Appunti Microbiologia e virologia generale

Microbiologia e Virologia 2021/2022 Prof. Leporati

ARGOMENTI:

1. La cellula batterica

2. Identificazione colonie batteriche

3. Riconoscimento di batteri Gram negativi

4. Coltura continua di microrganismi e Struttura acidi nucleici

5. Ricombinazione Microbica

6. Elementi trasponibili

7. Meccanismi di resistenza antibiotica

8. Farmaci antibatterici

9. Antibiogramma

10. Il regno dei funghi

11. Funghi filamentosi

12. Prebiotici e Probiotici

13. Virologia

14. Attacco, penetrazione e replicazione dei virus, Terapie antivirali

15. Famiglie virali

16. Classificazione dei virus

17. Corona virus e SARS-COV-2

18. Retrovirus

01 Microbiologia e Virologia generale 23/09/2021

LA CELLULA

Cellula procariotica: Presenta al suo interno capsula, parete cellulare, membrana citoplasmatica,

citoplasma, ribosomi, mesosoma, nucleoide e flagello. Le cellule sono prive di un nucleo ben definito

e delimitato da membrana nucleare, gli unici organuli presenti al suo interno sono i ribosomi.

La membrana è costituita da un doppio strato fosfolipidico che può presentare proteine integrali, di

membrana, periferiche ed alcuni lipidi come il colesterolo. Essa ha una funzione regolativa nel

passaggio di sostanze.

La parete cellulare ha funzione protettiva, contro la pressione osmotica e fornisce resistenza. È

presente in tutti i batteri ad eccezione dei micoplasmi ed alcuni archebatteri. La componente

principale è il peptidoglicano, polimero costituito da acido N-acetilmuramico (NAM), N-

aceteliglucosammina (NAG) e Amminoacidi.

La parete è responsabile al comportamento al Gram, da cui si delineano due grandi famiglie, gram

+ e gram -, protezione nei confronti della lisi, è il punto di attacco dei fagi e di numerosi antibiotici,

determina la forma del batterio. È inoltre sede di specificità antigenica.

Colorazione di Gram

In relazione alla diversa composizione della parete cellulare, è visibile una colorazione diversa sul

vetrino. Definisce in modo rapido e veloce che terapie effettuare, ad esempio una distinzione tra

meningococco e pneumococco è fondamentale in clinica.

Positivi: colore blu-violetto

Presentano una parete più spessa e compatta a più strati, con acidi teicoici, mono e polisaccaridi.

Presentano specificità antigenica, una struttura altamente polare che si oppone a molecole

come l’acqua.

idrofobiche Permette al batterio di sopravvivere in un ambiente ipotonico. Nella fase

della decolorazione il colorante non riesce ad uscire ed il batterio rimane colorato.

Negativi: colore rosso-rosato

Presentano una parete più sottile collocata tra la membrana esterna e la citoplasmatica. Sono

assenti acidi teicoici. Non è in grado di contrastare il passaggio di molecole idrofobiche.

Essi, quindi, presentano una seconda

membrana plasmatica, che sormonta la

membrana del batterio. È formata da fosfolipidi

e da una molecola chiamata LPS:

lipopolisaccaride di superficie. È responsabile

dell’azione endotossica del batterio ed è

costituita da tre elementi: lipide A, due zuccheri

acido chetodesossioctonico (KDO) + eptoso e

l’antigene O.

A causa della sua natura lipidica non consente il passaggio di molecole idrofiliche. Risulta quindi

molto più difficile attaccare un Gram - 1

01 Microbiologia e Virologia generale 23/09/2021

Forme Batteriche

• •

Cocchi sono cellule sferiche, spesso Diplococchi o diplobacilli disposti a

sono Gram + coppie.

• •

Bacilli sono cellule cilindriche tipiche Streptococchi o streptobacilli

di Gram - disposti in catene.

• •

Coccobacilli forme intermedie. Tetradi disposti a gruppi di quattro.

• •

Vibrioni, spirilli, spirochete Sarcine disposti a gruppi di otto.

Movimento della cellula batterica

I batteri si dividono in base al numero di flagelli: I Monotrichi possiedono un solo flagello, gli

Anfitrichi presentano due flagelli alle estremità, i Lofotrichi più flagelli a formare un ciuffo mentre i

Peritrichi hanno più flagelli sparsi su tutta la superficie.

Composizione di un flagello

Varia in base al gram, è di forma elicoidale e fuoriesce dalla cellula. Presenta un corpo basale o

cinetostoma accomunata dalla presenza di un anello MS immerso nella membrana citoplasmatica e

protone-motrice

complessato con proteine MOT che permettono il moto grazie ad un’azione e

proteine FLI che invertono la rotazione dell’uncino.

Pili o Fimbrie

Molto più piccoli, servono per aderire alle mucose e alle superfici. Sono costituite da proteine dette

piline. Particolari pili sono i fattori F fondamentali nella coniugazione.

Spore Batteriche

Alcun Gram + danno origine a strutture dette spore (forme di resistenza) che si replicheranno in

condizioni ottimali. Possono essere endospore, che si originano dalla cellula madre. Possono essere

più grandi (Clostridium) o più piccole (Bacillus) in base al batterio. Danno una latenza metabolica, il

Dna è circondato da corteccia, mantello/rivestimento ed esosporio ed in seguito sono espulse in

stato di quiescenza.

- CLOSTRIDIUM BOTULINUM, la germinazione della spora produce una tossina che

impedisce il rilascio di acetil colina portando a paralisi flaccida. L’intossicazione avviene in

seguito ad ingestione di cibo contaminato.

- CLOSTRIDIUM TETANI, colpisce la terminazione del motoneurone con conseguente paralisi

spastica. E’ possibile vedere risus sardonicus. La morte avviene in seguito ad insufficienza

respiratoria.

- BACILLUS ANTHRACIS, causa la malattia del tosatore.

Cellula Eucariotica: Presenta al suo interno i mitocondri e un nucleo poroso, delimitato da due

membrane e ben strutturato. La membrana plasmatica è selettiva, forma e rigidità sono dati dal

citoscheletro. I ribosomi batterici sono differenti, grazie a questo possiamo utilizzare antibiotici

specifici, salvaguardando la cellula sana.

I virus sfruttano il nucleo e i mitocondri durante la replicazione.

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02 Microbiologia e Virologia generale 28/09/21

IDENTIFICAZIONE DELLE COLONIE BATTERICHE

Identificazione di colonie batteriche:

Piastre di colture batterico sono fondamentali per il riconoscimento nella diagnostica clinica. Esistono

diverse tipologie di terreni:

• Di trasporto: Mantengono vitale il batterio, contengono tutte le strutture nutritive.

Solitamente sono liquide e successivamente andrà seminato.

• Ricchi e di Arricchimento: Sono estremamente ricchi contenendo numerosi fattori di

crescita.

• Selettivi: In esse crescono solo determinati tipi di batteri.

• Differenziali: Possono crescere colonie di differenti colori distinguendo microrganismi

differenti.

Nutrimenti nei terreni di coltura:

Peptoni: insieme di composti idrosolubili ottenuti per idrolisi delle proteine.

NaCl in base alle necessità osmotiche differenti.

Zuccheri come glucosio, lattosio, mannite, aggiunti per scopi specifici in terreni particolari, come ad

esempio con i lieviti.

Arricchimenti come estratti che forniscono fattori di crescita e Sali inorganici, supplementi selettivi

specifici ovvero antibiotici o a spettro meno definito, indicatori coloranti che permettono di seguire

il metabolismo fermentativo del batterio esaminato determinando un viraggio di colore a valori

critici di pH.

Tipi di terreni:

“Columbia blood agar base” terreno principe su cui cresce tutto, è di uso generale, ed

Agar sangue

è utilizzato anche con i lieviti. Se il terreno è pulito si può essere abbastanza sicuri che il campione

– occorre quindi seminarli sull’ Agar

sia incontaminato. I Gram crescono tutti uguali sulla piastra,

MacConkey.

Hektoen differenziale e selettivo per isolare Salmonella e Shigella. È presente il tiosolfato, quando

cresce la salmonella presenta un tipico odore.

MacConkey fondamentale per la crescita dei Gram -, si vedono bene le colonie dei diversi batteri.

La salmonella non cresce più su questo terreno. I Gram + non riescono a crescere su di esso.

è selettivo per l’isolamento dello stafilococco aureo. Le colonie appaiono giallo-

Agar Salt Mannite

oro brillante.

Diversi sono i fattori che influenzano la crescita batterica: troviamo la temperatura che comporta la

distinzione in psicofili 0°-20°C, mesofili 10°-50°C, termofili 40°-75°C e ipertermofili 70°-110°C. I

maggiori batteri utilizzati crescono a 37°C.

Il pH acidofili <6, neutrofili 6-8 e alcalofili >8, la concentrazione salina e la presenza di ossigeno

Aerobi obbligati vivono solo in presenza di O, aerobi-anaerobi facoltativi, anaerobi obbligati e

microaerofili. 1

02 Microbiologia e Virologia generale 28/09/21

Le fasi di crescita

nella quale si ha l’adattamento all’ambiente.

1) Latenza

2) Crescita esponenziale in cui il microrganismo si replica molto velocemente.

3) Stazionaria il numero totale dei microrganismi in rapporto rimane costante.

4) Declino si esauriscono i nutrienti.

Colorazione di Gram

Consente di dare definizione e morfologia del batterio, senza effettuare la coltura. Viene effettuata

in pochissimo tempo e non necessita di grandi attrezzature. È molto utilizzata in clinica.

Allestire e fissare il preparato:

fenicato di nicolle sul vetrino per 1’

1. Violetto di genziana

Eliminare l’eccesso di colore.

2. 1’

3. Lugol

4. Decolorare con alcol fino a che il preparato non cede più colore 10”

5. Lavare con acqua distillata. 1’

6. Colorante di contrasto, Fucsina o Safranina o Eosina. di colore rosso.

7. Lavare con acqua distillata.

8. Asciugare.

9. Osservare a 1000x in immersione.

Il comportamento alla colorazione varia in base alla presenza di Gram + o Gram -.

Gram + Gram - LPS solubilizzata dall’alcol.

-Disidratazione della parete cellulare con alcol. -Componente

-Riduzione della permeabilità. -Aumento permeabilità membrana esterna.

-Permane il primo colorante: Violetto. -Eliminazione del primo colorante.

-Impossibile assorbire il rosso. -Assorbimento del colorante di contrasto: Rosso

-Batteri colorati in Blu-Violetto -Batteri colorati in Rosso

Colture nei terreni

In un tampone cutaneo, seminiamo prima su Agar sangue, successivamente MacConkey e Candida.

Occorre sapere che terreni usare ed in che momento. In un’analisi gastrointestinale utilizzeremo il

Hektoen, non cercheremo mai E. Coli. In un’urina Sangue e MacConkey.

Terreno Agar Sangue: In essa si distinguono solo i Gram + che danno colonie differenti. Per

effettuare il riconoscimento da materiale respiratorio per prima cosa andiamo sotto cappa.

Terreno Agar Sale mannite: Lo stafilococco aureo rende il terreno giallo fermentando la mannite.

Terreno Agar MacConkey: La piastra è rosa, su di essa crescono i Gram -, quando fermentano i

lattosio la piastra resta rosa, se non sono in grado la piastra diventa gialla. In base alla morfologia

capiamo se è presente la capsula, in Klebsiella rispetto ad E. Coli la piastra presenta colonie mucose

simili ad un liquido.

Staphylococcus aureus, cicciotto e con emolisi, lo confermiamo con Agar mannite.

Streptococcus agalactiae, è in grado di superare la placenta, pericoloso durante il parto può dare

meningite fulminante. È di gruppo B.

Enterococcus faecalis e streptpcpccus pyogenes: A catalasi negativa, appartengono a

streptococchi o enterococchi, non formano bolle con acqua ossigenata.

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RICONOSCIMENTO DI BATTERI

Identificazione di colonie batteriche: piastre di colture batteriche per il

riconoscimento nella diagnostica clinica

NB:

Streptococchi/enterococchi = catalasi negativa, forma coccoide ma formano delle catenelle

Stafilococchi = catalasi positiva, forma coccoide a grappolo

Terreno agar sangue –

Crescono Gram + (che possiamo distinguere), Gram (che non possiamo

distinguere ad eccezione del Proteus Mirabilis, le colonie sono costituite

da una patina verdastra che copre la piastra e odore forte) e lieviti

Riconoscimento

PNEUMOCOCCO:

• Pneumococco (1) →

Coltura pura, colonie mucose, traslucide, verdastre, è capsulato (causa di una mutazione

resistenza maggiore agli antibiotici) ed è un Gram +

Materiale respiratorio: attraverso acqua che viene inalata nei bronchi e poi ripescata si cerca la

→

presenza di eventuali batteri nelle vie profonde (che devono essere sterili scelta di un agar

sangue). Se attacca le vie respiratorie e arriva al cervello può causare la meningite da pneumococco

• Pneumococco (2)

Verdastro, piccolo, non mucoso, secco, a pedina di dama (colonie incavate, tipico del

penumoccocco)

All’interno vi è un antibiotico (optochina) → il pneumococco è sensibile e nella zona circostante non

troviamo il batterio

In questo caso è di un bambino: ferita infetta che non guarisce (batterio che ai trova nelle alte vie

→

respiratorie viene portato sulla ferita perché i bambini tendono a leccarsele)

STAFILOCOCCO AUREO:

Colonia emolizzata (dove ci sono le colonie la piastra è più chiara perché

sono stati distrutti i globuli rossi), colonia bianca, cremosa,

NON fermentanti →

NB: lo stafilococco ha un enzima (=catalasi) che utilizza ossigeno se

verso gocce di acqua ossigenata su una colonia questa produce bolle

- Nel sangue rilascia tossine che si legano alle cellule

dell’endocardio causando pericardite

- Se voglio essere sicura che sia stafilococco aggiungo un terreno

agar sale di mannite

ENTEROCOCCO:

No emolisi, colonie piccole e grigie, NO catalasi (=NO bolle con acqua ossigenata)

- Pericoloso nelle ferite, a livello vaginale, urine e gola

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STREPTOCOCCHI:

• Streptococcus piogens (streptococco di tipo A)

Colonie bianche ma più piccole, alone intorno più

grande, molto emolizzati, puntiformi

NO catalasi (=NO bolle con acqua ossigenata),

produce streptolisina di tipo A

→

- Causa tonsillite e faringite se entra nel sangue

causa la scarlattina rilascia tossine (“TAS”), se entra

in una ferita causa la fascite necrotizzante (distrugge

il muscolo)

- Penicillina iniettiva e quando fallisce vi è la rimozione

delle tonsille

• Streptococcus agalactia (streptococco di tipo B)

Produce una streptolisina di tipo B, catalasi negativo,

emolitico

Si trova nell’intestino, pericoloso nelle urine e vagine:

- →

diventa pericoloso durante il parto bambino si infetta:

meningite fulminante

NB: SONO TUTTI GRAM +, i primi due provengono dall’apparato respiratorio mentre gli ultimi due

da un tampone

Agar sale mannite

Ha normalmente il colore rosa (dove abbiamo due colonie di stafilococco

epidermidis); mentre in basso il colore giallo è dovuto alla presenza dello

stafilococco aureo.

In figura, stafilococco aureo

ENTEROBATTERI abitano nell’uomo e negli animali, principalmente si

- Grande numero di specie che

trovano nell’apparato digestivo Nell’insieme sono:

-

–

1. Gram

2. Asporigeni (NON producono spore)

3. Mobili se provvisti di flagelli, immobili altrimenti

4. Quasi sempre provvisti di pili

5. Aerobi, anaerobi facoltativi 2

03 Microbiologia e Virologia generale 30/09/21

Agar MacConkey –

Normalmente è rosa e porta alla crescita di batteri Gram (terreno selettivo)

- Batterio fermentante il lattosio = colore rosa

- Batterio NON fermentante il lattosio = colore giallo

E. COLI:

Cresce rosa perché fermenta il lattosio, non produce la capsula, colonia secca

e distinguibile. Ha un incavo all’interno dovuto alla morte dei batteri più vecchi

(la colonia parte dal centro e via via si allarga, i batteri “vecchi” che stanno

morendo cadono all’interno)

In mezzo vi sono anche dei “pallini” non fermentanti gialli →

- Proteus

Si può trovare a livello intestinale perché fa parte dell’intestino

-

PROTEUS:

Cresce giallo perché non fermenta il lattosio (NON identificabili) -

Vive nell’intestino ed è pericoloso se entra in una ferita

KLEBSIELLA: “cicciotta”, “cremosa”,

Cresce rosa perché fermenta il lattosio ma è una colonia a cupola (batterio

→

capsulato forma di resistenza ai farmaci)

Nell’ultima spatolata si riescono a riconoscere le colonie (che sono

-

molte) Normalmente vive nell’intestino, è pericoloso se entra nei bronchi (si può

- e può essere trasmesso tramite le “gocce” del respiro)

anche respirare

- Nella vaginite da Klebsiella porta a delle perdite (può colpire il sistema

urinario sia a livello di vescica, sia a livello della vagina) - Può trovarsi

nell’acqua

ENTEROBACTER CLOACAE:

Gram -, NON fermentante, a cupola, produzione della capsula, traslucida (simile

alla Klebsiella)

SERRATIA MARCESCENS/SANGUINIS:

–,

Gram non fermenta il lattosio (colonie giallo-rosato/rosso sangue nel Sabouraud Agar)

- Presente nelle acque, NON si trova nel nostro organismo (è un ambientale)

- Piastre di bambini con età fra le 2-3 settimane (morti): batterio entrato in bambini nati

prematuri, mai usciti dall’ospedale → dentro al disinfettante per le mani

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- Il batterio produce un pigmento rosso (=prodigiosina) che porta ad un colore rosso accesso

nella polenta/pane (si pensava fosse un miracolo)

ALTRI BATTERI

• Pseudomonas aeruginosa

Agar sangue –,

Sembra limatura di ferro, traslucide, colore del ferro, Gram colonie

piatte

- Si trova ovunque ad eccezione del corpo umano (pericoloso

ovunque si trovi)

Fatica a crescere in questa piastra se c’è uno stafilococco aureo

-

Agar MacConkey

Molto simile ad altri batteri (ma ha un odore caratteristico) e appaiono

verdastre (alcune sono in grado di produrre tio