Appunti osservazione microscopica dei tessuti umani

Lezione 115/03/2017

Esame a fresco

Per ottenere informazioni su un tessuto bisogna utilizzare l'esame a fresco e la tecnica delle fette. Si dice a fresco perché visualizza cellule viventi senza ulteriori meccanismi. Si vedono frammenti di tessuti, microrganismi e richiedono l'utilizzo del microscopio a contrasto di fase: un microscopio che non differisce da quello ottico ma si basa sul fenomeno dell’interferenza luminosa senza che il campione venga colorato. Il preparato viene illuminato da un fascio luminoso in realtà suddiviso al livello del condensatore in due porzioni di fase differenziate e con diverso angolo di incidenza. La porzione di luce che attraversa il campione cambia ulteriormente la fase e si va a ricombinare con la luce non rifratta. Rende così visibili componenti trasparenti ma di indice di rifrazione differente da quello del mezzo.

• La maggior parte dei componenti cellulari è trasparente alla luce visibile a causa dell’elevata presenza di acqua.
• Le radiazioni luminose una volta oltrepassate una componente o un organello cellulare subiscono dei cambiamenti di fase che dipendono sia dallo spessore, sia dal diverso indice di rifrazione della struttura oltrepassata.
• Il microscopio a contrasto di fase determina tali cambiamenti e li converte in differenza di densità così da ottenere delle informazioni circa la composizione di cellule e tessuti analizzati.
• Tramite la microscopia a contrasto di fase si evita l’utilizzo di coloranti e fissativi che spesso comportano notevoli alterazioni strutturali ottenendo così dei dati molto più reali di quella che è l’organizzazione cellulare.

L’esame a fresco richiede l’utilizzo della dissociazione di cellule e tessuti attraverso l’utilizzo di:

• Metodi meccanici: mediante aghi, pestaggio o centrifugazione (dipende dal tipo di organo).
• Metodi chimici: alcune strutture fibrose si isolano più facilmente per dissociazione se il tessuto è stato previamente sottoposto a macerazione con sostanze chimiche che, nella maggior parte dei casi, provocano alterazioni profonde a livello cellulare:

• Acqua bollente
• Alcool al terzo di Ranvier (alcol a 95°C acqua distillata, 1:2)
• Soda e potassa caustica al 30%
• Acidi forti (acido nitrico e acido cloridrico al 30% e acido solforico concentrato)
• Acido picrico (soluzione satura acquosa)
• Enzimi (tripsina, pepsina, papaina, jalorunidasi)

Si ottengono così frammenti per l’esame a fresco che verranno osservati con microscopio a contrasto di fase perché queste cellule non hanno contrasto e non vedrei i costituenti della cellula.

Preparazione del campione

Il campione va mantenuto in un mezzo che conserva la trama strutturale. A questo scopo si aggiungono soluzioni indifferenti, isotoniche rispetto al contenuto. Si distinguono in:

• Liquidi naturali:
• Succo dei tessuti: garantisce il mantenimento delle cellule
• Umor acqueo: liquido nella camera dell’occhio
• Liquido amniotico: presente nel sacco amniotico e viene perso nel momento del parto
• Albume dell’uovo filtrati
• Siero di sangue: si preleva il sangue, si fa coagulare e si centrifuga. La parte liquida sopra è il siero.
• Soluzioni saline:
• Soluzione fisiologica NaCl 0,9% in H₂O distillata
• Soluzione di Ringer
• Soluzione di Locke
• Soluzione di Tyrode

Tecniche di esame

• Vetrino porta-oggetto + vetrino copri-oggetto con eventuale lutaggio
• Vetrino porta-oggetto standard 76x26 mm
• Vetrino porta-oggetto standard 18x18 mm con spessore di 0,14-0,17 mm
• Il lutaggio è necessario se l’osservazione è prolungata. Con un pennellino si stratifica una sostanza, che sigilla l’intercapedine all’interno della quale abbiamo le cellule, ai bordi del copri-oggetto. In questo modo non entra aria, si impedisce l’evaporazione e l’ingresso di sostanze estranee.
• Camera umida: usata se sono frammenti di cellule e consiste in un anello che si fa aderire attorno al campione, poi si copre con il copri-oggetto. L’intercapedine che si forma è la camera umida perché si forma umidità e si prolunga la vitalità delle cellule (si utilizzano cere o smalto che solidificano).
• Vetrini a goccia pendente: simili alla camera umida. Ci sono porta-oggetto che al centro hanno una cavità; viene posta una goccia di soluzione nel copri-oggetto e si capovolge sopra il porta-oggetto.

Colorazioni vitali

Sono sostanze tossiche che spesso derivano dal catrame. Vengono utilizzate per evidenziare determinate cellule o per aumentare il contrasto di fase. Si usano per:

• Evidenziare cellule con attività granulopessiche (fenomeno per cui una cellula che ha ingerito per fagocitosi un colorante vitale, che non la uccide, può poi essere facilmente individuata al microscopio).
• Evidenziare strutture del citoplasma cellulare, come mitocondri e vacuoli.
• Colorare in toto embrione in via di sviluppo: si colorano alcune cose e altre no (su tutto l’organismo o l’organo).
• Per mettere in evidenza proprietà delle membrane biologiche (permeabilità, assorbimento, trasporto oppure la capacità delle membrane di far passare il colorante).

Possono essere utilizzate nell’organismo vivente o su cellule o tessuti prelevati dal vivente ed ancora dotati di funzioni vitali. Si classificano in base alla reazione che danno:

• Acidi: blu pirrolo, rosso congo, inchiostro di china…
• Basici: blu di metilene, blu di toluidina, bruno di bismark…
• Indifferenti: rosso neutro

Tecnica delle fette

Bisogna rendere sezionabile il tessuto, quindi deve diventare solido. Si congela il preparato che sarà anche importante per la conservazione, oppure si fa diventare solido attraverso inclusione in un mezzo che solidifichi e diventa un blocco. I mezzi di inclusione sono le resine e la paraffina. Però è necessario che dopo prelievo del campione, questo si mantenga integro preservandolo dalla degradazione attraverso fissazione, in modo che siano rispettate le condizioni nel vivente.

Fissazione dei tessuti

Consiste nella stabilizzazione fisica e chimica dei costituenti cellulari e tissutali (fotografia statica della situazione che ho nel campione biologico). Determina nel tessuto il cambiamento verso uno stato il più vicino possibile a quello della materia vivente, ma tale da consentire l’allestimento di preparati microscopici. La fissazione rende insolubili i costituenti chimici della sostanza vivente. Le strutture biologiche, oggetto di studio, devono essere preservate da:

1. Alterazioni postmortali determinate dagli enzimi autolitici presenti in ogni cellula.
2. Enzimi ed agenti litici speciali di singoli organi (ad esempio l'acido cloridrico e gli enzimi idrolitici del succo gastrico).
3. Enzimi litici esogeni, prodotti da batteri.

Tipi di campioni:

• Cellule
• Embrioni
• Frammenti di tessuti
• Organi con processi patologici

I metodi di fissazione sono di 2 tipi:

1. Metodi fisici: rappresentati da:
• Calore/essiccamento: impiegati solo in strisci di sangue ed in apposizioni di midollo osseo. Di regola sono seguiti da un ulteriore trattamento con metodi chimici (post-fissazione) perché appena le cellule entrano in contatto con l’acqua ricominciano la loro attività.
• Raffreddamento/congelamento: il freddo non è un agente fissativo in senso stretto, non garantisce una stabile conservazione delle strutture biologiche e quando i tessuti vengono riportati a temperatura ambiente possono aver luogo tutte le modificazioni degenerative che intervengono dopo la morte del tessuto. Il freddo pertanto viene definito come agente conservante. È molto usato in istochimica perché permette la conservazione del tessuto e l’indurimento del tessuto per la sezione (dopo aver ottenuto le sezioni si eseguono le reazioni istochimiche previste, solo successivamente si fanno ulteriori analisi).