Appunti Istologia

Istologia

Istologia: descrive la morfologia/struttura delle cellule e come esse si organizzano a formare diversi tessuti. Ogni organo contiene sempre tessuto connettivo e almeno un altro tessuto.

Storia

• 1520: Primi studi poco accurati.
• 1665: Hooke usa il termine cellula riferendosi ai comparti separati da parete in una fettina di sughero osservata al microscopio.
• 1770: Bichat: dissezione e descrizione a occhio nudo di 21 tessuti primitivi (in realtà sono 4).
• 1810: Koelliker: tutte le cellule derivano dalla cellula uovo.
• 1830: Schwann e Schleiden elaborano la prima teoria cellulare: la cellula è l'unità fondamentale, non ulteriormente scomponibile.
• Alcune concezioni errate: Schleiden → riproduzione cellulare dovuta ad una sorta di "gravidanza" della cellula; Schwann → cellule originate da pezzetti di tessuto nel liquido intercellulare.
• 1859: Virchow: "Ogni cellula deriva da un’altra cellula".
• 1950: Ultrastruttura dei tessuti grazie al microscopio elettronico.

Cellule

La cellula è l'unità morfologica e funzionale fondamentale degli organismi viventi. La struttura di una cellula influenza l'organizzazione delle stesse nel tessuto e la funzione del tessuto stesso.

Forma e dimensioni

Virus e fagi si misurano in nm (10^-9), i batteri sono grandi all'incirca 1μm (10^-6), gli eritrociti hanno un diametro di 8μm. Ruffini: "la forma è l'espressione plastica della funzione" → ogni struttura biologica ha la forma più adatta per svolgere la propria funzione. Le cellule possono possedere delle forme diverse in caso di alterazioni patologiche (trasformazione neoplastica). La forma della cellula può variare (senza che vi sia un'alterazione patologica) in funzione:

• Dell'ambiente
• Del tempo
• Della funzione
• Del differenziamento

Legge di Driesch

Il volume delle cellule è:

• Costante per ciascun tipo cellulare nell'ambito della stessa specie o di specie affini (diverso → alterazione patologica).
• Indipendente dalle dimensioni dell'organismo: la diversa dimensione degli organismi è dovuta al numero di cellule presenti e non al diverso volume delle cellule → organismi grandi non sono costituiti da cellule grandi.

La legge di Levi costituisce un’eccezione: le dimensioni di alcune cellule sono tanto più grandi quanto più grossa è la taglia dell’organismo in cui si trovano e vale per cellule nervose, cellule muscolari, fibre del cristallino.

Cellule multinucleate

Binucleate: cellule dell’epitelio delle vie urinarie, alcune cellule del fegato, cardiomiociti. Polinucleate: cellule che presentano molti nuclei in un unico citoplasma e derivano da un unico elemento differenziato. Possono formarsi in due modi:

• Sincizio: fibre muscolari striate scheletriche e osteoclasti. Si formano dalla fusione di elementi simili.
• Plasmodio: si forma a partire da un elemento singolo che si divide per mitosi, senza che avvenga la citocinesi (es. megacariocito).

Osservazione dei preparati cito-istologici

Posso osservare:

• Colture di cellule o tessuti viventi, incubate a 37°C e 5% CO₂: osservo forma, migrazione e proliferazione di cellule vive.
• Preparati fissati e colorati uccidendo le cellule, ma mantenendo la struttura del tessuto in modo da poterne studiare la forma, l’organizzazione e la struttura.

Problematiche:

1. I tessuti vanno incontro ad alterazioni della struttura e a processi degradativi → il tessuto deve essere preservato.
2. La luce (ottico) ed il fascio di elettroni (elettronico) possono attraversare solo sezioni di spessore molto ridotto → il tessuto deve essere sezionato in fettine sottili mediante microtomi (5μm, ottico) ed ultramicrotomi (70nm, elettronico).
3. I tessuti sono molli prima del taglio → il tessuto deve essere indurito attraverso:
• Mezzo di inclusione solido a temperatura ambiente come la paraffina sciolta a 60°C in cui viene immerso il tessuto disidratato, oppure resina nel caso della microscopia elettronica.
• Congelamento
4. I tessuti sono incolori e privi di contrasto, prima dell’osservazione il tessuto deve essere colorato o contrastato con coloranti con affinità diverse per i componenti cellulari e tissutali possono essere combinati nella stessa sezione istologica.

Procedimento

Fissazione: il campione viene “ucciso”, preservando la sua integrità morfologica.

1. Fisica:
   • Alta temperatura
   • Striscio: nel caso del sangue
   • Congelamento con azoto liquido (ottengo sia fissazione che indurimento)
   Chimica: immergendo il campione in vapori o soluzioni di reagenti come formaldeide e glutaraldeide.
2. Poiché la fissazione avviene in ambiente acquoso, prima dell’inclusione con paraffina idrofobica, il tessuto va disidratato: l’acqua contenuta nel tessuto viene prima sostituita con scale crescenti di alcol 70%, 90%, 100%. Segue la chiarificazione, ossia l’immersione in un solvente del mezzo di inclusione (xilene, acetone) e l’infiltrazione, immersione nel mezzo di inclusione in forma liquida.
3. Inclusione: in paraffina o in resine sintetiche, conferisce la consistenza per essere sottoposto al sezionamento.
4. Taglio: mediante microtomi o ultramicrotomi, se ho fissato il campione per congelamento utilizzo un criostato (-20°C) che lo mantiene congelato durante il taglio.
5. Colorazione: le diverse strutture vengono impregnate con sostanze coloranti in grado di assorbire radiazioni di lunghezza d’onda specifica. Per fare ciò, il vetrino contenente il tessuto impregnato di paraffina solida deve essere reidratato. I coloranti sono di solito in soluzione acquosa, quindi le sezioni devono essere sparaffinate in xilolo e reidratate con scala decrescente di alcool (100%, 90%, 80%, 70%, 50%, H₂O), sui campioni reidratati si procede alla colorazione.
6. Copro il campione con un vetrino coprioggetto: per incollarlo sopra va usato un montante (colla idrofobica), per cui devo di nuovo disidratare, aggiungerne una goccia, appoggiare il vetrino e lasciar asciugare. Nel caso del sangue: su un vetrino striscio la goccia di colla, sull’altro il sangue e fisso con metanolo.

Coloranti per microscopia ottica

I tessuti assumono i coloranti in base alle caratteristiche delle strutture che li compongono:

• Coloranti acidi: si fissano nel citoplasma e nelle fibre collagene → acidofili (+).
• Coloranti basici: colorano la sostanza fondamentale della cartilagine, la cromatina, i proteoglicani e il RER → basofili (-).

Alcuni dei metodi di colorazione usati, come la tricromica di Mallory, si basano sulla combinazione di più coloranti.

• Ematossilina-eosina: la prima colora di blu i basofili, la seconda colora gli acidofili di rosa o rosso.
• Impregnazione argentica: sali d’argento + sostanza riducente → liberazione di Ag metallico che si deposita sulle strutture biologiche argentofile, come le fibre reticolari del tessuto connettivo.
• PAS: colora glicogeno, mucine, mucoproteine, glicoproteine.
• Rosso sirius: colora le fibre del collagene.
• Tetrossido di osmio: ossida i grassi del tessuto e forma una sostanza nera o marrone scuro.

Microscopio

Il microscopio serve per osservare oggetti piccoli (cellule, tessuti, sezioni istologiche) e ad aumentare il potere di risoluzione. La risoluzione è la possibilità di vedere distintamente 2 punti piccoli e vicini. L’occhio umano ha potere di risoluzione di circa 0,2 mm (200μm), il microscopio ottico di circa 0,2μm (200 nm) e il microscopio elettronico di circa 0,0002 μm (0,2 nm). Si utilizzano microscopi diversi in base alle dimensioni dell’oggetto da osservare. Il microscopio ottico viene utilizzato per osservare cellule, batteri e nuclei, quello elettronico per osservare mitocondri, virus e ribosomi. Il potere di risoluzione viene calcolato grazie alla formula di Abbe: R=λ / 2n sin α. Dove:

• λ è la lunghezza d’onda della sorgente luminosa.
• n è l’indice di rifrazione del mezzo tra vetrino e obiettivo (nel caso del vuoto è pari a 1).
• α è la metà dell’angolo di apertura dell’obiettivo.

Per aumentare il potere di risoluzione si può aggiungere una goccia di olio da immersione. Le osservazioni con microscopio ottico avvengono in campo chiaro, ovvero si osservano preparati colorati. Si possono compiere osservazioni in contrasto di fase, ovvero si utilizzano campioni non colorati e per identificare i vari componenti si sfrutta il diverso indice di rifrazione dei componenti, questa osservazione viene effettuata col microscopio rovesciato che permette di osservare anche fiasche e petri (c'è più spazio) → cellule vive. Tutte le osservazioni avvengono in 2D, ogni oggetto può essere sezionato in maniera trasversale o longitudinale, il risultato che si osserva dipende da dove è passato il piano di sezionamento.

Microscopio elettronico

TEM (microscopio a trasmissione)

Un fascio di e- viene generato nel cannone, vengono spinti verso il basso passando tra lenti elettromagnetiche fino al campione (all’interno del microscopio si crea il vuoto).

• Gli elettroni passano attraverso il campione.
• Si devono usare “coloranti” elettrondensi.
• Gli elettroni emessi dal filamento e accelerati dalla ddp tra anodo e catodo sostituiscono i raggi luminosi.

Il campione è posto su una griglia di rame, devono essere sezioni molto piccole (50-70 nm), per tagliare infatti si utilizzano ultramicrotomi con lama in vetro in diamante. Le immagini osservate sono in bianco e nero.

SEM (microscopio a scansione)

Questo microscopio permette di ottenere immagini in 3D, la differenza consiste nel fatto che il fascio di e- raggiunge il preparato ma non lo attraversa, gli e- infatti vengono diffusi e catturati da un rivelatore che fornisce un’immagine in 3D, sempre in bianco e nero.

Microscopio confocale

Questo microscopio funziona in fluorescenza, si usa un laser al posto di una fonte luminosa, si possono vedere diversi livelli di uno stesso campione e ha un elevato potere risolutivo.

Microscopia ottica a fluorescenza

Si marca con fluorocromi l’oggetto di interesse, i fluorocromi hanno diverse proprietà:

• Molecole che, eccitate da una radiazione luminosa, in parte la assorbono, ed in parte la restituiscono ad energia minore e lunghezza d’onda maggiore.
• La lunghezza d’onda di eccitazione e quella di emissione sono specifiche per ogni fluorocromo.

Si possono osservare le radiazioni emesse. I fluorocromi hanno una vita limitata, emettono un segnale solo per poco tempo e in seguito decadono. Il sistema di rilevazione rende visibile il colore dove gli anticorpi si sono legati (es: sviluppa un segnale fluorescente) → colorazioni immunoistochimiche.

Tessuti

Le cellule e la matrice extracellulare si organizzano in tessuti, che soddisfano molteplici e complesse esigenze dell’organismo. In base alle caratteristiche morfologiche, funzionali, e alla derivazione embrionale si definiscono 4 tessuti fondamentali:

• Tessuto epiteliale:
  • Coprono superfici esposte
  • Delimitano dotti e cavità interne
  • Producono secreti ghiandolari
• Tessuto connettivo:
  • Riempiono gli spazi interni
  • Offrono un supporto strutturale
  • Conservano energia
• Tessuto muscolare:
  • Si contrae per produrre un movimento
  • Mantiene la postura attivo
  • Mantiene la temperatura corporea
• Tessuto nervoso:
  • Conduce impulsi elettrici
  • Trasporta informazioni

Tessuto epiteliale

Il tessuto epiteliale è costituito da cellule poste a mutuo contatto con scarsa MEC. Gli epiteli non sono vascolarizzati e poggiano su tessuti connettivi (vascolarizzati) detti lamina propria, le sostanze arrivano all’epitelio per diffusione. L’area della superficie di contatto tra l’epitelio e la lamina propria è accresciuta da papille: piccole evaginazioni della superficie del tessuto connettivo. Gli epiteli si differenziano in:

• Epiteli di rivestimento: cellule strettamente ravvicinate a formare una lamina.
• Epiteli ghiandolari o secernenti: cellule strettamente ravvicinate formanti aggregati con varia morfologia.

Esistono epiteli particolari:

• Epitelio sensoriale: intervengono nella risposta a stimolazioni esterne (es. orecchio interno).
• Cellule mioepiteliali: possiedono la capacità di contrarsi.
• Adamantoblasti o ameloblasti: produzione di tessuto mineralizzato (es. smalto dei denti, le cellule sono presenti solo durante l’odontogenesi).

I tessuti epiteliali possono quindi essere di rivestimento, ghiandolari o specializzati. Ci sono regioni con caratteristiche biochimiche, morfologiche e funzionali diverse. Le caratteristiche citologiche e strutturali particolari sono in accordo con le funzioni svolte:

• Citoscheletro: è costituito da microtubuli, microfilamenti (actina) e filamenti intermedi (cheratina). Sotto la membrana plasmatica è presente l’actina corticale (un fascio di actina). A livello della porzione apicale è invece presente il terminal web, microvilli e filamenti di actina, sono a contatto col terminal web. I filamenti intermedi determinano la forma della cellula, si posizionano in corrispondenza delle giunzioni per rafforzarle.
• Polarità delle cellule: le porzioni sono diverse morfologicamente e biochimicamente.
• Specializzazioni sulla membrana citoplasmatica della superficie libera, laterale e basale della cellula.

Specializzazioni apicali

Microvilli

Sono immobili estroflessioni digitiformi del citoplasma, aumentano la superficie di scambio. Al loro interno contengono fasci di actina, che si inseriscono sui microfilamenti del terminal web corticale alla base dei microvilli. Possono essere risolti al microscopio elettronico (1-2 μm). Sono abbondanti nelle cellule dei tessuti assorbenti come nell’epitelio intestinale, dove insieme al glicocalice formano l’orletto a spazzola dell'epitelio cilindrico intestinale. Il glicocalice è composto da glicoproteine e glicosaminoglicani.

Ciglia

Sono estroflessioni apicali coperte da membrana con capacità di movimento, piegandosi determinano il flusso del materiale sopra di loro (si muovono in modo sincrono nella stessa direzione). Sono visibili al microscopio ottico (5-10μm). Nelle vie respiratorie permettono la continua pulizia mescolando pulviscolo con muco lo spostano verso la cavità orale. Nelle tube permettono il trasporto dell’ovulo fecondato nell’utero. Si impiantano nella cellula nel corpuscolo basale, formato da nove triplette microtubuli, la radichetta è la parte profondamente ancorata. Sono formate da un assonema, che è composto da due microtubuli centrali (completi, cioè formati da 13 filamenti) e nove coppie di microtubuli periferici, dove il tubulo A è completo, mentre quello B è appoggiato ad A per completarsi. Le coppie sono collegate tra loro dalla nexina, mentre la dineina è agganciata ad A di una coppia e B della successiva e permette il movimento, questo consente la curvatura dell’assonema, esistono patologie associate all’alterazione della dineina.

Stereociglia

Sono estroflessioni digitiformi della membrana apicale, modificano il fluido in cui sono immerse, contengono fasci di microfilamenti e proteine leganti l’actina. Si tratta di filamenti citoscheletrici di actina, possono essere considerati dei villi di maggiori dimensioni (stereovilli) e più ramificati, sono grandi circa 100 μm. Nell’epididimo partecipano ai processi secretivi per la maturazione degli spermatozoi, nell’orecchio interno hanno la funzione di meccanorecettori.

Specializzazioni baso-laterali

Labirinto basale

Sono introflessioni della membrana basale, nel citoplasma sono presenti molti mitocondri, aumenta la superficie di scambio.

Giunzioni

Le giunzioni possono essere:

• Occludenti
• Ancoranti: ancorano senza sigillare
  • Aderenti
  • Desmosomi
• Comunicanti
• Emidesmosomi

Tutte le giunzioni hanno un piano strutturale comune: due proteine transmembrana interagiscono tra loro spazio extracellulare, mentre nel citosol sono ancorate al citoscheletro (se fosse assente le giunzioni potrebbero rompersi e di conseguenza le cellule potrebbero staccarsi). Il complesso di giunzione è formato in ordine da:

• Giunzioni occludenti
• Giunzioni aderenti
• Desmosomi

Giunzioni occludenti

Le proteine transmembrana sigillano lo spazio tra due cellule adiacenti (fusione puntiforme), circondano la cellula in maniera perimetrale. Al microscopio appaiono come una serie di occhielli tra cellule adiacenti. Occludina e claudina sono le proteine di adesione transmembrana in grado di legare proteine citoplasmatiche (ZO1, ZO2, ZO3) e citoscheletriche. Hanno una duplice funzione di cancello e di barriera: le proteine sulla superficie apicale non possono mischiarsi con le proteine di quella laterale e viceversa (la giunzione impedisce il passaggio) e il materiale non può passare tra le due cellule e andare verso l’esterno.

Giunzioni ancoranti

Uniscono tra loro due cellule adiacenti, ma senza sigillare. Comprendono le giunzioni aderenti, i desmosomi e gli emidesmosomi. Le giunzioni aderenti contengono caderine (e), proteine transmembrana collegate tramite un’altra proteina al citoscheletro (di actina). I desmosomi sono analoghi alle giunzioni aderenti, ma non sono perimetrali, le proteine sono le desmocolline e le desmogleine, il citoscheletro è formato da cheratina (filamenti intermedi), sono le più forti (abbondanti nell’epidermide). Gli emidesmosomi ancorano la cellula alla membrana basale, l’ancoraggio è mediato dall’integrina.

Giunzioni comunicanti

Sono formate dai connessoni (formati da sei connessine), che formano emicanali, quando due cellule mettono in comunicazione i connessoni si crea un canale che permette il passaggio di materiali molto piccoli.

Membrana basale

La membrana basale è un particolare tipo di matrice extracellulare con specifica organizzazione, posta al limite fra cellule dei vari tessuti e la matrice extracellulare del connettivo con cui le cellule entrano in contatto. Si osserva in epiteli di rivestimento, ghiandolari, endoteli, cellule muscolari, adipose e gliali. È composta da tre strati:

• Lamina rara o lucida: si trova a contatto con la membrana plasmatica delle cellule epiteliali.