Appunti di Microbiologia-Virologia

 MECCANISMI DI DIFESA CHE FUNGONO DA “PRIMA BARRIERA”

la pelle: è la prima barriera esterna. Se questa è integra impedisce il passaggio di patogeni.

La cute è una barriera quasi impenetrabile per un virus, a causa della presenza dello strato

cheratinizzato, formato da cellule morte;

lacrime e saliva: contengono il lisozima, che aggredisce la parete dei batteri.

Anche defecazione e vomito sono utili per espellere le sostanze tossiche evitando il loro contatto

con la mucosa e con i batteri non dannosi.

178  BARRIERE FISICHE INTERNE

mucose e succhi gastrici: tramite la secrezione di muco i patogeni vengono spinti nello stomaco per

essere digeriti.

Le barriere mucosali sono costituite da pochi strati di cellule vive ma molti microrganismi riescono a

penetrare nonostante le difese:

- mucosa respiratoria: presenza di muco che ricopre le cellule e impedisce l’attacco al recettore;

- mucosa digestiva: saliva (contiene sostanze antivirali), secrezione acida dello stomaco, enzimi

digestivi, sali biliari;

- mucosa riproduttiva: presenza di ph acido (batteri ~ph5; molti virus sono ph-sensibili), presenza di

epitelio stratificato (vaginale) di cellule non proliferanti (i virus replicano meglio in cellule attive).

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BIOLOGIA MOLECOLARE DEI MICROORGANISMI

BIOLOGIA MOLECOLARE: indica lo studio della struttura e della funzione delle diverse classi di

macromolecole presenti nella cellula vivente. Esamineremo quelle coinvolte nel trasferimento

dell’informazione genetica.

L’informazione genetica è contenuta nei geni del DNA, in particolare nella sequenza di basi, e viene

trasferita attraverso tre tappe (replicazione, trascrizione, traduzione) per la produzione di proteine che

sono l’entità funzionale della cellula.

 I GENI

I geni sono segmenti di DNA, e l’informazione che portano risiede nella sequenza di basi presente in questi

frammenti. I geni codificano, attraverso il corrispondente RNA messaggero (mRNA), per una particolare

proteina o per una molecola di RNA (RNA ribosomiale /rRNA o RNA transfer/tRNA).

I geni essenziali per la sopravvivenza della cellula sono chiamati geni housekeeping (geni del metabolismo

di base della cellula).

L’insieme completo dei geni contenuti in una cellula è chiamato genoma. Il genoma è organizzato in modo

diverso a seconda di eucarioti o procarioti.

 QUANTI GENI E QUANTE PROTEINE CONTIENE UNA CELLULA?

Escherichia coli contiene un cromosoma singolo di circa 4,6 milioni di paia di basi di DNA, costituito da 4300

geni.

Una singola cellula di E. coli contiene 1900 differenti tipi di proteine e circa 2 milioni di molecole proteiche.

Alcune proteine sono molto abbondanti, altre meno, e questo dipende dai meccanismi di controllo

dell’espressione genica che permettono che non tutti i geni siano espressi nello stesso modo e nello stesso

tempo.

 ORGANIZZAZIONE DEL GENOMA

 PROCARIOTI

Il DNA è sotto forma di una grande molecola a doppio filamento chiamata cromosoma batterico, aggregato

in una massa densa definita nucleoide nel citoplasma. Questo DNA solitamente è circolare.

Inoltre nei procarioti è anche presente DNA extracromosomiale circolare (plasmidi, …) contenenti geni

accessori che conferiscono alla cellula proprietà speciali. Questo DNA extracomosomale infatti è dotato di

proprie proprietà (resistenza agli antibiotici, …).

180  EUCARIOTI

Il DNA è lineare, ed è organizzato in cromosomi presenti all’interno di un vero e proprio nucleo cellulare.

Il numero di cromosomi è variabile tra gli organismi (esempio: il lievito S. cerevisiae ha 16 cromosomi

appaiati in 8 coppie; cellule umane hanno 46 cromosomi, quindi 23 paia).

I cromosomi contengono oltre al DNA le proteine (istoni), necessarie per il ripiegamento e

l’impacchettamento del DNA (nucleosomi), ma anche le proteine necessarie per l’espressione genica.

Gli eucarioti possiedono due copie di ogni gene e sono detti diploidi. Durante la divisione cellulare si ha il

raddoppiamento del numero di cromosomi e poi il nucleo si divide dando origine a due cellule figlie

(processo di mitosi).

 STRUTTURA DEL DNA: IL SUPERAVVOLGIMENTO

Una molecola di DNA si dice rilassata quando possiede l’esatto numero di giri d’elica atteso, in base alla

lunghezza in coppie di basi.

Poiché le dimensioni della cellula batterica sono limitate e la lunghezza di una molecola di DNA rilassata è

elevata, il DNA si “impacchetta” in poco spazio attraverso il superavvolgimento.

Con superavvolgimento si intende quello stato del DNA in cui i filamenti a doppia elica vengono

ulteriormente attorcigliati. Il superavvolgimento mette la molecola di DNA sotto torsione.

Il livello di superavvolgimento può anche influenzare l’espressione genica: alcuni geni sono più attivamente

trascritti quando il DNA è superavvolto, mentre nella stessa condizione la trascrizione di altri geni può

risultare inibita.

 DNA SUPERAVVOLTO

Il DNA può assumere due tipi di superavvolgimento:

 superavvolgimento negativo: è il più frequente, avviene quando il DNA si attorciglia intorno al suo

asse in direzione opposta a quello della doppia elica destrorsa;

 superavvolgimento positivo: avviene quando il DNA si attorciglia in senso opposto al

superavvolgimento negativo.

 SUPERAVVOLGIMENTO NEGATIVO NEI PROCARIOTI

Il superavvolgimento negativo nei procarioti avviene grazie all’enzima DNA girasi, che appartiene alla

famiglia delle topoisomerasi, in particolare è una topoisomerasi II.

N.B.: alcuni antibiotici che agiscono sui batteri hanno l’azione di inibire la DNA girasi (esempio: chinoloni,

fluorochinoloni, novobiocina).

Per evitare un eccessivo superavvolgimento, o quando avviene la replicazione, esiste un enzima in grado di

rimuovere il superavvolgimento del DNA, anch’esso appartiene alla famiglia delle topoisomerasi ed è la

topoisomerasi I . 181

 SUPERAVVOLGIMENTO POSITIVO NEGLI ARCHEA E PROCARIOTI IPERTERMOFILI

Il superavvolgimento positivo nei procarioti avviene grazie all’enzima girasi inversa.

I microrganismi che contengono questo tipo di topoisomerasi appartengono a quelle specie che crescono in

condizioni di temperature estremamente elevate, e sembra che il superavvolgimento positivo svolga un

ruolo importante nel proteggere il DNA dalla denaturazione.

Quindi tramite l’azione delle topoisomerasi la molecola del DNA può trovarsi alternativamente in uno stato

di superavvolgimento o rilassamento. Per evitare che ogni rottura provochi la transizione dell’intero

cromosoma dallo stato superavvolto allo stato rilassato il cromosoma batterico è diviso in domini di

superavvolgimento.

 SUPERAVVOLGIMENTO DEL DNA NEGLI EUCARIOTI

Il DNA lineare a doppia elica dei cromosomi, caratteristico degli eucarioti, si avvolge intorno a proteine

dette istoni formando strutture compatte chiamate nucleosomi.

Gli istoni sono un gruppo di proteine cariche positivamente che neutralizzano le cariche negative del DNA

derivanti dai gruppi fosfato.

La formazione di nucleosomi introduce nella molecola di DNA superavvolgimenti negativi.

LE TAPPE DEL FLUSSO DELL’INFORMAZIONE GENETICA

1. REPLICAZIONE: il DNA si duplica producendo due doppie eliche;

2. TRASCRIZIONE il DNA trasferisce l’informazione ad una molecola di RNA detta RNA messaggero che

consentirà poi la sintesi proteica. Per ogni segmento di DNA viene trascritta soltanto una delle due

eliche di DNA. Alcune regioni di DNA non codificano proteine ma altri tipi di RNA come RNA trasfer

ed RNA ribosomiale;

3. TRADUZIONE: processo attraverso il quale il codice genetico viene tradotto in proteine da un

macchinario di sintesi costituito da ribosomi (che a loro volta sono formati da proteine e molecole

di rRNA), tRNA e da numerosi enzimi.

Il trasferimento dell’informazione da acido nucleico a proteina è unidirezionale, cioè la sequenza delle

basi di DNA specificano una proteina, mentre una proteina non specifica una sequenza di acido

nucleico.

La sequenza di aminoacidi di ogni proteina è determinata dalla specifica sequenza di basi presente

nell’mRNA, che a sua volta è stato trascritto in base alla sequenza del DNA. Si crea così una

corrispondenza lineare tra la sequenza in basi di un gene e la sequenza in aminoacidi di una proteina.

Sono necessarie tre basi per codificare un singolo aminoacido: questa tripletta è definita codone.

Esistono più triplette che codificano per un singolo aminoacido ed è per questo che una proteina non

specifica una sequenza di acido nucleico.

182  DIFFERENZE DEL FLUSSO DELL’INFORMAZIONE GENETICA TRA PROCARIOTI ED EUCARIOTI

 procarioti:

o tutti e tre i processi avvengono nel citoplasma

o un singolo mRNA contiene più di una regione codificante (mRNA policistronici)

 eucarioti:

o replicazione e trascrizione avvengono nel nucleo, la traduzione nel citoplasma (nel reticolo

endoplasmatico);

o gli mRNA sono quasi sempre monocistronici;

o i geni codificanti le proteine sono suddivisi in una o più regioni codificanti (esoni) intervallate da

regioni non codificanti (introni).

 UNITA’ DI TRASCRIZIONE: OPERONE

E’ quella regione del DNA che comprende: regione promotrice + gene (o più geni, codificanti RNA o

proteine) + terminatore della trascrizione.

Esempio: operone ribosomiale. Contiene geni che codificano non per proteine ma per molecole di RNA che

non sono tradotte (rRNA e tRNA).

Questi operoni hanno i geni che codificano per rRNA 5S, 16S, 23S che costituiscono i ribosomi, mentre nello

spazio tra i geni per gli rRNA 16S e 23S è contenuto il gene per un tRNA.

REPLICAZIONE

 MECCANISMI DI REPLICAZIONE IPOTETICI

- semiconservativa;

- conservativa;

- dispersiva

L’apparato di replicazione è detto primosoma all’inizio della replicazione, e poi replisoma.

Da un punto di vista biochimico è un processo di polimerizzazione.

Le varie fasi della replicazione richiedono l’attività di numerose proteine specifiche. 183

 INIZIO DELLA SINTESI DEL DNA

Il processo di replicazione prende avvio in un singolo sito cromosomico detto origine

di replicazione (quello di E.coli è chiamato oriC).

I cromosomi eucariotici hanno più di un’origine di replicazione. Negli Archea ci sono

sia origini uniche che multiple.

A livello dell’oriC il DNA si apre su entrambe i filamenti, formando una forca di

replicazione.

La replicazione può essere:

- bidirezionale

- unidirezionale

- rolling circle

 REPLICAZIONE BIDIREZIONALE

La replicazione avviene a partire dall’origine di replicazione ed è bidirezionale: ci sono due forche di

replicazione che si muovono in direzioni opposte.

Nel DNA circolare la replicazione bidirezionale porta alla for