Appunti microbiologia industriale

MICROBIOLOGIA

INDUSTRIALE 1

CM

EVOLUZIONE SCIENTIFICA (CAPITOLO 1)

Le biotecnologie hanno origini antichissime: nel settore alimentare sono sempre avvenute elaborazioni

spontanee di materi prime alimentari da parte di microrganismi ambientali. Esempi: Fermentazione del succo

d'uva, produzione di aceto, tipi di latte fermentato (yogurt e Kefyr), produzione di formaggi, fermentazione

di ortaggi (crauti)…

Nel tempo siamo stati in grado di identificare i responsabili dei processi fermentativi che avvenivano

spontaneamente. Le conoscenze acquisite hanno convertito le biotecnologie classiche da tecnologie sfruttate

passivamente a sistemi di trasformazione pilotati e controllati.

Infatti nella seconda metà del XVII secolo con l’invenzione del microscopio è nata la possibilità di riconoscere

i microrganismi; le biotecnologie si sono sempre evolute. La moderna microbiologia industriale deriva

dall’applicazione di agenti microbici selezionati per specifiche esigenze di processo.

PRINCIPALI TAPPE BIOTECNOLOGICHE:



4000 a.C. Lievitazione del pane e produzione del vino

 (egiziani), Produzione di birra e formaggi (Egiziani, Sumeri e

Babilonesi), Produzione di aceto da bevande fermentate

(Egiziani Assiri e Babilonesi)



1663 Prima osservazione microscopica e nascita del

 termine cellula (R. Hooke)



1781 Produzione di lievito per panificazione (Dutch

 process, Olanda)



1881 Produzione di acido lattico

 

1185-90 Sviluppo dei primi vaccini (colera, difterite e

 tetano) 

1928-29 Scoperta della penicillina (A. Fleming) | Antibiotico: molecola in grado di uccidere uno o più

 microrganismi.



1953 Prima descrizione della struttura del DNA (J. Watson e F. Crick)

 

1972-1973 Nascita della tecnologia del DNA ricombinante (S. Cohen e H. Boyer)



Le biotecnologie microbiche trovano applicazione nella Microbiologia Industriale.

La biotecnologia è l’applicazione deliberata e controllata di agenti biologici semplici,

quali cellule microbiche, vegetali, animali, vive o morte, o componenti cellulari, in

operazioni tecnologiche utili, al fine di produrre sia BENI che SERVIZI.

Inoltre la biotecnologia: in senso stretto è considerata un’attività relativa alla biologia

molecolare, mentre in senso lato è associata alle operazioni di biologia applicata a diversi

settori (non solo molecolare).

È largamente impiegata nella Produzione Industriale di BENI. I beni sono oggetti materiali

acquistabili sul mercato, e tra questi troviamo:

biomasse microbiche per nutrizione animale e umana;

 commodities chimiche (acido citrico, acido glutammico, alcuni aminoacidi);

 specialità (antibiotici, vitamine);

 probiotici (microrganismi colonizzanti l’intestino) e vaccini;

 starters, enzimi (agenti chiave della moderna tecnologia alimentare);

 inoculanti del suolo (azoto fissatori) e delle piante (lotta biologica).



Abbiamo anche detto che la biotecnologia fornisce SERVIZI, tra i quali:

trattamento di rifiuti liquidi e solidi: ad esempio la depurazione delle acque di scarico o la

 potabilizzazione (purificazione) dell’acqua;

valorizzazione di residui agro - industriali: i microrganismi ci aiutano a rendere riutilizzabili i materiali

 industriali di scarto; 2

CM

diagnostica mirata (anticorpi monoclonali) e terapia mirata (anticorpi monoclonali come carriers di

 farmaci).

Tra le varie discipline scientifiche e tecnologiche (microbiologia, biochimica, genetica, ingegneria meccanica,

chimica, finanza…) esistono una serie di connessioni che ci permettono di mettere a punto un processo

biotecnologico. Quest’ultimo consiste in 4 fasi:

1. riconoscimento dei microrganismi

2. studio del substrato sul quale è in grado di agire il microrganismo

3. studio delle reazioni che avvengono durante l’azione del microrganismo

4. utilizzo delle tecnologie adatte

FERMENTAZIONE

Dal punto di vista storico la fermentazione era definita come un processo microbico di trasformazione di

zucchero in etanolo e anidride carbonica. Dal 1945 invece è stata scoperta e studita, e quindi definita, in

senso lato, come un processo che utilizza un microrganismo (indipendentemente dalle condizioni, sia in

aerobiosi sia in anaerobiosi). In senso stretto invece le vere fermentazioni sono quelle che avvengo in assenza

di ossigeno, ovvero in condizioni anaerobie, e tra queste distinguiamo: la fermentazione lattica, propionica,

butirrica…

PROCESSO BIOTECNOLOGICO

Il processo biotecnologico è un processo in cui, ad un substrato (S) vengono aggiunte delle cellule microbiche

(X) che crescono e tramite una fermentazione producono: cellule (lieviti da pane), metaboliti primari (ac.

lattico), metaboliti secondari (antibiotici), enzimi (lattasi) e/o prodotti di biotrasformazione, ovvero il

prodotto (P). 

S + X P

X: le cellule microbiche

Le fermentazioni tradizionali vengono allestite (e in alcuni casi lo sono tuttora) impiegando una popolazione

mista presente nelle materie prime o in ambienti particolari (ad. es. alimenti fermentati e bevande alcoliche).

Nello sviluppo di processi su larga scala invece vengono impiegate colture pure ovvero costituite da singoli

ceppi ottenuti con una procedura di isolamento a partire da habitat naturale.

Nell’ ingegneria genetica vengono fatti anche processi che prevedono l’impiego di microrganismi ricombinati,

ovvero microrganismi ai quali è stato iniettato del DNA diverso dal loro.

In ambito alimentare si utilizzano solo microrganismi GRAS (Generally Recognized As Safe), cioè sicuri, che

hanno nel loro albero genealogico solo microrganismi che non producono tossine e non patogeni.

Si trovano nelle collezioni ufficiali cioè Istituzioni che rappresentano un punto di riferimento ed hanno il

compito di mantenere i ceppi esistenti, raccoglierne di nuovi e distribuire su richiesta i ceppi puri (possono

anche fungere da riferimento - ceppi type).

I microrganismi si possono raccogliere anche in natura ma non è un metodo sicuro e affidabile.

S: il substrato

Il substrato, o terreno di coltura, svolge un ruolo fondamentale nello sviluppo di un

processo fermentativo per questo motivo i suoi componenti vengono selezionati in

base alle esigenze del microrganismo e in base all’economicità (utilizzando

possibilmente scarti di altre attività come i residui agro-alimentari industriali o surplus

agricoli, in ogni caso si parla di materie grezze).

I fattori da considerare nella scelta del substrato sono:

Costo e disponibilità

 Facilità di trasporto e stoccaggio (conservazione)

 Sterilità: deve essere sterile per assicurarsi che in coltura non siano presenti microrganismi diversi da

 quelli che andrò a inoculare 3

CM

Deve essere ininfluente nei riflessi delle variabili di fermentazione (aerazione, agitazione e controllo

 della schiuma)

Deve assicurare alte rese di conversione e fermentazione

 Minima formazione di prodotti secondari

 Assenza di problemi di tipo igienico-sanitario (tossicità) o di sicurezza (infiammabilità, esplosività)



P: il prodotto

Costituisce ciò che viene prodotto durante il processo fermentativo.

Lo sviluppo di un processo fermentativo dipende dalle conoscenze scientifiche, associate alle richieste del

mercato.

L’ economicità è influenzata dalla resa associata alla procedura di isolamento e purificazione, in relazione al

valore del prodotto.

Abbiamo detto prima che il prodotto può essere di diversi tipi:

Metaboliti primari: vengono prodotti sempre e sono ESSENZIALI allo sviluppo del microrganismo, per

 la vita e la riproduzione della cellula microbica. Esempi: acido lattico.

Sono metaboliti di degradazione isolabili, finali o intermedi del metabolismo energetico che vengono

espulsi dalla cellula.

Metaboliti secondari: vengono prodotti ella fase finale di crescita esponenziale del microrganismo,

 spesso per un cambiamento delle condizioni ambientali e si accumulano in fase avanzata dello

sviluppo; NON sono ESSENZIALI per lo sviluppo e la riproduzione della cellula. Esempio: Penicillina.

Possono avere ruolo metabolico definito o non rilevabile; spesso si formano per modificazione di

metaboliti primari o intermedi. Infine possono essere anche antinutrizionali, immunosoppressivi

(attività di abbassamento delle difese immunitarie), anticolesterolo (statine: importanti in ambito

alimentare).

I PRODOTTI DELLA MICROBIOLOGIA INDUSTRIALE IN DETTAGLIO

Otteniamo prodotti considerabili come biomasse microbiche. Le biomasse microbiche possono essere

classificate secondo vari aspetti…

In funzione del contenuto le biomasse hanno un impiego:

Integrale - tra le quali abbiamo:

  i funghi superiori commestibili

 le biomasse per dietetica

 le alghe

 le biomasse proteiche per mangimistica

Per estrazione – ed alcuni esempi sono:

  I lisati di lieviti

 Gli estratti proteico-vitaminici

 I lipidi

 Gli enzimi

 RNA e derivati

In funzione della loro attività vengono invece classificati nel seguente modo:

Substrati o ambienti complessi – come:

  Il lievito per panificazione

 starters

 fermenti lattici

 colture azotofissatrici

 colture insetticide

 vaccini

 colture per fanghi attivi

Molecole particolari: le biomasse impiegabili in biotrasformazioni.

 4

CM

Metaboliti primari

Sono metaboliti di degradazione isolabili: prodotti finali o intermedi del metabolismo energetico

(fermentativo od ossidativo) che vengono riversati nel terreno colturale, ove si accumulano e da cui vengono

estratti. Derivano dalla degradazione del substrato fonte di carbonio ed energia (ad es. un carboidrato)

presente in elevata concentrazione.

Esempi: acidi organici (lattico, butirrico, propionico, acetico, citrico, fumarico...), amminoacidi e loro

intermedi (acido glutammico, lisina...), alcoli (etanolo), polialcoli (glicerolo, mannitolo...), carboidrati,

vitamine, nucleotidi ed acidi nucleici, lipidi, proteine...

Metaboliti secondari

Costituiscono una classe conosciuta anche come prodotti di biosintesi.

Possono avere un ruolo metabolico definito (o comunque individuabile) anche se talvolta il ruolo è

secondario o non precisabile.

Esistono punti di interconnessione tra metabolismo primario e secondario.

I metaboliti secondari vengono generalmente prodotti a partire dai metaboliti primari o loro intermedi, che

fungono quindi da precursori.

I metaboliti di particolare importanza nell’ambito della microbiologia industriale sono stati oggetto di

sviluppo di numerosi processi su larga scala.

Prodotti complessi 5

CM

Sono associabili al settore alimentare. Sono prodotti non isolabili perché costituiti dall’insieme del substrato

trasformato contenente gli stessi microrganismi responsabili della modificazione. Es: Nello yogurt non è

possibile isolare i batteri lattici aggiunti al latte per ottenere lo yogurt stesso.

Esempi di prodotti complessi ottenibili per intervento microbico:

Preparazioni alimentari: bevande alcoliche, aceto, tipi di latte fermentato, prodotti caseari, cibi

 orientali fermentati;

Conservazioni alimentari: vegetali fermentati (crauti, olive...), foraggi insilati, stagionatura di carni

 insaccate;

Lavorazioni diverse: macerazione di fibre tessili (canapa, lino, juta), trattamento di rifiuti liquidi e

 solidi

Prodotti da DNA ricombinante

Viene inserito nella cellula una sequenza di aa, il microrganismo li riconosce e diventa così codificatore per

un maggior numero di proteine. Sono di difficile classificazione in relazione all’ eterogeneità.

Esempi: Microrganismo Prodotto

Bacillus subtilis Riboflavina

Escherichia coli Insulina, ormone della crescita,

interferone, vaccini

Bacillus licheniformis a-Amilasi

Kluyveromyces marxianus

var. lactis (lievito nel latte) Chimosina

Saccharomyces cerevisiae Insulina, vaccini (epatite B)

Aspergillus oryzae Lipasi

LE DIVERSE FORME DI RESA (CAPITOLO 4)

IMPO PER ESAME: SAPERE LA DIFFERENZA FRA LE DUE FORME DI RESA

RESA DI CONVERSIONE (Y)

Y= Prodotto formato (g) / Substrato consumato (g) = 0>Y>1

Quanto più elevato è il valore della resa di conversione, tanto è maggiore è la quota di substrato convertito

in prodotto. 

Più Y è un numero che si avvicina a 1 gran parte del substrato consumato è stato convertito in prodotto

 buona resa di conversione.



Più Y tende a 0 bassa resa di conversione.

È un numero adimensionale.

RESA DI FERMENTAZIONE

Esprime quanti grammi g di prodotto (espresso in peso secco) si ottengono da ogni litro di coltura (coltura

liquida = brodocoltura).

Resa di Fermentazione = g/L (HA L’UNITÀ DI MISURA!!)

RESE RELATIVE ALLE DIVERSE CLASSI DI PRODOTTI

BIOMASSE MICROBICHE

RESA DI CONVERSIONE (Y):

 Per substrati carboidratici la resa Y è dell’ordine di 0,5: si forma circa metà prodotto (in g) rispetto ai

grammi di substrato consumati. Il restante 0,5 delle sostanze viene utilizzato per altre funzioni. 6

CM

Per substrati in stato ridotto (ad esempio le n-paraffine che hanno la catena lineare: CH3-CH2-

CH2-…-CH3 ), Y può raggiungere il valore 1.

RESA DI FERMENTZIONE:

 È variabile: 20 g/L > R.F. > 40 g/L.

Può raggiungere un massimo di 60 g/L per il processo industriale di produzione di lievito per

panificazione (Saccharomyces cerevisae).

PRODOTTI COMPLESSI

Sono prodotti in gran parte appartenenti al settore alimentare.

La resa di conversione Y e la resa di fermentazione non sono generalmente determinabili perché sono noti i

g di substrato consumato ma non è possibile definire i g di prodotto.

COMPOSIZIONE DEI TERRENI COLTURALI (CAPITOLO 4)

Il terreno colturale deve fornire al microrganismo tutte le sostanze nutritive necessarie alla crescita, alla

produzione di energia e alla biosintesi dei metaboliti desiderati. SONO PER IL 90% LIQUIde: sono composti d

qualcosa disciolto in acqua.

Il terreno colturale deve contenere tutti i nutriliti opportuni, che sono: fonti di carbonio, fonti di azoto, sali

inorganici, vitamine o altri fattori di crescita ed eventuali precursori.

I terreni colturali possono essere suddivisi in: DOMANDA D’ESAME: TIPI DI TERRENI e DIFFERENZE FRA SINTETICI E COMPLESSI

Terreni sintetici

  costituiti da materie prime chimicamente pure, quindi costosi

 impiegati generalmente a livello di laboratorio

 di più facile standardizzazione qualitativa e quantitativa

 in genere forniscono crescita microbica e produzione di metaboliti limitate (minori)

Terreni complessi

  contenenti materie prime grezze

 utilizzati su larga scala

 limitata standardizzazione qualitativa e quantitativa

 più economici rispetto a quelli sintetici

 in genere forniscono crescita microbica e produzione di metaboliti elevate

(maggiori).

PRINCIPALI DIFFERENZE TRA TERRENI SINTETICI E TERRENI COMPLESSI

I terreni sintetici sono costituiti da componenti puri e noti, per questo sono costosi e utilizzati su piccola scala,

in laboratorio (pochi litri); sono di facile standardizzazione e praticamente sempre riproducibili (vengono



formulati facilmente come fare una torta seguendo una ricetta). Le rese però sono basse.

I terreni complessi invece sono costituiti da componenti grezzi (es: melasso come fonte di C) e quindi molto

meno costosi. Di conseguenza vengono utilizzati su larga scala, nelle aziende, per produrre prodotti nell’

ordine dei metri cubi. Un ‘altro aspetto positivo è che essendo naturali, di composizione leggermente

variabile, oltre che a contenere la fonte di C, ad esempio, contengono anche vitamine e altri precursori; le

vitamine sono molto costose, infatti questo è un super vantaggio dal punto di vista economico (che non

abbiamo nei terreni sintetici). Purtroppo sono di difficile standardizzazione, di difficile purificazione, la

formazione di schiume è maggiore (a differenza dei sintetici) e non sempre si riesce a riprodurre lo stesso

terreno identico (infatti per renderlo più uniforme si miscelano i vari lotti di substrato). Al contrario le rese

sono più elevate.

Fattori da considerare nella messa a punto di un terreno colturale per un processo industriale

Considerazioni legate al metabolismo microbico:

 1. La resa di conversione Prodotto/Substrato deve essere massima

2. La resa di fermentazione (g/L) deve essere massima

3. La velocità di formazione del prodotto deve essere massima e quindi il tempo deve essere il

più basso possibile 7

CM

4. La formazione di prodotti secondari indesiderati deve essere, ovviamente, minima

Deve esserci la possibilità di avere un rifornimento costante nel tempo delle materie prime

 Si devono tenere in considerazione gli eventuali inconvenienti tecnologici legati alle materie prime

 (aerazione, agitazione – schiuma; estrazione e purificazione prodotto…)

I costi devono essere più contenuti possibile (l’economicità è fondamentale)

 FONTI DI CARBONIO

Le fonti di carbonio possono essere classificate secondo diversi criteri.

Il primo metodo si basa sull’ origine e quindi sulla rinnovabilità delle fonti, esistono:



Fonti rinnovabili (di origine naturale) La CO2 è la più semplice, rinnovabile e disponibile fonte di

 carbonio; 

Fonti non rinnovabili (di origine petrolchimica) Alcoli a corta catena (alcani) che provengono dalla

 lavorazione del petrolio o del gas naturale

Il secondo è il più utilizzato e si basa sulla loro natura chimica, troviamo fonti carboidratiche e fonti non

carboidratiche.

Fonti carboidratiche: a loro volta si dividono in:

 In forma pura: vengono usate fonti più o meno complesse. Tra i

 monosaccaridi che sono i più semplici usiamo prevalentemente glucosio

(sotto forma di sciroppo proveniente da idrolizzati di amido), tra i disaccaridi

ci sono il sa