Appunti microbiologia - 505 pagine

ANTIGA ALESSIA 2017

MICROBIOLOGIA

UniPD – prof. Calistri

PROGRAMMA

I parte: BATTERIOLOGIA

• Cenni storici

• Tassonomia dei batteri

• Tecniche microscopiche e colorazioni

• Caratteristiche strutturali della cellula batterica

• Nutrizione, riproduzione, metabolismo

• Elementi genetici trasponibili, modalità di scambio genico tra batteri (trasformazione, coniugazione)

• La spora

• Patogenesi batterica

• Disinfettanti, farmaci antimicrobici

• Il differenziamento

• Gli Archea

• Caratteristiche generali dei Funghi

II parte: VIROLOGIA

• Cenni storici

• Tassonomia dei virus

• Caratteristiche morfologiche di virus eucariotici e batterici

• Ciclo virale e strategia replicativa

• Patogenesi virale e rapporto virus-cellula ospite

• Coltivazione dei virus

• Diagnostica di laboratorio

• Modalità di scambio genico nei batteri mediato da virus (trasduzione)

• Monografie: selezionate tra i seguenti argomenti:

HIV, virus dell’influenza (umana, aviaria, suina), virus dell’herpes simplex, virus Ebola

COSA DOVRESTE AVER APPRESO:

❖ Cosa sono i microrganismi e perché vengono studiati.

❖ Quali sono le evidenze sperimentali che hanno portato alla scoperta dell’esistenza dei microrganismi ed al controllo

della loro moltiplicazione.

❖ Principi per definire un microrganismo l’agente eziologico di una malattia.

❖ Criteri impiegati per la classificazione dei batteri e loro significato.

❖ Tassonomia filogenetica e fenetica.

❖ Studio dei microrganismi: microscopia ottica ed elettronica.

❖ Funzione e struttura della parete.

❖ Caratteristiche della parete di Gram positivi, Gram negativi, Micobatteri (e relative implicazioni).

❖ Struttura e funzione delle appendici batteriche.

❖ Struttura e funzione delle SPE.

❖ Coltivazione dei batteri: isolamento in coltura pura, accrescimento ed identificazione.

❖ Metodi per la quantificazione della crescita batterica.

❖ La crescita batterica: come si verifica e fattori che la influenzano.

❖ Esempi di metabolismo microbico.

❖ Plasmidi, trasposoni, sequenze di inserzione: caratteristiche e significato biologico.

❖ Ricombinazione nei batteri (trasformazione e coniugazione).

❖ Modalità di controllo per la crescita dei microrganismi

❖ Caratteristiche generali e meccanismo d’azione degli antibiotici.

❖ Proprietà dei virus a DNA e ad RNA e strategie di replicazione del genoma

STORIA E SCOPO DELLA MICROBIOLOGIA

INTRODUZIONE ALLA MICROBIOLOGIA

La Microbiologia è la scienza che studia i microbi, organismi troppo piccoli per essere visti a occhio nudo (organismi

microscopici) e la loro attività.

Studio della loro forma, struttura, riproduzione, fisiologia, metabolismo e identificazione e comprende lo studio delle

attività microbiche che interessano l’uomo:

La distribuzione dei microrganismi in natura, le relazioni tra loro e con gli altri esseri viventi, gli effetti benefici e dannosi

che hanno sugli esseri umani, le modificazioni fisiche e chimiche che provocano nel loro ambiente (microbiologia

ambientale, medica, agraria, industriale, alimentare, veterinaria ...).

La categoria dei microrganismi comprende:

• Procarioti:

o Batteri.

• alcuni eucarioti microscopici:

o funghi (lieviti e muffe).

o protozoi.

o alcuni tipi di alghe.

• Virus.

Sono normalmente unicellulari, di piccole dimensioni e visibili solo al microscopio, ma possono anche essere microrganismi

che non hanno organizzazione cellulare, parassiti intracellulari obbligati e che, tecnicamente, potrebbero essere considerati

“non viventi” (mancano di organizzazione cellulare, VIRUS).

DIMENSIONI DI EUCARIOTI E PROCARIOTI

I microrganismi sono essenziali per la vita: sono fondamentali per l’equilibrio biologico sulla terra (necessari per i cicli

geochimici e la fertilizzazione del suolo, riciclano fattori nutritivi, zolfo e fosforo che possono essere usati dalle piante e

dagli animali). IL CICLO DELL’AZOTO

NEL SUOLO

Ma sono anche causa di malattie che colpiscono il regno vegetale e animale causa di degradazione degli alimenti.

Vengono utilizzati come modelli sperimentali per lo studio della genetica molecolare e della fisiologia cellulare, inoltre

come biomassa e produttori di sostanze utili all’uomo (farmaci, vaccini, vitamine ed altre molecole per uso industriale)

→ vettori per trasferimento ed espressione di transgeni (vaccini, terapia genica).

LA MICROBIOLOGIA E LE ALTRE DISCIPLINE SCIENTIFICHE

DIBATTITO SULL’ ORIGINE DELLA VITA - GENERAZIONE SPONTANEA (ABIOGENESI) O BIOGENESI

L’ipotesi che i microrganismi viventi derivino dalla materia inorganica, grazie ad una forza vitale, è detta “GENERAZIONE

SPONTANEA”.

L’ipotesi alternativa, che ha come principio che i microrganismi viventi derivino da una vita pre-esistente, si chiama

“BIOGENESI”.

Aristotele (384-322 a.C.) pensava che gli animali potessero originarsi spontaneamente dalle piante e dal terreno.

Fino al XVII secolo si pensava che gli organismi viventi potessero generarsi spontaneamente dalla materia in

decomposizione (abiogenesi).

Invece i microrganismi non si originano spontaneamente dalla materia inanimata, ma derivano da altri microrganismi

(biogenesi).

Esperimenti di Francesco Redi (1665):

Molti ritenevano che la carne esposta all’aria generasse larve di insetti.

Redi dimostrò con un semplice esperimento l’assurdità dell’assunto secondo il quale le larve si sviluppano sulla carne in

decomposizione. Risultati:

giare aperte → Comparsa di larve.

giare coperte con una garza → Nessuna larva.

In presenza della garza, nessun insetto poteva

penetrare all’interno della giara dimostra che lo

sviluppo di larve si verificava solo dove potevano

arrivare le mosche.

→ confutazione della teoria della generazione

spontanea.

Questa teoria convinse per quanto riguarda la biogenesi di insetti, ma non per quella dei microrganismi.

LA SCOPERTA DEL MONDO MICROBICO

Anton van Leeuwenhoek (1632-1723) era un commerciante di tessuti olandese con la passione delle lenti di ingrandimento.

Fu il primo a descrivere i batteri!

L’inizio delle sue osservazioni coincide con la fondazione della Royal Society il cui scopo era la diffusione e la pubblicazione

dei lavori scientifici.

IL MICROSCOPIO

1. Lente tra due piastre metalliche.

2. Messa a fuoco mediante viti.

3. Osservazione con lo strumento vicino all’occhio.

4. 50-300 ingrandimenti

Anton van Leeuwenhoek scopre gli animalcules (1676) e la loro incredibile abbondanza.

CONTROVERSIA SULLA GENERAZIONE SPONTANEA

Si innescò un dibattito sull’origine degli “animalcules”, che si prolungò per circa due secoli, inserendosi nella polemica sulla

teoria della generazione spontanea, accettata senza discussione.

Gli animalcules si formano spontaneamente da materia organica inerte, oppure si formano da semi o germi sempre presenti

nell’aria deposti da altri animalcules?

Generazione spontanea o Biogenesi

John Needham (1713-1781) nel 1749 rese noti i risultati dei suoi esperimenti: sottopose a bollitura

(sterilizzazione per riscaldamento, per uccidere tutte le forme di vita), per un breve periodo di

tempo, brodo di montone contenuto in un matraccio di vetro: con il tempo, il brodo si intorbidiva: i

risultati erano a favore della teoria della generazione spontanea.

Lazzaro Spallanzani nel 1776 dimostra che il brodo restava sterile se il recipiente veniva sigillato

prima di essere sottoposto a bollitura: gli animalcules quindi penetrano negli infusi attraverso l’aria.

Quando in seguito Joseph Priestly dimostrò che l’ossigeno è necessario alla vita, i sostenitori della teoria abiotica

obiettarono che nelle fiasche sigillate da Spallanzani il calore doveva aver alterato l’ossigeno nel brodo impedendo lo

sviluppo spontaneo dei microrganismi.

→ Critica dei difensori della generazione spontanea: in assenza di ossigeno la vita non si sviluppa!

GLI ESPERIMENTI DI PASTEUR

Pasteur (1822-1895) risolve la controversia sulla generazione spontanea dimostrando (1861) che i microrganismi sono

presenti nell’aria usando palloni a collo di cigno: anche se il recipiente non è sigillato, dopo il riscaldamento l’infuso rimane

sterile.

Esperimenti di Pasteur:

Liquido viene sterilizzato per riscaldamento.

L’aria poteva entrare, ma la polvere no: le pieghe del collo del

matraccio impedivano alla polvere (contenente i microbi) di

raggiungere il liquido, che rimaneva così sterile.

Questo dimostrava che la crescita era dovuta ad una contaminazione

esterna.

Se la fiasca veniva inclinata, in seguito al contatto del liquido con le

polveri depositate, si aveva crescita dei microrganismi

→ dimostra la presenza di microrganismi nell’aria!

ALTRI CONTRIBUTI DI PASTEUR

• Scopre la fermentazione come processo biologico studiando il fenomeno della vinificazione per conto di Napoleone

III. o ruolo dei microrganismi nella trasformazione della sostanza organica: i lieviti metabolizzano zuccheri

dell’uva sviluppo di alcool etilico (vino).

o i batteri che utilizzano l’alcool e producono acido acetico deteriorano il vino trasformandolo in aceto.

• Processo di pasteurizzazione: riscaldamento del vino in fermentazione ad una determinata temperatura (63°C per

mezz’ora, non sufficientemente caldo da fare evaporare l’alcool nel vino) arresta lo sviluppo di eventuali batteri

contaminanti dell’aria che potrebbero interferire con la fermentazione alcoolica.

GLI ESPERIMENTI DI TYNDALL

Tyndall ripete gli esperimenti di Pasteur, ma non ottiene gli stessi risultati con infusi da fieno secco: la bollitura non è più

sufficiente per “sterilizzare”, perciò riprendono forza i sostenitori della “generazione spontanea”.

Tyndall capisce che il fieno secco contiene spore (alcuni microrganismi sono sporigeni) che sono di gran lunga più resistenti

al calore dei microrganismi con i quali aveva condotto gli esperimenti fino ad allora.

→ tecnica tindalizzazione: riscaldamento, più volte, alternativamente a 20-37°C e 60-80°C: con la temperatura inferiore si

induce la trasformazione delle eventuali spore in forme vegetative e con il riscaldamento la distruzione di queste ultime.

LA SCOPERTA DEL RUOLO DEI MICRORGANISMI COME AGENTI INFETTIVI

Joseph Lister (metà ‘800), giovane chirurgo inglese, suggerisce la sterilizzazione degli strumenti chirurgici.

LA STORIA DI IGNATZ SEMMELWEIS (metà ‘800) E LA FEBBRE PUERPERALE: constatò che i decessi si triplicavano quando le

puerpere venivano esaminate dagli studenti di medicina; nei reparti di ostetricia, il lavarsi le mani, preveniva la trasmissione

della febbre puerperale da una paziente all’altra.

Incidenza della febbre puerperale (1842) presso Klin: Agosto 27%

Ottobre 20%

Dicembre 33%

Le levatrici che facevano tirocinio da Bartch vengono scambiate con gli studenti di Klin: Le morti seguono gli studenti.

MICROBI E MALATTIE

Robert Koch nel 1876 dimostra il ruolo causale (eziologico) di un microrganismo in una malattia:

Carbonchio= malattia comune all’uomo e ad alcuni animali: l’agente causale è Bacillus anthracis, microrganismo presente

nel sangue di tutti gli infettati: causa o risultato della malattia?

I postulati di Koch: utilizzati per determinare il legame che esiste tra

una malattia ed il microrganismo che si sospetta ne sia la causa:

1. L’agente causale deve essere presente in tutti i casi della

malattia di cui è ritenuto responsabile e deve essere invece

assente negli individui sani.

2. L’agente causale deve essere isolato dall’individuo affetto e,

posto in coltura, deve dare origine ad una popolazione

cellulare omogenea (una sola specie).

3. L’inoculo di una coltura pura dell’agente causale in individui

sani deve dare luogo alla comparsa della malattia di cui si

ritiene responsabile.

4. L’agente causale deve essere re-isolato dall’individuo

infettato sperimentalmente.

I postulati molecolari di Koch:

• Il gene implicato nella patogenicità o virulenza deve trovarsi in tutti i ceppi patogeni di una data specie ed essere

assente nelle specie non patogene.

• L’inattivazione selettiva del gene deve portare ad una diminuzione misurabile della patogenicità o virulenza.

• La complementazione o reversione della mutazione deve ripristinare il livello originario di patogenicità o virulenza.

Parimenti l’introduzione del gene in un ceppo non patogeno lo trasforma in patogeno.

I postulati di Koch vengono utilizzati per stabilire l’eziologia di tutti gli agenti infettivi, anche se:

– non tutti questi criteri possono venire sempre soddisfatti.

– alcuni agenti eziologici non possono essere coltivati.

La storia continua…

1677: Osservazione “animalcules“ (A. van Leeuwenhoek)

1796: Vaccinazione antivaiolosa (E. Jenner)

1850: Lavaggio mani per limitare la diffusione delle malattie (I. Semmelweis)

1861: Confutata la teoria della generazione spontanea (L. Pasteur)

1867: Antisepsi in chirurgia (J. Lister)

1882: Postulati di Koch (R. Koch)

1884: Colorazione di Gram (C. Gram)

1892: Scoperta virus (D. Iosifovich Ivanovski)

1899: Replicazione virale dipendente da cellula parassitata (M. Beijerinck)

1928: Scoperta Penicillina (A. Fleming)

1977: Sequenziamento DNA (W. Gilbert & F. Sanger)

1983: PCR (K. Mullis)

1995: Genoma batterico (H. influenzae)

CLASSIFICAZIONE DEI BATTERI

È la prima parte della tassonomia: classificazione, nomenclatura, identificazione.

TASSONOMIA

1. CLASSIFICAZIONE: organizzazione degli organismi in gruppi.

2. NOMENCLATURA: attribuzione di un nome al gruppo in conformità a regole scientifiche internazionali concordate.

3. IDENTIFICAZIONE: processo che permette l’inserimento di un microrganismo (che è stato isolato in vitro) in un

gruppo, in uno schema di classificazione già esistente.

→ A ciascun nome corrisponderà tutta una serie di caratteristiche.

CLASSIFICAZIONE

Lo schema di classificazione prevede diverse categorie o livelli: specie, genere, famiglia, ordine classe, phylum, dominio

(che sostituisce REGNO).

• Regno – dominio: (es. animale, vegetale, batterico…), comprende tutti i Phyla. Bacteria

• Phylum – Divisione: (es. vertebrati ...), costituito da più classi. Proteobacteria

• Classe: gruppo di ordini correlati. Gammaproteobacteria

• Ordine: gruppo di famiglie correlate. Pseudomonadales

• Famiglie: gruppo di generi correlati. Pseudomonadaceae

• Genere: gruppo di specie correlate. Pseudomonas

• Specie: il gruppo tassonomico più piccolo, rappresenta l’unità di base, fondamentale.

SONO Gruppi tassonomici ufficiali (dal più esteso al più ristretto).

CLASSIFICAZIONE FILOGENETICA: fissare le linee della discendenza (stabilire quali relazioni evolutive esistono tra gli

organismi). È un processo agevole con piante e animali, più difficile con i batteri.

CLASSIFICAZIONE FENETICA: basata sul grado di reciproca somiglianza e dei caratteri fenotipici in comune. Molto utile per

la classificazione batterica (non emerge sempre una comune evoluzione).

SPECIE BATTERICA: unità base della classificazione. Definita da:

• Caratteristiche morfologiche, fenotipo, dimensioni, modalità di movimento, proprietà tintoriali= reazioni alle

colorazioni (c. di Gram), crescita macroscopica.

• Caratteristiche biochimiche e nutrizionali, prodotti finali e altre informazioni biochimiche sui componenti cellulari

e sui metaboliti.

• Caratteristiche ecologiche.

• Composizione in basi del DNA, omologia e caratteristiche genetiche.

Viene denominata da un binomio in latino: genere (Escherichia, maiuscolo), seguito dalla specie (coli, minuscolo).

Ad esempio:

– Staphylococcus aureus: descrive la disposizione ragruppata delle cellule (staphylo- ) e il colore dorato delle colonie.

– Staphylococcus epidermidis: specifica la localizzazione predominante sull’epidermide.

– Escherichia coli conferisce credito allo scopritore, Theodor Escherich, e indica l’habitat del batterio, il colon.

Theodor Escherich, pediatra tedesco e batteriologo (1857-1911)

Dopo la prima citazione, i nomi scientifici possono essere abbreviati con la prima lettera del genere seguiti dall’epiteto

specifico: S. aureus, E. coli.

All’interno della specie viene definito il CEPPO.

CEPPO= coltura derivante da una colonia batterica (coltura pura).

CEPPO TIPO= ceppo rappresentante una specie, ceppo di riferimento (“ceppo standard”, collezione) per la classificazione.

A questo si confrontano i nuovi isolati per la loro classificazione.

Si parla anche di biotipo (BIOVAR), germovar, morfovar, serovar, fagovar, basandosi su differenze biochimiche, fisiologiche,

genetiche, morfologiche, sierologiche, di suscettibilità ai fagi.

TASSONOMIA MICROBICA

È la scienza della classificazione biologica → il suo scopo è capire il significato della diversità, della straordinaria varietà che

si riscontra nel mondo microbico.

Raprresenta una opportunità di catalogare e ordinare i microrganismi in gruppi a seconda delle loro reciproche somiglianze:

caratteristiche morfologiche, fisio-metaboliche, ecologiche e genetiche. Gli organismi possono essere collocati in uno dei

domini in base al tipo di cellula, al livello di organizzazione.

Impossibilità di classificare i batteri in base alle relazioni filogenetiche.

Il metodo classificativo “fenetico” riportato nel Manuale del Bergey (Bergey’s Manual of Sistematic Bacteriology) suddivide

i batteri in 4 DIVISIONI (Murray, 1968; Gibson-Murray, 1978) (o phylum), si basa sulle caratteristiche strutturali della PARETE

cellulare:

• GRACILICUTES: batteri con parete cellulare tipo Gram negativo, alcuni parassiti intracellulari obbligati.

• FIRMICUTES: batteri con pare