Appunti virologia

Virologia generale

Non tutti i virus sono patogeni, molti causano patologie a carico di qualsiasi distretto dell’organismo. Virus delle vie respiratorie possono causare anche gastroenteriti. Virus con envelope molto difficilmente si trasmettono per fomiti (oggetti inanimati). Più di 10⁸ virus diversi negli animali, 10³¹ virioni negli oceani che possono essere aerosolizzati e ricadere come pioggia.

Nel nostro corpo ci sono 100 mila miliardi di batteri e 1 milione di miliardi di virus. Alcuni virus sono integrati nel nostro genoma. L’evoluzione a mammiferi placentati è avvenuta grazie a virus che hanno passato il gene per formare il trofoblasto quindi la placenta.

Caratteristiche dei virus

I virus: parassiti intracellulari obbligati, non hanno ribosomi, non si replicano o evolvono indipendentemente, non sono viventi; le virocellule non sempre portano alla morte dell’organismo, vivono per anni e si replicano. Il virus possiede acido nucleico (DNA o RNA) e involucro proteico che lo impacchetta; qualcuno possiede un involucro glicolipidico pericapsidico (envelope o peplos).

L'envelope influenza la stabilità, lo rende meno stabile, meno resistente agli alcol, detergenti, pH; favorisce però infezioni persistenti. Virus nudi o con envelope, alcuni però sono “quasi envelope” e possono quindi essere ritrovati con membrana cellulare originata dagli esosomi ma anche in forma nuda (es. epatite E).

I virus sono agenti filtrabili (esperimento con virus del mosaico del tabacco si trasmetteva tra piante di tabacco anche dopo aver prelevato del materiale e fatto passare in un filtro, i virus non venivano trattenuti); parassiti intracellulari obbligati; non possono produrre energia o proteine indipendentemente; genomi a RNA o DNA (mRNA o miRNA per regolazione) ma non entrambi.

Il capside nudo, quasi envelope o pericapside; le componenti virali sono assemblate e non si replicano per divisione; non sono viventi; devono essere infettivi (virione) per sopravvivere in natura; devono essere in grado di utilizzare i processi della cellula ospite per produrre i propri componenti (mRNA, proteine, non producono copie identiche del genoma per mutazioni durante la replicazione dovute alla dimensione del genoma e l’apparato enzimatico); i virus devono codificare eventuali processi necessari non forniti dalla cellula ospite; i componenti virali devono effettuare un auto-assemblaggio (i capsidi sono metastabili si autoassemblano ma poi rilasciano il genoma dentro le cellule).

Possono infettare cellule eucariote, procarioti (batteriofagi) o altri virus. Range 30-300nm per i virus di interesse medico, necessario il ME non MO. Morfologia molto diversa: sferica icosaedrica, pentaedrica, elicoidale; alcuni con simmetria complessa perché non ben definibile.

Virus giganti

Recentemente sono stati identificati virus giganti come i MIMIVIRUS (quasi 1000 geni, infettati da altri virus come lo Sputnik, hanno sviluppato un sistema di immunità nei confronti dello Sputnik simile alle Crispr-cas9), PANDORAVIRUS (2500 geni per la maggior parte unici, anche DNA pol, non codificano per funzioni note, classificati in un nuovo dominio?) che infettano le amebe. La dimensione può arrivare a superare quella di alcuni batteri (fino a qualche micron).

Classificazione virale

La classificazione virale è effettuata sulla natura del genoma (DNA o RNA a polarità + quindi subito tradotto/ - cioè complementare a quello tradotto quindi deve essere prima Tx con RNA pol RNA dipendente; non segmentato o segmentato cioè in singola molecola o no —> RNA —> assemblaggio —> difettivi; lineare o circolare; se diploide (retroviruses), copy choice), sulla struttura del virione (simmetria del capside icosaedrica, elicoidale, complessa; numero di capsomeri cioè la più piccola entità strutturale visibile al ME di un capside virale; presenza o assenza di envelope che influenza l’entrata, uscita), sulle strategie di replicazione (Baltimore).

I virus si classificano in base a caratteristiche: morfologiche, strutturali, genetiche e replicative. Vengono suddivisi in: ordini (-virales), famiglie (-viridae), sottofamiglie (-virinae), generi (-virus), specie, ceppi, tipi (genotipi, sierotipi). La specie è l’unico grado di classificazione virale necessario e sempre presente. Definizione di specie: secondo ICTV è il grado più basso di livello tassonomico approvato dal comitato, gruppo monofiletico di virus le cui proprietà possono essere distinte da criteri multipli (estremamente soggettivo).

Per semplificare si può dire che appartengono alla stessa specie i virus che: infettano lo stesso ospite e tessuto, causano la stessa patologia e hanno la stessa mappa genomica. GENOTIPI: possiedono differenze nucleotidiche che non determinano differenze antigeniche; SIEROTIPI: differiscono per la presenza di specifici epitopi, sono neutralizzati da Ab diversi. CEPPI: isolati virali che sono stati ben definiti.

Virus di interesse medico

Virus di interesse medico: DNA (classe I, II, VII) double stranded (con envelope come herpesviridae, hepaviridae o senza (circolare come papillomaviridae o lineare come adenoviridae)); single stranded con enveloped come i parvoviridae; genoma complesso senza enveloped come poxviridae.

Virus a RNA (molto più numerosi): double strand tutti non enveloped come i reoviridae (apparato GI, genoma segmentato); single strand positive enveloped (togaviridae, coronaviridae, retroviridae, flaviviridae) o non-enveloped (picornaviridae, caliciviridae); single strand negative con enveloped.

Struttura del virione

Struttura del virione: VIRUS NUDI sono molto resistenti a detergenti, essiccamento e acidi resistenti quindi all’ambiente intestinale, spesso sopravvivono sulle superfici; spesso trasmessi per via orofecale; possono mantenere il potere infettante nelle acque reflue; uscita per lisi cellulare; facilmente neutralizzabili da Ab.

VIRUS INVILUPPATI: sensibili a detergenti, essiccamento, acidi, spesso inattivati nel tratto GI; glicoproteine nell'envelope; meno stabili; trasmissione spesso per goccioline tramite aerosol, secrezione, trapianti organi e via parenterale; possono causare infezioni persistenti senza uccidere la cellula ospite.

I virus sono generalmente (dopo scoperta del virus del tabacco filtrabile) di forma allungata o sferica basandosi su immagini di EM (Watson e Crick); ipotesi: virus limitata capacità codificante, le unità che circondano i genomi sono poche e ripetute tante volte, diversi simmetrie (bastoncino—> elicoidale (virus tabacco e ebola), sferici—> icosaedrica (poliovirus); scoperta in seguito anche simmetria complessa (poxvirus)).

Capsomero e protomeri

Il capsomero è la minima entità visibile al ME, costituito da protomeri cioè unità strutturali e funzionali dei capsidi, ciascuno formato da più proteine; protomeri e capsomeri si autoassemblano per formare il capside virale. I virus nudi hanno capside, quelli con envelope hanno un nucleo capside. Le interazioni tra le subunità virali sono di tipo non covalente. Le particelle virali devono essere metastabili (stabili perché devono proteggere il genoma virale; instabili perché devono rilasciare il genoma virale all’interno della cellula).

I virioni non hanno uno stato termodinamicamente più stabile, tale stato è rappresentato dal genoma disassemblato; esiste un’elevata barriera energetica tra lo stato assemblato (alta energia) e quello disassemblato (minima energia); il passaggio di stato deve essere attivato da eventi esterni quali variazione pH e fusione tra envelope virale e membrane cellulari.

Simmetria icosaedrica

Simmetria ICOSAEDRICA: picornaviridae, herpesviridae, adenoviridae, retroviridae, flaviviridae; l’icosaedro è un poligono con 12 vertici e 20 facce costituito da un numero preciso di proteine (60, 180, 240, 960); 6 assi 5x circondati da 5 subunità, 10 assi 3x circondati da 3 subunità, 15 assi 2x circondati da 2 subunità. T=1.

Come aumentare le dimensioni di un capside icosaedrico? Aumentare le dimensioni delle subunità aumentando la porzione di genoma che codifica per queste proteine (non conveniente); aumento del numero di subunità consente di contenere la porzione di genoma codificante per queste proteine. T diventa 3, aumenta il numero di subunità, icosadeltaedro con 20 facce, 6 assi 5x, 10 assi 3x, 15 assi 2x. T=numero di triangolazione cioè le subunità che formano il protomero; subunità totali=60xT.

CAPSOMERI: unità visibili al ME, formati da protomeri; se T=1 avremo pentameri, circondati da altri pentameri; se T>1 avremo pentoni/pentameri costituiti da 5 subunità in corrispondenza degli assi di simmetria 5x, circondati da altri capsomeri; se T>1 esoni/esameri con 6 subunità in corrispondenza degli assi di simmetria 3x, circondati da 6 capsomeri.

Simmetria e complessità dei virus

A seconda delle loro dimensioni e della complessità del capside i virus a simmetria icosaedrica si distinguono in virus a: simmetria icosaedrica semplice (12 capsomeri, pentameri, 5 subunità ai vertici), simmetria icosdeltaedrica (12 pentameri, numero variabile di esameri che occupano le facce).

Parvoviridae: virus a DNA, circa 20nm il capside, solo 60 copie della proteina CP capsidica, T=1, costituito da 12 pentameri.

Virus a simmetria ICOSADELTAEDRICA: tra i pentoni si inseriscono capsomeri ai vertici, esoni sulle facce (6 subunità). Protomeri formati da 3 subunità. T=3. Adenoviridae: 100nm, virus nudi, T=25, 1500 subunità, 12 pentameri, presentano fibre che protrudono dai vertici e determinano il trofismo.

Virus a simmetria elicoidale: capsomeri si avvolgono in modo elicoidale sull’acido nucleico, appaiono a forma filamentosa, genoma spiralizzato all’interno, virus mosaico del Tabacco; Rabdoviridae (virus rabbia), Filoviridae (ebola), Ortomixoviridae (influenza).

Simmetria complessa propria dei Poxviridae, con capside senza envelope. Simmetria combinata come i Batteriofagi. Testa icosaedrica con il genoma e coda elicoidale —> batteriofagi della serie T. Struttura Icosaedrica senza envelope come polio, adeno, epatite A (molto resistenti); elicoidali senza envelope (non identificati per essere umano, virus tabacco); icosadeltaedrici con envelope come virus dell’herpes, febbre gialla, rosolia; elicoidali con envelope come quelli della rabbia, influenza, parotite, morbillo. Virus a DNA non hanno simmetria elicoidale.

Fasi principali ciclo vitale

Fasi principali ciclo vitale: assorbimento mediata da proteina VAP (proteina virale di attacco), penetrazione, liberazione (spogliazione), sintesi macromolecolare (replicazione genoma virale, espressione genica virale), assemblaggio, fuoriuscita dei virioni (cioè virus maturi e infettanti). Strategie diverse nelle diverse classi di virus.

Ciclo coronavirus: virus con envelope, la proteina spike funge da VAP interagendo con il recettore sulla membrana plasmatica delle cellule ospiti, interazione tra anti-recettore virale e recettore cellulare attivano meccanismi che portano all’entrata del genoma virale, il genoma nel citoplasma genera proteine, particelle virali si auto-assemblano e vengono rilasciate.

PROTEASI: codificate dal virus o dalle cellule ospiti, alcuni virus le sfruttano per essere attivati.

Assorbimento

ASSORBIMENTO: legame di proteina/e superficiali virali (proteine di attacco e VAP) al/i recettore/i cellulari. Porteina spike di Sars-cov2 lega ACE2 (angiotensin converting enzyme 2) espresso in determinati tipi cellulari quali rene, cuore, polmone, intestino. La natura del recettore cellulare ne definisce il trofismo. Proteasi TMPRSS2 (può essere espressa sulla membrana plasmatica con fusione tra membrana e envelope) se presente, il virus sceglie una strategia d’entrata sennò un'altra, quindi facilita il processo, questa proteasi taglia la proteina spike (clivaggio) per attivare il processo d’entrata; se la proteasi è assente spike non può attivare il processo di fusione, si attiva endocitosi, nell’endosoma c’è la proteasi Catepsina L che taglia Spike, fusione tra membrana endosomiale e virale.

Assorbimento (HIV): interazione delle glicoproteine virali di HIV gp120 con lo specifico recettore cellulare CD4 e col co-recettore cellulare (CCR5 o CXCR4). Recettore cellulare può essere di natura proteica o glucidica e determina in buona parte la suscettibilità all’infezione.

Penetrazione

PENETRAZIONE: nei virus con envelope fusione tra membrana del virus e membrana della cellula ospite, trasmissione da cellula a cellula con elusione del SI (es. sincizi, formazione di ponti), endocitosi (e successiva fusione tra le membrane pH-dipendente); nei virus senza envelope endocitosi (e successivo attraversamento della membrana dell’endosoma o distruzione della stessa).

Esempio di virus che fondono la membrana con quella dell’ospite: herpes simplex, morbillo, HIV, SARS cov-2; esempio di virus con trasmissione da cellula a cellula: HIV, HSV-1, Vaccinia virus; virus con entrata tramite endocitosi: HCV, Morbillo, virus rabbia, influenza, HSV-1, HIV-1, SARS cov2. Esempio virus senza envelope mediante endocitosi attivata da abbassamento ph: capside di poliovirus va incontro a modificazioni conformazionali pH dipendenti che risultano nel rilascio del genoma nel citoplasma.

Liberazione/spogliazione

LIBERAZIONE/SPOGLIAZIONE: processo tramite cui l’acido nucleico virale è liberato dalla componente proteica che lo avvolge, trasportato nella sede opportuna affinché sia accessibile all’apparato biosintetico cellulare che ne può mediare l’espressione e la replicazione; virus a DNA compiono replicazione nucleare dove si trova l’RNApolDNAdip, eccezione Poxviridae che possiedono già l’enzima come proteina strutturale; virus a RNA replicazione citoplasmatica perché usano RNApolRNAdip, eccezioni Ortomixoviridae vanno nel nucleo dove interferiscono con Tx e maturazione trascritti cellulari, rubano il Cap ai messaggeri cellulari e lo attaccano ai messaggeri virale —> meccanismo CAP matching.

Sintesi macromolecolari

SINTESI MACROMOLECOLARI: per replicare il genoma, generare nuovi virus, sfruttare apparato cellulare biosintetico; entrambi i processi necessitano di proteine virali strutturali (fanno parte dei virioni) o non strutturali (non fanno parte dei virioni). Alcune proteine virali, insieme ad un certo numero di proteine cellulari (Host Factors), mediano la duplicazione del genoma virale in numerose copie.

Durante la replicazione possono avvenire MUTAZIONI dovute a scarso effetto delle polimerasi virali, meno fedele è la RNA pol più velocemente un virus muta, RNA pol RNA dipendente e retrotrascrittasi le meno fedeli. Più elevato è il tasso di mutazione più difficile sarà sviluppare farmaci contro il virus.

Effetto di mutazione è influenzare la funzionalità del genoma neosintetizzato, se tali genomi saranno assemblati e secreti si avranno particelle virali difettive; in alcuni casi le mutazioni sono compatibili con l’esplicazione del ciclo vitale e conferiscono nuove proprietà al virione (trofismo, resistenza farmaci, evasione del SI).

RIBAVIRINA: analogo nucleosidico che aumenta la non fedeltà della pol virali, aumenta il tasso di mutazioni quindi replicandosi vanno incontro ad eccessiva produzione di particelle virali difettive (error catastrophe), farmaco aspecifico, non ha funzionato contro SARS cov2 perché possiede un genoma molto grande con attività di proof reading. Non agisce su cellule ospiti, anche loro possiedono proof reading.

Assemblaggio

ASSEMBLAGGIO: proteine virali e cellulari impacchettano i genomi neosintetizzati, stadio finale prima del rilascio. Alcune proteine, anche dopo assemblaggio, devono subire taglio proteolitico mediante proteasi virali o cellulari (come la purina nel Golgi); envelope acquisito prima della fase successiva.

I componenti si auto-assemblano, seguono tappe in modo ordinato, i Protomeri sono pre-formati, assemblaggio del genoma inizia in un particolare locus genomico determinando il sito di impacchettamento. Eventuale pericapside acquisito in momenti diversi in base al tipo di virus. Se il genoma è segmentato una copia di ciascun segmento deve essere impacchettata correttamente. Anche nel corso di quest’ultimo processo possono verificarsi errori: virus difettivi o riassortiti (antigenic shift dei virus influenzali —> pandemie).

Rilascio

RILASCIO: nei virus con envelope rilascio con gemmazione attraverso la membrana plasmatica (HIV), rilascio mediante vescicole endocitiche (Herpes viruses); senza envelope si ha rilascio solo tramite morte cellulare dell’ospite (forse non sempre?).

Tipologie di infezioni virali

Tipologie di infezioni virali: La produttività consente esplicazione delle fasi del ciclo vitale con rilascio di virioni all’esterno, devono portarsi a compimento tutte le fasi; compimento di assorbimento, entrata, spogliazione il virus può entrare nella cellula che diventa suscettibile all’infezione perché il genoma è entrato e potenzialmente esprimibile; perché la cellula sia anche permissiva deve consentire replicazione genoma, assemblaggio particelle virali e rilascio virioni.

Suscettibilità: capacità della cellula a far entrare il virus, dipende da specifici recettori sulla superficie cellulare ma anche da altre proteine come le proteasi; Permissività: Capacità di replicare e completare il ciclo replicante con rilascio dei virioni. Sensibile e permissiva —> infezione PRODUTTIVA. Sensibile ma non permissiva —> infezione ABORTIVA o LATENTE (in seguito a diversi stimoli, il virus è in grado di iniziare un’infezione produttiva). Sensibile e permissiva in certe condizioni (es. in fase S) —> infezione RESTRITTIVA. Infezione abortiva e restrittiva possono risultare nell’eliminazione del virus o persistenza all’interno della cellula (che può portare a trasformazione cellulare).

Max Delbruck: Nobel nel 1969 per la cinetica di replicazione virale cioè la replicazione nel tempo. In laboratorio la replicazione e la crescita dei batteriofagi può essere evidenziata su capsule Petri; il fago viene mescolato con cellule batteriche in una soluzione di Agar chiamata top-agar; la soluzione viene versata sulla superficie in un terreno in una piastra Petri a 37 gradi; presenza di colonie o buchi se batteri lisati dal virus. I virus si moltiplicano “one step”; fase di eclisse: virus entrato nella cellula, il genoma...