Appunti osservazione microscopica dei tessuti umani

FISSAZIONE DEI TESSUTI

Consiste nella stabilizzazione fisica e chimica dei costituenti cellulari e tissutali

 (fotografia statica della situazione che ho nel campione biologico)

Determina nel tessuto il cambiamento verso uno stato il più vicino possibile a

 quello della materia vivente, ma tale da consentire l’allestimento di preparati

microscopici

La fissazione rende insolubili i costituenti chimici della sostanza vivente



Le strutture biologiche, oggetto di studio, devono essere preservate da:

a) Alterazioni postmortali determinate dagli enzimi autolitici presenti in ogni

cellula

b) Enzimi ed agenti litici speciali di singoli organi (ad esempio l’acido cloridrico

e gli enzimi idrolitici del succo gastrico)

c) Enzimi litici esogeni, prodotti da batteri

Tipi di campioni:

Cellule

 Embrioni

 Frammenti di tessuti

 Organi con processi patologici



I metodi di fissazione sono di 2 tipi:

I. METODI FISICI: rappresentati da

Calore/essiccamento: impiegati solo in strisci di sangue ed in apposizioni di

 midollo osseo. Di regola sono seguiti da un ulteriore trattamento con metodi

chimici (post-fissazione) perché appena le cellule entrano in contatto con

l’acqua ricominciano la loro attività

Raffreddamento/congelamento: il freddo non è un agente fissativo in senso

 stretto, non garantisce una stabile conservazione delle strutture biologiche e

quando i tessuti vengono riportati a temperatura ambiente possono aver

luogo tutte le modificazioni degenerative che intervengono dopo la morte

del tessuto. Il freddo pertanto viene definito come agente conservante. È

molto usato in istochimica perché permette la conservazione del tessuto e

l’indurimento del tessuto per la sezione (dopo aver ottenuto le sezioni si

eseguono le reazioni istochimiche previste, solo successivamente si fissa il

tessuto con metodi chimici (post-fissazione). In questo caso le reazioni

istochimiche devono essere di durata relativamente breve, in genere non più

di mezz’ora per scongiurare artefatti da dislocazione o da solubilizzazione di

sostanze. Il congelamento del materiale oggetto di studio deve essere

quanto più rapido possibile. Si evita così la formazione di grossi cristalli di

ghiaccio, capaci di alterare profondamente la struttura dei tessuti. I cristalli

si formano allorché coesistono la fase liquida e quella solida, per motivi

termodinamici, è favorita la dissoluzione dei cristalli piccoli a favore

dell’accrescimento di quelli più grandi. Un congelamento rapido impedisce la

formazione di cristalli dell’acqua e la stabilizza in uno stato solido amorfo,

come il vetro (ghiaccio vetroso)

LEZIONE 2

22/03/2017

Il congelamento del materiale oggetto di studio deve essere il più rapido possibile. In

questo modo si evita la FORMAZIONE DI GROSSI CRISTALLI DI GHIACCIO, capaci di

alterare profondamente la struttura dei tessuti rompendo le membrane. Se il

congelamento è lento alcune parti vanno incontro a solidificazione mentre altre sono

ancora nella fase liquida e, quando queste due fasi coesistono, si formano i cristalli.

Per motivi termodinamici è favorita la dissoluzione dei cristalli piccoli a favore

dell’accrescimento di quelli più grandi. Un congelamento rapido impedisce la

formazione di cristalli dall’acqua e la stabilizza in uno stato solido amorfo, come il

vetro (GHIACCIO VETROSO) che non dà problemi.

METODI DI CONGELAMENTO

Per ottenere un congelamento rapido si devono trattare pezzi molto piccoli (non più

spessi di 1-3 mm) a basse temperature.

1. Negli studi più delicati, il congelamento puo’ essere ottenuto mediante:

Azoto liquido a -170°C

 Isopentano, propano



Derivati alogenati del metano e dell’etano (detti freon, che ormai non

 vengono utilizzati più a causa delle problematiche del buco dell’ozono)

2. In studi meno raffinati un congelamento sufficientemente rapido si puo’

realizzare:

Introducendo i campioni da esaminare in una CAMERA REFRIGERATA, quale

 quella di un CRIOSTATO

Spruzzandovi sopra un gas che, espandendosi, sottrae calore (freon oppure

 anidride carbonica)

CRIOSTATO

Sono apparecchi usati per sezionare tessuti congelati, costituiti da una camera

refrigerata contenente un microtomo, cioè una lama di acciaio utilizzata per ottenere

sezioni istologiche, anch’essa refrigerata. Le sezioni criostatiche hanno lo scopo di

preservare le strutture molecolari labili (come ad esempio le molecole della matrice

extracellulare, i recettori di membrana, gli enzimi ecc..) degradabili a seguito

dell’impiego di fissativi chimici per tempi lunghi e della tecnica della inclusione e per

la rapidità di esecuzione, utile nella diagnostica intraoperatoria (estemporanea).

FISSAZIONE PER CONGELAMENTO - ESSICCAMENTO (FREEZE – DRYING)

È una tecnica complessa che richiede l’impiego di apparecchiature costose. Ha il

vantaggio di non richiedere l’uso di liquidi fissativi e trova impiego per ricerche

citologiche, istochimiche e con accorgimenti particolari , in microscopia elettronica.

Differisce dal congelamento perché dopo congelamento non viene tagliato ma

essiccato e puo’ essere messo in paraffina conservandosi così per molto.

Il metodo esige:

a) Rapido prelievo del tessuto

b) Raffreddamento alla temperatura dell’azoto liquido

c) Disidratazione a una temperatura compresa fra -60°C e -30°

d) Inclusione in paraffina o carbowax e successivo taglio

Lo scopo principale di questo metodo è cercare di eliminare tutta l’acqua presente

all’interno della cellula. Il raffreddamento rappresenta il passaggio più delicato del

metodo, da esso dipende la buona conservazione dei tessuti. Durante il

raffreddamento è necessario evitare la formazione di grossolani cristalli di ghiaccio,

che provocano profonde alterazioni nelle cellule e lasciano tracce ben visibili all’analisi

microscopica. Perciò il pezzo deve essere raffreddato il più velocemente possibile (con

formazione di ghiaccio vetroso e non cristallino). Nella pratica si impiegano pezzi

piccoli (1mm) e un liquido raffreddante con conduttività alta anche alle basse

temperature, quale azoto liquido, isopentano (metilbutano).

Un recipiente chiuso ermeticamente con un’uscita collegata a una pompa rotativa che

aspirando leva l’aria dal recipiente creando il vuoto (si arriva a 10^-1 atm). Alzando la

temperatura di una decina di gradi si favorisce la sublimazione dell’acqua delle

molecole che passa allo stato gassoso che viene aspirato ulteriormente dalla pompa. Il

campione a questo punto è completamente disidratato. A questo punto il pezzo viene

incluso in paraffina o in carbowax.

Si usano anche una serie di vaschette contenenti la paraffina che, alzando la

temperatura, si fonde e il campione cade all’interno. Poiché esso non contiene più

acqua, la paraffina entra all’interno del campione.

II. METODI CHIMICI: le principali responsabili delle caratteristiche morfologiche e

funzionali della sostanza vivente sono le PROTEINE. La fissazione delle proteine

comporta la denaturazione di esse e, in grado più o meno elevato, la fissazione

di altri tipi di molecole che si trovano:

Legate chimicamente alle proteine che vengono fissate



Trattenute all’interno delle maglie del gel proteico determinato dalla

 fissazione medesima.

La denaturazione consiste nella trasformazione della disposizione spaziale

della catena polipeptidica (o delle catene, se più di una) dalla disposizione

iniziale della proteina nativa (quella presente in vivo) verso una più

disordinata. Ne consegue la modificazione delle proprietà chimiche, fisiche e

biologiche della proteina e, in particolare, una diminuzione della solubilità.

La denaturazione puo’ essere:

Reversibile: se puo’ tornare alla struttura nativa



Irreversibile: se è indotta da agenti chimici e fisici e non puo’ tornare alla

 struttura nativa

Le proteine denaturare possono andare incontro a:

FLOCCULAZIONE: coagulazione



FORMAZIONE DI UN GEL: dello stesso volume della soluzione originaria

 La fissazione di cellule e tessuti deve comunque avvenire con la minima

alterazione possibile della struttura della proteina, sia primaria sia di

ordine superiore.

REQUISITI DELLA FISSAZIONE CON METODI CHIMICI

1) PRECOCITA’: il tessuto va fissato il prima possibile dopo il prelievo

dall’organismo, se si tratta di materiale autoptico, il prima possibile

dopo il decesso dell’individuo. Più tempo passa più si rovina il

campione. Questo requisito è particolarmente significativo per

studi di microscopia elettronica. La resistenza di un tessuto alle

alterazioni post-mortali varia da tessuto a tessuto ed è in funzione

dello stato funzionale e di eventuali patologie.

2) PICCOLE DIMENSIONI DEL FRAMMENTO DA FISSARE: gli agenti

fissativi penetrano nel tessuto dalla superficie verso l’interno, i

frammenti grossi si fissano male nel loro interno.

3) IDONEO MEZZO DI FISSAZIONE: a seconda del tipo di studi che si

intendono eseguire, spesso è necessario l’impiego di metodi

fissativi differenti su frammenti dello stesso materiale biologico. Vi

sono degli standard ma se bisogna lavorare su qualcosa di mirato,

si utilizzano fissatori specifici.

4) ABBONDANZA DEL MEZZO FISSATIVO: nel caso di fissatori chimici

in soluzione.

CLASSIFICAZIONE DEI FISSATIVI CHIMICI

I fissativi si possono suddividere in:

a) FISSATIVI PRIMARI: sono quelli che assicurano da soli una

efficace conservazione delle cellule e dei tessuti, rispettando

l’architettura generale e la struttura, in quanto agiscono

sulle proteine tissutali. Si dividono in base all’effetto che i

fissativi producono su soluzioni di ovalbumina in:

Coagulanti = precipitazione grossolana di ovalbumina

o e macroscopicamente evidenti (etanolo, metanolo,

acetone, cloroformio, bicloruro di mercurio, acido

picrico, triossido di cromo, acido cromico, acido

tricloroacetico)

Non coagulanti = precipitazione fine e non

o macroscopicamente evidenti (formaldeide,

gluteraldeide, acroleina, tetrossido di osmio,

bicromato di potassio, permanganato di potassio,

dietilpirocarbonato, parabenzochinone, acido acetico)

Questa classificazione è del tutto empirica e non si

riferisce all’effetto dei fissativi sui tessuti (la fissazione

di un tessuto biologico comporta sempre un grado

variabile di coagulazione, cioè una insolubilizzazione

irreversibile delle proteine tissutali)

MECCANISMI DI REAZIONE DEI FISSATIVI PRIMARI

I principali effetti dei fissativi chimici primari sulla

sostanza vivente:

1) MODIFI