Appunti di Virologia generale

Cenni storici sui virus

Non è possibile datare la prima comparsa di questi microorganismi sulla Terra perché non vi sono reperti fossili. Conosciamo grandi epidemie di morbillo e vaiolo portate da Herman Cortèz nel centro America. Queste malattie erano comuni nel nostro mondo ma non nella popolazione Azteca, che era immunologicamente vergine. La virologia però è una scienza prettamente moderna (anche se abbiamo queste tracce dal passato).

Alla fine del 1800 ancora non erano conosciuti virus e batteri, “virus” significa “veleno”. Un filtro di porcellana con porosità particolare e di selettività crescente riusciva a trattenere i batteri facendo passare l’eluato. C. Ivanowski utilizzò questo filtro per studiare delle foglie malate di tabacco: facendo degli estratti da queste foglie e facendoli passare dal filtro di porcellana, vide che il filtrato era ancora in grado di trasmettere la malattia ad altre piante (nonostante i batteri venissero bloccati nel filtro). Non si pensò immediatamente che la malattia fosse associata a microorganismi. M. Neijerinick approfondì questi studi e sviluppò il concetto di “virus” come agente filtrabile infettante perché riusciva a passare attraverso il filtro di porcellana (mentre i batteri venivano trattenuti dal filtro). Questo segna l’inizio della virologia moderna e cominciarono gli studi su molte malattie diverse.

L’era della virologia inizia nel 1800 e arriva fino ai giorni nostri. Furono individuati i primi virus dei batteri, ovvero i batteriofagi, negli anni ‘30. Negli anni ‘50 si trovò la maniera per coltivare i virus in maniera controllata e questo permise la creazione dei vaccini. Vi è stata poi la scoperta dei virus che possono causare tumori (papilloma virus), la scoperta dell’AIDS e sono stati poi ideati farmaci in grado di bloccare la trascrizione.

Cosa sono i virus?

Diversamente dai batteri, che sono cellule procariotiche che hanno metabolismi per ottenere energia e si dividono per scissione binaria, i virus sono entità molto più semplici. I loro costituenti essenziali sono semplici: sono acidi nucleici (di varia natura: DNA, RNA, a singola o doppia elica, circolare o lineare) rivestiti da proteine. Il guscio di protezione è il capside. Questo viene detto nudo quando non è avviluppato da altre membrane mentre in altri virus vi è un ulteriore strato lipidico che circonda il capside. Questo è detto envelope e può esserci o non esserci a seconda della specie.

Sappiamo che l’acido nucleico contiene le informazioni per il virus, sia per la propria replicazione che per la traduzione delle proteine virali. Queste informazioni del codice genetico sono contenuto nell’acido nucleico e il flusso delle informazioni è unidirezionale che va... → → DNA → RNA → proteine. Questo è il dogma della biologia molecolare. Il codice è a triplette e vengono copiate e trascritte da una RNA polimerasi in un mRNA. Questo messaggero porta il messaggio ad una macchina (il ribosoma) che lo codifica e determina la produzione di sequenze amminoacidiche.

I ribosomi nel virus, essenziali per la produzione delle proteine, non ci sono. Come fanno quindi a tradurre le loro proteine? Proprio per questa essenzialità di struttura, i virus dipendono da una cellula ospite: devono penetrare all’interno di una qualunque cellula e sfruttare l’apparato di replicazione per replicarsi e dare origine ad una progenie virale. Una volta penetrato nella cellula, il virus deve rendere accessibile il proprio acido nucleico. Per fare ciò, il virus deve in qualche modo disassemblarsi e scomporsi, perdendo tutti i suoi rivestimenti di protezione. Il virus comincerà quindi a replicarsi e si accumuleranno all’interno della cellula tutte le componenti strutturali. Dentro la cellula cominciano assemblarsi i virus che poi dovranno uscire per perpetuare la loro specie. Generalmente i virus escono o per lisi della cellula (scoppia, si degrada e le particelle virali fuoriescono in seguito alla morte) oppure attraverso gemmazioni mediate da vescicole. In questo modo si mantiene in vita la cellula, al virus conviene ed è per questo si sono sviluppati questi nuovi meccanismi.

Definizione di virus

I virus sono definiti parassiti endocellulari obbligati:

• “Parassiti” perché devono replicarsi sfruttando un’altra cellula;
• “Endocellulari” perché devono entrare all’interno dell’ospite;
• “Obbligati” perché non possono fare altro a causa della loro semplicità di struttura.

Esiste una fase extracellulare e una endocellulare. Il virus è quindi un microorganismo con due fasi:

• Nella fase extracellulare, il virus si trova all’esterno della cellula ed è accessibile a tanti tipi di aggressioni (raggi UV, temperatura, ecc.). Il virione è la particella fisica osservabile, è inerte e ha la funzione di sopravvivere. Questa è la parte non funzionale: per esprimere il proprio contenuto genetico il virus deve entrare in un organismo.
• Nella fase intracellulare, non vediamo più il virione perché deve rendere accessibile l’acido nucleico. La cellula infetta è la fase biologicamente attiva.

L’infezione sviluppa un programma predefinito sulla base delle informazioni contenute all’interno del genoma virale. È come un CD che viene inserito in un computer: fuori è inerte ma quando lo inserisci attiva il suo programma ed è sempre quello.

Programma

• Struttura, composizione e criteri di classificazione;
• Diversi meccanismi di penetrazione dell’infezione;
• Fasi del ciclo replicativo ed esiti;
• Coltivazione e quantificazione dei virus;
• Strategie di replicazione di alcuni virus:
  • Virus a RNA (poliovirus)
  • Virus a DNA
  • Retrovirus
  • HIV e AIDS

Ricapitolando... I virus sono parassiti endocellulari obbligati. Sono organismi submicroscopici acellulari (non sono cellule) e sono costretti a replicarsi all’interno di una cellula. Sono particelle prodotte dall’assemblaggio di componenti preformati, quindi non crescono e non si dividono come le altre cellule (si replicano e si dividono). Mancano dell’informazione genetica che codifica l’apparato necessario per la generazione di energia metabolica (ATPasi) o per la sintesi di proteine (ribosomi) e sono quindi assolutamente dipendenti dalla cellula ospite per queste funzioni. Possono infettare animali, piante, lieviti e batteri, qualunque organismo cellulare.

I virus si replicano attraverso l’assemblaggio di componenti preformati. Nei batteri le curve di crescita sono esponenziali mentre nelle popolazioni virali le curve sono particolari: all’inizio il virus è rilevato nel sopranatante poi non lo ritroviamo più (perché entra nella cellula), il virus si è eclissato, poi tutto d’un tratto vi è un’esplosione della progenie virale, che all’improvviso (dopo la lisi) si trova nel sopranatante.

I virus sono organismi submicroscopici, ovvero non possono essere visti al microscopio ottico. Hanno generalmente delle dimensioni relative che vanno dai 20 ai 200 nm (ovvero 0,2 μm, e 0,1 μm è il limite del potere risolutivo del microscopio ottico: non possono essere visti al MO). Il poliovirus ha un diametro di 30 nm (dimensione simile ai ribosomi che sono 20 nm di diametro) mentre i virus dell’epatite sono molto piccoli. L’ebola è un virus filamentosomolto grande.

I virus sono osservabili al microscopio elettronico. Questo ha un fascio di elettroni che viene sparato da lamette di tungsteno, attraverso un magnete viene orientato sulla griglia con il campione; può essere deviato o rilevato con un rilevatore di elettroni. Al microscopio ottico sono visibili le alterazioni subite da cellule infettate da virus.

In natura i virus sono elettron-lucenti, ovvero attraversati dai fasci di elettroni, per cui è necessario trattarli con una colorazione “negative stain”. Il campione viene mescolato con sali elettron-opachi (Na-fosfotungstato). Si depongono in modo da formare un’ombreggiatura, che permette di analizzare in modo specifico i virioni. Non sempre l’osservazione è diagnostica, i virus possono avere strutture simili anche se di specie diverse; in alcuni casi però sono presenti delle strutture peculiari.

Al microscopio elettronico si osservano le particelle virali mentre al microscopio ottico osserviamo le cellule infette. Circa 10 anni fa sono stati identificati dei virus, precedentemente considerati batteri, che sono visualizzabili al MO. Questi sono detti mimivirus e contengono più di 1,2 milioni di coppie di basi e codifica per 900 geni. La cosa particolare è che si è pensato fossero batteri perché nell’immagine al MO, all’interno della cellula c’erano delle inclusioni.

Perché studiamo i virus?

• Per prevenire e curare le malattie infettive virali;
• Per comprendere i meccanismi di regolazione genica eucariotica (i virus sono utilizzati come tag e vettori);
• Per l’evoluzione delle biotecnologie;
• Per evitare l’utilizzo di potenziali armi biologiche (vaiolo);
• Perché ogni anno compaiono nuovi virus emergenti (HIV, ebola, SARS, influenza);
• Per studiare il loro coinvolgimento con l’oncogenesi;
• Per utilizzare vettori virali per la terapia genica.

Struttura e classificazione dei virus

La necessità di colonizzare nicchie sempre nuove ha determinato nell’evoluzione la formazione di nuove morfologie. Questo è avvenuto anche nei virus: hanno una grande variabilità di forme, da lineare (MTV), a sferica (adenovirus), da filiformi (ebola) a molto organizzata (fago T4). Virus diversi possono apparire con la stessa forma: non è un carattere sempre distintivo. In alcuni casi però la forma è l’elemento caratterizzante di un virus: ci sono alcune morfologie specifiche e quindi si possono considerare diagnostiche. Un esempio è il virus Sars, un coronavirus responsabile del raffreddore (nell’essere umano, negli altri animali causa altre patologie). La struttura tipica di questi virus è la presenza di una specie di aureola formata da glicoproteine.

Tutti i virus, nonostante l’enorme diversità, sono accomunati da 3 semplici requisiti:

• Sono tutti parassiti endocellulari obbligati e si replicano solo all’interno di una cellula ospite;
• Tutti, per forza, devono sintetizzare un mRNA leggibile dai ribosomi cellulari (si devono adattare sempre, indipendentemente dal loro genoma);
• Tutti sono riconducibili ad una organizzazione strutturale essenziale: envelope (se presente), capside e acido nucleico.

La struttura dei virus è fortemente conservata:

• Vi è una porzione interna, core interno, che contiene l’acido nucleico che è spesso complessato a proteine strutturali (stabilizzare la doppia elica) ed enzimatiche (possono essere polimerasi o altre proteine che intervengono nella replicazione). Questo core può essere molto differenziato e può essere costituito da un genoma semplice o complesso, le proteine possono associarsi a formare strutture diverse. Il genoma può essere impaccato all’interno del core in maniera diversa.
• L’altra porzione esterna è il rivestimento che è formato da:
  • Capside, che è un rivestimento proteico che può avere diverse forme;
  • Envelope o pericapside, che sta attorno al capside, è di natura lipidica può essere presente (soprattutto negli animali). I virus non rivestiti sono detti “nudi”.

Genoma

Anche i genomi (depositario del codice genetico) dei virus presentano la più grande diversità delle forme genomiche. I virus possono avere il genoma a DNA, a doppia elica o a singolo filamento, o ad RNA, a singola o a doppia elica. Il singolo filamento ad RNA può essere (+), se ha la stessa complementarietà del messaggero (viene direttamente letto dai ribosomi), oppure (-), se è complementare al messaggero (non viene subito letto dai ribosomi perché è complementare all’mRNA quindi prima deve essere trascritto in una copia complementare). Il DNA può essere in forma circolare o in forma lineare. A volte hanno dei genomi in forma lineare che, una volta entrati nell’ospite, possono circolarizzarsi grazie ad estremità ripetute invertite. I virus ad RNA hanno generalmente dei genomi molto più corti e possono essere frammentati (virus dell’influenza).

I genomi virali hanno delle dimensioni proporzionate alle dimensioni del virus: la lunghezza va da 3500 nt (fago MS2) a 280 kbp (EBV). I virus batteriofagi che infettano i batteri hanno genomi molto piccoli. I genomi sono strettamente impacchettati nel capside, che funge da limite. Le informazioni per le funzioni virali sono compattate in genomi molto ridotti, anche da un punto di vista funzionale.

Quali sono le proprietà dei genomi?

• Grande varietà di composizione (DNA o RNA, SS o DS, lineare o circolare, unico o frammentato);
• Strettamente impacchettato nel capside;
• Associato a ioni (+) o a proteine basiche (virali o cellulari) per neutralizzare le cariche negative dei gruppi fosfato e permettergli di rimanere impacchettato;
• Vi sono delle sequenze di riconoscimento per il packaging (sequenze nella struttura primaria e secondaria. Queste riconoscono nell’ambiente circostante le proteine neutralizzanti.
• Necessità di un primer per la replicazione: devono trovarsi dei primer o delle sequenze che funzionano da innesco (estremità ridondanti, ripetute o associate a varie proteine per l’innesco; tRNA come primers) anche sfruttando quelle dell’ospite;
• Potenziale di informazione altamente compresso e limitato. Il virus ha dovuto confrontarsi con le strutture e le opposizioni da parte delle cellule ospite: si è adattato in modo da codificare più proteine possibili sfruttando dei “trucchi” (geni sovrapposti, possibilità di splicing multipli e alternativi nell’mRNA, starts codons interni). Questa capacità prende il nome di economia di genoma;

Le caratteristiche del genoma definiscono la strategia replicativa dei virus.

Strategie di economia di genoma

• Splicing alternativo: lo splicing è una modificazione post trascrizionale (dopo la trascrizione). Un mRNA può essere tagliato dallo spliciosoma delle sequenze introniche in diversi punti. L’RNA messaggero che ne deriva è differente dagli altri ottenuti dalla stessa sequenza ma tagliato in punti diversi.
• Frameshifting: il termine “shift” significa “scivolamento” mentre “frame” indica la “chiave di lettura”. Il codice viene letto sotto forma di triplette e ciascuna di queste corrisponde ad un aminoacido. I virus hanno evoluto dei sistemi in modo che quando i messaggeri arrivano nel ribosoma, durante la scansione, scivolano: l’mRNA può essere prima letto secondo la griglia corretta poi, se scivola, viene letto secondo un’altra griglia. Il risultato non è lo stesso: si ottengono sequenze diverse o frammenti di lunghezza diversa.
• Traduzione da start codon interni (“Leaky scanning”): la traduzione parte da una sequenza AUG. Questa scansione debole permette al messaggero di essere letto sia dallo start codon che da un codone d’inizio posto più avanti lungo l’mRNA. Questa strategia è usata dal virus HBV (epatite). Da questo genoma molto piccolo si produce una pluralità di proteine oltre le 4 proteine codificate.

Virus con genoma a RNA

• ssRNA polarità (+) (poliovirus): il genoma ha la stessa polarità dell’mRNA quindi viene direttamente tradotto come un mRNA (è sia genoma che mRNA allo stesso tempo) dai ribosomi.
• ssRNA polarità (-): per ottenere un messaggero deve essere trascritto in un filamento complementare (da (-) a (+)). Il virus utilizza il genoma ss(-) per trascrivere mRNA ss(+) e, per questo, deve contenere una trascrittasi (RNA-polimerasi RNA-dipendente) per trascrivere gli mRNA.
• dsRNA(-)/(+): il virus trascrive gli mRNA utilizzando il filamento negativo del genoma. Il virus deve contenere una trascrittasi.

Capside

È un guscio proteico che va a circondare il genoma ed è costituito da un numero variabile di singole molecole proteiche, i capsomeri. Ha la funzione di protezione del genoma virale, di riconoscimento recettoriale e attacco alla cellula ospite. Ha anche la funzione di guida del genoma al compartimento di replicazione, per esempio prendendo contatto con gli elementi citoscheletrici dell’ospite. Il nucleo deve essere sufficientemente stabile (minima energia libera). Per mettere insieme la stabilità del nucleo e una minima dimensione del genoma, il virus ha ideato diverse strategie.

Per essere assolutamente in una fase attiva, il virione deve penetrare all’interno di una cellula ospite, dove la struttura esterna si deve dissociare. Non possono avere un rivestimento cementificato, ovvero con le componenti legate mediante legami covalenti (molto forti). Il rivestimento deve essere stabile in una fase extracellulare ma deve potersi disassemblare quando si innescano dei segnali che determinano l’allentamento delle “maglie”. Questo è permesso grazie all’interazione di forze non covalenti (legami H, forze di Van der Waals). Il virione è quindi l’effetto delle interazioni proteina-proteina, proteine-acido nucleico (per il capside) e proteine-lipide (envelope) e si assembla mediante un processo spontaneo (auto-assemblaggio). Il nucleo si dice metastabile. Il modo in cui si è evoluta questa capacità viene spiegato studiando i solidi simmetrici. In natura, troviamo che i capsidi si trovano principalmente in due forme altamente simmetriche: elicoidale e icosaedrica (solido chiuso caratterizzato da avere 20