Appunti di Microbiologia Industriale

Scienze e Tecnologie Alimentari - UniMi

Appunti di lezioni di:

Microbiologia

Industriale

MICROBIOLOGIA INDUSTRIALE 01

MICROBIOLOGIA INDUSTRIALE - lezione 01

Le BIOTECNOLOGIE CLASSICHE hanno radici antichissime. I latti fermentati hanno tradizioni

lunghissime. Il settore alimentare è uno dei campi di applicazione più vasto e più remoto.

Elaborazione spontanea di materie prime alimentari da parte di microrganismi ambientali.

Fermentazione del succo d'uva, produzione di aceto, tipi di latte fermentato (yogurt e Kefyr),

produzione di formaggi, fermentazione di ortaggi (crauti)

La microbiologia è più recente e nasce con l’invenzione del microscopio.

Identificazione dei responsabili dei processi (→ microbiologia)

Le conoscenze acquisite hanno convertito le biotecnologie classiche da tecnologie sfruttate

passivamente a sistemi di trasformazione pilotati e controllati.

La moderna MICROBIOLOGIA INDUSTRIALE deriva dall'applicazione di agenti microbici

selezionati per specifiche esigenze di processo.

L’evoluzione dello stiudio dei microrganismi

- Egizi (4000 a.C.): primi esperimenti sulla lievitazione

- Produzione di lievito da pane (1781): prodotto che derivava dall’industria della birra. Ma

contenendo luppolo, dava un gustro amaro al pane. perciò si sono scelte un gruppo di cellule

specifiche per il pane.

- Produzione di acido lattico (1881): acidulante. Viene venduto acido lattico da microrganismi.

- Scoperta della penicillina (Fleming, 1928-29): Fleming studiò gli streptococchi tramite una

piastra che presentava una muffa. Attorno alla muffa nota che non è presente neanche una

colonia di streptococco. (Penicillium). Nascita antibiotico.

Molti MO patogeni hanno sviluppato dei meccanismi di resistenza verso antibiotici che già

conosciamo. quindi si ha uno sfruttamento di MO su larga scala.

- Nascita tecnologia DNA Ricombinante (1972-73): Cohen - Boyer e Rosalind Franklin

BIOTECNOLOGIA

Biotecnologie Microbiche —> trovano applicazione nella microbiologia Industriale

Biotecnologia in senso stretto: attività relativa alla biologia molecolare.

Biotecnologia in senso lato: Operazioni di Biologia applicata a diversi settori.

La Biotecnologia si configura come: l’applicazione deliberata e controllata di agenti biologici

semplici cellule microbiche, vegetali, animali, vive o morte, o componenti cellulari in operazioni

tecnologiche utili, per la produzione sia di BENI che di SERVIZI.

BENI:

- biomasse microbiche per nutrizione animale e umana

- commodities chimiche (acido citrico, acido glutammico, alcuni aminoacidi)

- specialità (antibiotici, vitamine) (ES: integratori)

- starters, enzimi (agenti chiave della moderna tecnologia alimentare) (ES: per produzione di

latti fermentati - detergenti biodegradabili.)

- probiotici e vaccini (MO che se ingerito è in grado di arrivare fino all’intestino per colonizzare

l’intestino e ristabilire la flora batterica o comunque svolgere funzione di equilibrio e

benessere dell’uomo.)

- inoculanti del suolo (azoto fissatori) e delle piante (lotta biologica)

SERVIZI:

- trattamento di rifiuti liquidi e solidi (inquinanti delle falde acquifere - depurazione delle acque

per ridurre le concentrazioni di inquinanti) 1

MICROBIOLOGIA INDUSTRIALE 01

- valorizzazione di residui agro - industriali (il settore agricolo ha degli scarti che possono

essere arrivare a 50% di ciò che raccolgono. Si cerca quindi di valorizzarli con dei

microrganismi che riescono a sviluppare metano dai residui agro-alimentare.)

- diagnostica mirata (anticorpi monoclonali) e terapia mirata (anticorpi monoclonali come

carriers di farmaci) . ()ES: composti con attività anti-tumorale)

Connessioni tra discipline scientifiche e tecnologiche nella messa a punto di un processo

biotecnologico.

FERMENTAZIONE

Definizione storica: Processo microbico di trasformazione di zucchero in etanolo e anidride

carbonica

Definizione in senso stretto: Vere fermentazioni (anaerobie) - lattica, propionica, butirrica ….

Definizione in senso lato: Processo che utilizza un microrganismo (indipendentemente dalle

condizioni, sia in aerobiosi sia in anaerobiosi)

Fermentazioni tradizionali: Processi di produzione di lievito da pane, birra e vino (bevande

alcoliche in generale), aceto, prodotti del settore lattiero-caseario

Fermentazioni moderne: Sviluppate dal 1945. con bioreattore controllato e uso consapevole di

MO.

EQUAZIONE IN FORMA SEMPLIFICATA DI UN PROCESSO BIOTECNOLOGICO

cellule - metaboliti primari -

metaboliti secondari - enzimi -

prodotti di biotrasformazione

ingegneria di processo

S + X ————> P

Substrato Cellule microbiche Fermentazione prodotto

+ recupero

Microrganismo

Fermentazioni tradizionali

Allestite (e in alcuni casi lo sono tuttora) impiegando una popolazione mista presente nelle

materie prime o in ambienti particolari (ad. es. alimenti fermentati e bevande alcoliche)

Sviluppo di processi su larga scala

Impiego di colture pure a seguito dell’individuazione e isolamento dei responsabili dei processi

microbiologici (circa 120 anni fa)

Ceppi ottenuti con una procedure di isolamento a partire da habitat naturale

Ingegneria genetica

Messa a punto processi che prevedono l’impiego di microrganismi ricombinanti

Microrganismi GRAS

Ceppi Generally Recognized As Safe (FDA) ad es. per l’ottenimento di prodotti ad uso

alimentare)

Collezioni ufficiali

Istituzioni che costituiscono un punto di riferimento. Fonti di microrganismi di interesse passato,

presente e futuro Compito istituzionale: mantenere i ceppi esistenti raccoglierne dei nuovi

distribuire su richiesta colture pure (possono anche fungere da riferimento – ceppi type). 2

MICROBIOLOGIA INDUSTRIALE 01

Substrato

Scelta. Ruolo fondamentale nello sviluppo di un processo fermentativo in funzione del tipo del

microrganismo e del prodotto

Economicità. Dall’accoppiata microrganismo-substrato dipende l’economicità dell’intero

processo . Il costo può essere anche normato dalla scelta che si attua nelle scelte alimentari.

Forma grezza. I substrati impiegati su larga scala sono materie prime grezze, costituite da residui

agro-industriali o surplus agricoli.

Fattori da considerare nella scelta del substrato:

Costo e disponibilità - Facilità di trasporto e stoccaggio (conservazione di prodotti che magari

non sono sempre disponibili ES: frutta non di stagione) - Sterilizzabile (fonzamentale per

eliminare tutti i MO presenti in un terreno colturale) - Ininfluente nei riflessi delle variabili di

fermentazione (aerazione, agitazione e controllo della schiuma) - Ottenimento di alte rese di

conversione e fermentazione - Minima formazione di prodotti secondari - Assenza di problemi

di tipo igienico-sanitario (tossicità) o di sicurezza (infiammabile, esplosivo).

Prodotto

Produzione. Lo sviluppo di un processo fermentativo dipende dalle conoscenze scientifiche,

associate alle richieste del mercato

Economicità. Influenzata dalla resa associata alla procedura di isolamento e purificazione, in

relazione al valore del prodotto.

Ruolo dei singoli metaboliti nei confronti della cellula

Metaboliti primari. Essenziali per la vita e la riproduzione della cellula

Metaboliti secondari. Non essenziali per lo sviluppo e la riproduzione della cellula 3

MICROBIOLOGIA INDUSTRIALE 02

MICROBIOLOGIA INDUSTRIALE - lezione 02

I prodotti

- Del metabolismo primario: Essenziali per la vita e la riproduzione della cellula. Il MO li

sviluppa in fase di crescita.

- Del metabolismo secondario: Non essenziali per lo sviluppo e la riproduzione della cellula. Il

MO li sviluppa in fase stazionaria.

Biomasse microbiche

In funzione del contenuto

Impiego integrale funghi superiori commestibili

• biomasse per dietetica

• alghe

• biomasse proteiche per mangimistica

•

Impiego per estrazione lisati di lieviti

• estratti proteico-vitaminici

• lipidi

• enzimi

• RNA e derivati

•

in caso di biomassa, si scarica il fermentatore quando si è in fase crescente (prima della fase

stazionaria.)

In funzione dell’attività

Substrati o ambienti complessi lievito per panificazione

• starters

• fermenti lattici

• colture azotofissatrici

• colture insetticide

• vaccini

• colture per fanghi attivi

•

Molecole particolari biomasse impiegabili in biotrasformazioni

•

Metaboliti primari

ES: alcoli (etanolo) polialcoli (glicerolo, mannitolo ....) carboidrati vitamine nucleotidi ed

• • • • •

acidi nucleici lipidi proteine acidi organici (lattico, butirrico, propionico, acetico, citrico,

• • •

fumarico .....) amminoacidi e loro intermedi (acido glutammico, lisina ....)

•

- Metaboliti di degradazione isolabili, prodotti finali o intermedi del metabolismo

energetico (fermentativo od ossidativo)

- Riversati nel terreno colturale, ove si accumulano e da cui vengono estratti

- Derivano dalla degradazione del substrato fonte di carbonio ed energia (ad es. un

carboidrato) presente in elevata concentrazione.

Metaboliti secondari

- Classe conosciuta anche come prodotti di biosintesi

- Possono avere un ruolo metabolico definito (o comunque individuabile) Talvolta il ruolo è

secondario o non precisabile

- Esistono punti di interconnessione tra metabolismo primario e secondario 1

MICROBIOLOGIA INDUSTRIALE 02

—> I metaboliti secondari vengono generalmente prodotti a partire dai metaboliti primari o loro

intermedi, che fungono quindi da precursori

- Metaboliti di particolare importanza nell’ambito della microbiologia industriale

- Sono stati oggetto di sviluppo di numerosi processi su larga scala

Prodotti complessi

Entrano in larga misura nel settore alimentare

=

Prodotti non isolabili costituiti dall’insieme del substrato trasformato contenente gli stessi

microrganismi responsabili della modificazione.

ES: Preparazioni alimentari (bevande alcoliche • aceto • tipi di latte fermentato • prodotti caseari

• cibi orientali fermentati) - Conservazioni alimentari (• vegetali fermentati (crauti, olive ....)

• foraggi insilati • stagionatura di carni insaccate) - Lavorazioni diverse (• macerazione di fibre

tessili (canapa, lino, juta) • trattamento di rifiuti liquidi e solidi)

Prodotti da DNA ricombinante

Di difficile classificazione in relazione alla eterogeneità

ES: generi di batteri - funghi unicellulari (lieviti) - funghi filamentosi (muffe e funghi a carpoforo)

- alghe 2

MICROBIOLOGIA INDUSTRIALE 03

MICROBIOLOGIA INDUSTRIALE - lezione 03

!!!!!

Resa di conversione (Y) = Quanto più elevato è il valore della resa di conversione, tanto

maggiore è la quota di substrato convertito in prodotto.

È un numero adimensionale che va da 0 a 1.

Questo indica l’efficienza

Y = prodotto formato [g] / substrato consumato [g]

Per le Biomasse Microbiche

Min ( = 0) —> prodotto formato = 0

max ( = 1) —> prodotto formato = substrato consumato. Substrati in stato ridotto (ad es.

n-paraffine) può raggiungere il valore 1.

Solitamente Y è circa 0.5 per le biomasse microbiche carboidratici. Su 100g di substrato,

si hanno 50g di prodotto formato.

Per prodotti complessi

non è possibile determinarla

Resa di fermentazione = Esprime i grammi di prodotto (espressi generalmente in peso

secco), per litro di brodocoltura.

Esprime i grammi di prodotto che ottengo per ogni litro di coltura.

Questo è maggiormente sull’ambito impiantistico.

Per le Biomasse Microbiche

Per le biomasse, è intorno a (20 - 40) g L -1

il massimo si raggiunge con 60 gL per il processo industriale di produzione di lievito

-1

per panificazione (Saccharomyces cerevisiae).

Resa di fermentazione = g L -1

Per prodotti complessi

non è possibile determinarla

!!!!!

COMPOSIZIONE DEI TERRENI COLTURALI

Il terreno colturale deve fornire al microrganismo tutte le sostanze nutritive necessarie:

alla crescita - alla produzione di energia - alla biosintesi dei metaboliti desiderati

Il terreno colturale deve contenere (nutriliti): fonti di carbonio - fonti di azoto - sali

inorganici - vitamine o altri fattori di crescita - eventuali precursori.

!!!!!

I terreni colturali possono essere suddivisi in:

Terreni sintetici

- costituiti da materie prime chimicamente pure

- impiegati generalmente a livello di laboratorio

- di più facile standardizzazione qualitativa e quantitativa

- in genere forniscono crescita microbica e produzione di metaboliti limitate 1

MICROBIOLOGIA INDUSTRIALE 03

⇨ non utilizzati in ambienti di grandi produzioni industriali, non si utilizzano in aziende

alimentari

Terreni complessi

- contenenti materie prime grezze

- utilizzati su larga scala

- limitata standardizzazione qualitativa e quantitativa

- più economici rispetto a quelli sintetici

- in genere forniscono crescita microbica e produzione di metaboliti elevate

⇨ utilizzati in ambienti di grandi produzioni industriali, si utilizzano in aziende alimentari.

Nei terreni sintetici, non si forma la schiuma durante i processi fermentativi mentre è

generalemnte presente nei terreni complessi.

Ottimizzazione di un terreno colturale

nella messa a punto di un terreno colturale per un processo industriale

a. considerazioni legate al metabolismo microbico

1. massima resa di conversione Prodotto/Substrato

2. massima resa di fermentazione (g L )

-1

3. massima velocità di formazione del prodotto

4. minima formazione di prodotti secondari indesiderati

b. rifornimento costante nel tempo delle materie prime

c. standardizzazione delle materie prime

d. inconvenienti tecnologici legati alle materie prime (aerazione, agitazione - schiuma;

estrazione e purificazione prodotto.....)

e. costi 2

MICROBIOLOGIA INDUSTRIALE 03

Composizione dei terreni colturali

!!!!! Fonti di carbonio

Classificazione in base alla fonte —> Le fonti di carbonio possono essere classificate in

Fonti rinnovabili (di origine naturale)

• La CO2 è la più semplice, rinnovabile e disponibile fonte di carbonio

Fonti non rinnovabili (di origine petrolchimica)

• Alcoli a corta catena (alcani)

Classificazione in base alla composizione —>

1. Fonti carboidratiche

- In forma pura

monosaccaridi: prevalentemente glucosio (come sciroppo da idrolizzati di

amido)

disaccaridi: saccarosio e lattosio

oligosaccaridi: maltodestrine, intermedi di degradazione dell'amido

polisaccaridi: amido, generalmente da mais (altre fonti patata, avena ...) e

cellulosa

- In forma grezza

melasso (di barbabietola, di canna)

corn molasse

liscivio solfitico

orzo maltizzato

siero di latte

residui cellulosici

2. Fonti non carboidratiche

1. Fonti carboidratiche in forma grezza:

Melasso ORIGINE CARATTERISTICHE

Barbabietola

contiene circa il 50% di saccarosio; ricco di

Residuo del processo di cristallizzazione fattori di

del saccarosio crescita [tiamina, riboflavina, ac. folico....].

Canna

contiene 30% saccarosio e 20-30 % zucchero

invertito più elevato contenuto biotina

High test molasse contiene 70% zucchero

Da sciroppo di canna invertito

Corn molasse o hydrol contiene 60%

Residuo del processo da mais zuccheri, limitato contenuto proteico, alta

concentrazione salina. 3

MICROBIOLOGIA INDUSTRIALE 03

Sottoprodotto dell'industria saccarifera

! Residuo dalla cristallizzazione del saccarosio

! Ottenibile dalla lavorazione - della barbabietola (Beta vulgaris), soprattutto in Europa

!

- della canna da zucchero (Saccharum officinarum) in alcuni paesi dell’America centrale

e meridionale, dove si hanno climi temperati.

Prodotti vegetali diversi, la barbabietola è un tubero e la parte zuccherina è nel tubero

stesso mentre la canna da zucchero è un fusto e la parte zuccherina sta nel fusto stesso.

Origine da bietola: Europa, USA, Russia, Ucraina e da canna: Brasile, India, Cina,

Messico, Australia, Tailandia - Mauritius.

Come si estrae. Tagliare a strisce sottili il vegetale, poi immesso in acqua calda. gli

zuccheri passano in soluzione. In questa fase, il saccarosio lascia la matrice vegetale per

essere solubilizzato in acqua calda. Il residuo vegetale non ha pi zuccheri e viene

smaltito mentre le acque sono ricche di saccarosio, zuccheri. Viene filtrata l’acqua e le

componensi solide inutili. Successivamente la soluzione viene scaldata e quindi l’acqua

evapora così da concentrarsi lo zucchero fino a cristallizzazione. I cristalli vengono

separati e lavati e si continua la fomazione di cristalli fino a quando non è convenniente

il processo.

Il melasso si presenta:

- I melassi si presentano come sciroppi viscosi, di colore bruno

- I melassi di barbabietola e di canna presentano composizione diversa

Composizione:

Zucchero invertito chimato così perchè inverte il piano della luce polarizzata rispetto al

saccarosio.

La biotina è molto presente in canna da zucchero e quasi assente in barbabietola. Le

vitamine possono sviluppare il benessere dei MO. Se si utilizza il melasso ada canna,

non si hanno bisogno di aggiunte integrali di vitamine perchè sono gia presenti. Questa

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MICROBIOLOGIA INDUSTRIALE 03

differenza è anche la causa di chi si trova in zone di clima temperato e ha soltanto

melasso da bietola, ricerca comunque del melasso da canna da zucchero per integrare

la quota vitaminica.

Altri melassi

- Il termine melasso identifica (in senso stretto) il residuo finale della cristallizzazione del

saccarosio (da barbabietola o da canna da zucchero)

- In senso lato il termine melasso identifica altri sottoprodotti o residui di processi

estrattivi per l’ottenimento di zuccheri, diversi dal saccarosio

Corn molasse o hydrol

- Costituito dalle acque madri del processo di produzione del glucosio da amido d