i microrganismi riapparivano solo se il collo dei matracci veniva rotto, permettendo così agli agenti contaminanti di entrare. Ulteriori passi avanti furono fatti grazie a Koch che si dedicò allo studio delle cause di molte malattie e diede origine alla microbiologia medica isolando per primo un microrganismo causa di malattia. Koch per primo ipotizzò che i microrganismi fossero causa di malattie e dai suoi esperimenti estrapolò i "Postulati di Koch".

Postulati di Koch

I postulati di Koch vengono utilizzati per determinare il legame che esiste tra una malattia ed il microrganismo che si sospetta ne sia la causa:

• L'agente causale deve essere presente in tutti i casi della malattia di cui è ritenuto responsabile e deve essere invece assente negli individui sani.
• L'agente causale deve essere isolato dall'individuo affetto e, posto in coltura, deve dare origine ad una popolazione cellulare omogenea (una sola specie).
• L'inoculo di una coltura pura dell'agente causale in individui sani deve dare luogo alla comparsa della malattia di cui si ritiene responsabile.
• L'agente causale deve essere re-isolato dall'individuo infettato sperimentalmente.

Questi postulati hanno ovviamente dei limiti:

• Esistono degli ospiti asintomatici.
• Su substrati diversi, i microrganismi possono assumere forme diverse o aggregarsi in colonie diverse.
• Abbiamo delle linee di difesa all'interno dell'organismo, quindi a seguito dell'iniezione sperimentale potremmo non avere l'infezione.
• Questo cade se non abbiamo avuto infezione nel terzo postulato.

Per questi motivi diciamo che Louis Pasteur e Robert Koch sono i padri della microbiologia.

La cellula procariota

Prima di descrivere la cellula procariota nello specifico, elenchiamo le differenze con la cellula eucariota. La principale è senza dubbio che la cellula procariota non possiede membrana intorno al nucleo; il materiale genetico, spesso un solo cromosoma circolare, è addensato in una regione, a contatto con il citoplasma e forma una struttura chiamata nucleoide. Altra differenza è che la divisione si effettua tramite scissione binaria (praticamente identica alla mitosi ma più "semplice").

Diversi gruppi di procarioti

La cellula procariota distingue due gruppi distinti: Eubacteria e Archeabacteria. La principale differenza tra i due risiede nella sequenza nell'rRNA. Concentrandoci sui batteri... Questi hanno una dimensione nell'ordine dei micrometri (o micron). Le forme sono molto varie; le più comuni sono: cocchi, bacilli, bastoncelli, coccobacilli. Quando i cocchi si dividono possono restare attaccati e formare:

• Diplococchi (2)
• Streptococchi (catenelle)
• Tetradi (divisione su 2 piani)
• Sarcine (divisione su 3 piani)
• Stafilococchi (grappoli irregolari)

Se lo fanno i bacilli, abbiamo: diplobacilli (2) o streptobacilli. Altri sono i vibrioni (a forma di virgola), spirilli o spirochete (più flessibili degli spirilli). Forme più complesse sono i batteri filamentosi che formano ife che danno origine a un micelio o i batteri peduncolati che formano un peduncolo con il quale aderiscono al substrato.

Struttura della cellula procariota

Di base le cellule procariote sono dotate di membrana e parete; queste assumono forme diverse nei batteri GRAM POSITIVI o NEGATIVI. In aggiunta, abbiamo uno strato S, la capsula o il glicocalice e appendici come pili e flagelli. L'architettura varia in base al loro gruppo di appartenenza. Questo "gruppo" è stabilito sulla base del reponso alla colorazione di Gram: Essa permette di distinguere i batteri in due gruppi, Gram positivi e Gram negativi, in base alla diversa risposta al procedimento che consiste in una colorazione con cristalvioletto (cloruro di esametil-pararosanilina) e mordenzatura con ioduro di potassio, seguite da decolorazione con etanolo. Il cristalvioletto interagisce con lo ioduro in soluzione acquosa formando un complesso insolubile che precipita nel citoplasma della cellula. I batteri che dopo il lavaggio con alcol trattengono il complesso cristalvioletto-ioduro appaiono blu-viola al microscopio e vengono detti Gram positivi. In altri batteri, invece, detti Gram negativi, i ripetuti lavaggi con etanolo rimuovono il precipitato dalle cellule che così si decolorano. Per visualizzare al microscopio i batteri Gram negativi dopo la decolorazione con etanolo si ricorre a una successiva colorazione (detta di contrasto) con safranina (o altro colorante appropriato come carbol fucsina). Questa non altera la colorazione blu dei batteri Gram positivi e colora di rosso-rosa i Gram negativi.

• Gram positivi: sono privi di membrana esterna, hanno una parete spessa e non posseggono lo spazio periplasmatico.
• Gram negativi: hanno una membrana esterna, hanno una parete sottile e posseggono lo spazio periplasmatico.

Membrana plasmatica

(Membrana interna nel caso dei Gram negativi). Delimita e separa la cellula dal resto del mondo inoltre è la sede degli scambi, sede di processi metabolici e sede di trasduzione del segnale. In generale è costituita da un doppio strato di fosfolipidi con una testa polare formata da D-glicerolo 3-fosfato e due code di acidi grassi insaturi. Si possono legare gruppi funzionali che conferiscono specifiche funzioni. La struttura è il solito mosaico fluido, quindi strutture altamente dinamiche e costantemente trasformate. All'interno abbiamo opanoidi, quindi molecole planari che rendono meno flessibile la membrana e stabilizzarne la struttura. Sono contenute anche proteine, divise in: Proteine strutturali di membrana, proteine periferiche e lipoproteine.

Membrana degli archea

Caratteristiche uniche date dalla chiralità del glicerolo, il suo legame e la catena alifatica collegata che è isoprenolo. Inoltre i lipidi degli archea possono essere dieteri di glicerolo (2 catene alifatiche) o tetraeteri di glicerolo (2 lunghe catene collegate a entrambe le estremità del glicerolo; formano quindi una membrana a singolo strato). Membrane monostrato = più rigide perché entrambe le estremità sono collegate al glicerolo.

Parete batterica

Posseduta da tutti i batteri, ci sono solo delle differenze tra gram positivi e gram negativi. È formata da un unico polipeptide di peptidoglicano (o mureina) che avvolge la cellula conferendogli rigidità protezione e le dà la forma. Il peptidoglicano è un eterodimero complesso; il monosaccaride è composto da NAG (N-acetil-glusosammina) e NAM (acido N-acetil-muramico) legato da legami β-1,4 glicosidici. Al NAM è legato un tetrapeptide (4 amminoacidi).

• Meso-diaminopimelico, acido D-glutamico, acido (DAP), D-alanina --> nei gram negativi
• L-alanina, acido D-glutamico, L-lisina, D-alanina --> nei gram positivi

Questo in realtà parte come pentapeptide, alla fine c'è una D-alanina in più. I filamenti di glicano adiacenti si legano attraverso legami transpeptidici (tra D-alanina e DAP, con conseguente rimozione di una D-alanina), il legame è definito legame crociato 3-4 diretto. In alcuni batteri, soprattutto gram positivi, il legame è mediato da ponti interpeptidici.

Biosintesi del peptidoglicano

Processo complesso diviso in tre fasi:

• Fase citoplasmatica: avviene la sintesi dei precursori. Questi sono il NAM e il NAG (amminozuccheri), entrambi sono legati all'UDP (uridin-difosfato). La biosintesi di UDP-NAG e UDP-NAM avviene grazie a due enzimi, MurA e MurB e grazie alla ligasi Mur viene aggiunto il pentapeptide al NAG. In questa fase il complesso "UDP-NAG-pentapeptide" prende il nome di nucleotide di Park.
• Fase di membrana: avviene il trasporto dal lato citoplasmatico allo spazio periplasmatico. Avviene grazie al bactoprenolo, un alcol a 55 carboni fortemente idrofobo, questo consente il ribaltamento. Quando il NAM-pentapeptide lega il bactoprenolo si forma il lipide I che diventa lipide II quando gli viene aggiunto il NAG. Dopo il ribaltamento, viene staccato il monomero e il bactoprenolo defosforilato tornerà nel lato citoplasmatico.
• Fase di parete: avviene la polimerizzazione e la transpeptidazione. La polimerizzazione avviene grazie alla transglicosilasi, che catalizza la formazione di legami glicosidici. La transpeptidazione avviene grazie a due enzimi detti transpeptidasi; grazie a questi enzimi viene idrolizzato il legame tra le due D-alanine e l'energia viene utilizzata per legare le catene con il legame crociato. La biosintesi può essere bloccata da antibiotici in tutte e tre le fasi. Bloccando la biosintesi, rendo il batterio sprovvisto di parete, quindi sarà vulnerabile e morirà. Soprattutto nella terza fase le transpeptidasi hanno una forte affinità per gli antibiotici β-lattamici (penicillina), infatti vengono chiamate "proteine che legano la penicillina" o PBP (penicillin-binding-proteins); questo avviene per la somiglianza tra penicillina e le due D-alanine.

Parete dei gram positivi

È costituita da uno spesso strato di peptidoglicano in cui sono inserite molecole come acidi teiconici, acidi teicuronici (molecole polimeriche) e proteine di superficie. Gli acidi teiconici sono polimeri a lunga catena che sporgono in superficie; consistono di catene di residui, fino a 30, di glicerolo o di ribitolo con legami fosfodiesterici e con vari sostituenti (colina, D-alanina) che determinano la specificità. Si dividono in acidi teiconici di parete e acidi lipoteiconici, questi si ancorano alla membrana plasmatica. Questa parete definisce le caratteristiche specifiche dell'involucro, controlla il movimento di ioni e regola l'adesione di proteine di parete.

Parete dei gram negativi

È una parete molto più complessa e formata da più strutture. In genere troviamo una membrana esterna, una vera e propria membrana a doppio strato lipidico e una membrana interna, tra le due si interpone il periplasma. Il periplasma è un compartimento acquoso ricco di proteine, queste acquisiscono i nutrienti, sintetizzano peptidoglicano e catabolizzano i nutrienti. La membrana esterna è costituita da uno strato di lipoporisaccaride (LPS) nel foglietto esterno e fosfolipidi in quello interno.

Il lipoporisaccaride è formato da:

• Lipide A: un dimero di N-acetil-glucosammina (NAG) e molecole di acidi grassi.
• Core: diviso in
  • Core interno: contenete 2-cheto-3-deossiottonato (Kdo) e uno zucchero a 7 atomi di carbonio (eptosio)
  • Core esterno: variabile; di solito formato da zuccheri a 6/7 carboni.
• Antigene O: molto variabile; conferisce le proprietà al LPS.

La sintesi dell'LPS è simile a quella del peptidoglicano: Il lipide A viene sintetizzato per aggiunta di acidi grassi e KDO (acido 2-keto-3-desossioctulonico) al disaccaride di glucosammina. Serve da nucleo primitivo e vettore per la costruzione del core polisaccaridico. Dopo la sintesi, il LPS viene trasferito dalla MI alla ME attraverso zone di adesione al peptidoglicano note come giunzioni di Bayer. Le funzioni dell'LPS sono diverse: è una barriera di permeabilità ovvero limita l'ingresso di molecole tossiche (antibiotici, lisozima, sali biliari, etc.). Serve per l'adesione (formazione biofilm) e stimola la risposta immunitaria attivando i macrofagi e la produzione di pirogeni. La sua azione può essere immunostimolante o tossica in funzione della dose, questo a causa della sua endotossicità (è tossico ma viene usato per costruire la membrana quindi è un'endotossina). All'interno della membrana esterna possiamo trovare anche:

• Porine che consentono il passaggio di ioni e molecole.
• Lipoproteine che stabilizzano la cellula, fungono da trasportatori e danno resistenza ad antibiotici. Una di queste è la proteina di Braun che ancora la membrana al peptidoglicano.

Batteri senza parete

Esistono ma sono molto rari in natura, i più famosi sono le clamidie; hanno una membrana molto simile a quella degli eubatteri e si comportano come parassiti intracellulari obbligati. Possiamo anche crearli in laboratorio trattando i batteri con enzimi litici o antibiotici (es. lisozima o penicillina) e mantenendoli poi in ambiente isotonico.

Strutture di superficie

Le cellule procariote possono presentare strutture esterne che circondano la superficie cellulare. Queste strutture sono importanti per la sopravvivenza della cellula.

Sostanze polimeriche extracellulari (SPE)

Sono capsula, glicocalice e slime; sono tutte e tre composte da polisaccaridi, hanno nomi diversi in base alla loro adesione con la parete cellulare.

• Capsula: struttura rigida tenacemente aderente all'involucro cellulare.
• Glicocalice: massa amorfa viscosa che circonda la cellula, facilmente rimovibile.
• Slime: materiale mucillaginoso distaccato dalla superficie cellulare.

Sono presenti sia in gram positivi che negativi ed inoltre non sono perenni, infatti un batterio capsulato può diventare acapsulato e viceversa. Sono generalmente composte da polisaccaridi, fa eccezione l'antrace che ha uno strato peptidico. Ha diverse funzioni: mediano l'adesione con l'ospite, forniscono protezione e motilità. Inoltre, nelle specie patogene sono "determinati di virulenza", soprattutto per il fatto che prevengono l'epsonizzazione (fenomeno mediante il quale gli anticorpi che avvolgono l'antigene, in genere un batterio o un virus, attivano la fagocitosi di tale patogeno) interferendo con l'attività del complemento. Questa agisce mascherando i pattern molecolari associati ai patogeni. Ma la capsula ha anche proprietà immunologiche (il sistema immunitario si è evoluto per questo), infatti, stimola la reazione degli anticorpi; questo è utilizzato per la tipizzazione dei microorganismi (tipizzazione: Procedimento immunologico per determinare gli antigeni delle cellule del sangue e di determinati tessuti). Essendo trasparenti sono stati sviluppati metodi appositi per la visualizzazione.

• Reazione di Quellung (rigonfiamento capsulare) permette di evidenziare capsule antigenicamente distinte mediante anticorpi specifici.
• Colorazione negativa: mediante contrasto negativo con inchiostro di china ed osservazione al microscopio in contrasto di fase.

Pili o fimbrie

Corte appendici proteiche simili al capello. Svolgono diverse funzioni, come: mediare l'adesione con l'epitelio dell'ospite, servono per la motilità, per la sessualità (coniugazione), per il trasporto e sono recettori per i batteriofagi (coniugazione: modalità di trasmissione di informazioni genetiche, tramite plasmidi che avviene tra due cellule. Dopo che le due cellule si sono attaccate tra loro tramite un lungo pilo viene iniziato il trasferimento di materiale genetico).