Appunti microbiologia - 505 pagine

SCHEMA ESAME BATTERIOLOGICO

TAMPONE FARINGEO

EMOCOLTURA

Il sangue è, per definizione, sterile perciò dovrebbe dare risultati negativi.

COLTURA DA LIQUIDO CEREBROSPINALE

RIPRODUZIONE E METABOLISMO

Prima della divisione, è necessaria la CRESCITA DELLA SECONDA CELLULA, compresa la formazione di tutto l’APPARATO per

la SINTESI PROTEICA.

→ le CONDIZIONI DI CRESCITA influenzano la replicazione, la divisione e il tempo necessario.

CRESCITA BATTERICA

Implica:

1. AUMENTO delle DIMENSIONI cellulari.

2. REPLICAZIONE del DNA.

3. DIVISIONE (aumento del numero di cellule della

popolazione).

È influenzata da:

• Disponibilità di ENERGIA E NUTRIENTI.

• FATTORI CHIMICO-FISICI ambientali.

• SPECIE.

• FASE DI CRESCITA in cui si trovano le cellule.

• Presenza di INIBITORI.

MATERIALE GENETICO BATTERICO

CROMOSOMA:

• Tra 0,5 e 13 Mb (4,6 Mb in E. coli).

• Alcuni batteri hanno più di 1 COPIA per cellula, in genere CIRCOLARE, raramente LINEARE (alcuni possiedono

cromosomi sia lineari che circolari (es. Agrobacterium tumefaciens), altri solo lineari (es. borrelia).

• INDISPENSABILE.

Esempi:

– Haemophilus influenzae 1,830,137 bp

– Campylobacter jejuni 1,641,481 bp

– Mycobacterium tuberculosis 4,115,291 bp

– Neisseria meningitidis 2,184,406 bp

– Escherichia coli 4,639,221 bp

PLASMIDI:

• CIRCOLARI, in alcuni batteri anche LINEARI (es. borrelia)

• Da POCHE COPIE (maggior parte) a MOLTE COPIE (es. borrelia).

I batteri con DNA circolare hanno risolto in partenza il problema delle ESTREMITÀ LIBERE (es. accorciamento ad ogni

replicazione), quelli che hanno DNA lineare hanno sviluppato dei MECCANISMI per il mantenimento delle estremità (es.

protezione dei telomeri mediante proteine TP o mediante estremità loop).

DIMENSIONI DEI GENOMI: diverse tra le specie, ma diverse anche tra microrganismi della stessa specie:

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Esempio: E. coli ceppo di riferimento ha 4,1x 10 pb, ma altri ceppi hanno dimensioni diverse, generalmente maggiori

(soprattutto quelli patogeni, geni in più che determinano fattori di patogenicità).

Funzioni dei geni:

• 20% METABOLISMO.

• 10% TRASPORTO.

• 10% REGOLAZIONE & REPLICAZIONE.

• 5% FUNZIONE STRUTTURALE.

• 5% SINTESI PROTEICA.

• 50% finalizzata a meccanismi di RESISTENZA e PATOGENICITÀ (oppure ancora sconosciuta).

Possiedono anche geni codificanti PROTEINE NON ESSENZIALI e DNA junk (non codificante).

Es. GENI ESSENZIALI E GENI NON ESSENZIALI IN MYCOPLASMA GENITALIUM

PERCENTUALE DI DNA NON CODIFICANTE IN ALCUNE SPECIE DI RIFERIMENTO.

GENOMA MINIMO: definito da porzione conservata + porzione specifica (di geni essenziali).

→ dimensione tale da permettere la sintesi in lab (es. sintesi di batteri artificiali).

Il cromosoma è ORGANIZZATO, CONDENSATO e SUPERAVVOLTO, per permettere il CONTENIMENTO nella cellula batterica

e la FUNZIONALITÀ LOGICA, grazie a proteine NAP associate al nucleoide (≡ istoni) e alle proteine SMC per il mantenimento

strutturale (es. formazione loop, formazione domini topologici → trascrizione indipendente).

Esempio PROTEINA MukB (SMC): forma a forbice, con zona centrale a cerniera, che permette alla proteina di assumere

varie conformazioni.

Funziona come DIMERO, agisce come proteina del citoscheletro che muove il DNA.

È coinvolta nella SEGREGAZIONE e CONDENSAZIONE dei cromosomi (lega sia FtsZ, che DNA).

IL GENOMA DI BORRELIA BURGDORFERI:

RIPRODUZIONE

Avviene per FISSIONE BINARIA:

1. Aumento massa cellulare e numero di ribosomi.

2. Replicazione del cromosoma batterico.

REPLICAZIONE DNA

È SEMICONSERVATIVA: ogni molecola di DNA che si genera contiene un filamento vecchio ed uno neo-sintetizzato.

Unica origine di replicazione = OriC.

ELICASI= enzima che srotola il doppio filamento.

PRIMASI= enzima che catalizza sintesi dei primers (filamento

discontinuo).

DNA POLIMERASI DNA DIPENDENTE= enzima che catalizza

sintesi del nuovo filamento in direzione 5’ → 3’.

Al momento della replicazione il DNA viene fissato alla membrana, per dare supporto rigido.

L’inizio della replicazione avviene in corrispondenza di una particolare sequenza di DNA (ORIGINE DI REPLICAZIONE), a

partire dalla quale la proteina iniziatrice DNA A comincia la denaturazione e recluta le DNA elicasi (DNA B e DNA loader)

che srotolano la doppia elica e formano la FORCA REPLICATIVA.

La DENATURAZIONE e la SINTESI sono bidirezionali (2 forcelle replicative

– intermedio ϴ (teta)).

Proteine SSB si legano ai filamenti e li stabilizzano.

Le DNA PRIMASI sintetizzano i corti PRIMER (FRAMMENTI DI OKAZAKI).

Le DNA POLIMERASI sintetizzano il FILAMENTO e allungano i PRIMER.

Le DNA GIRASI (topoisomerasi con caratteristiche particolari, bersaglio di antibiotici CHINOLONI) allentano la tensione

dovuta allo srotolamento dei filamenti.

La formazione delle “FORCELLE REPLICATIVE”, lo “SROTOLAMENTO” progressivo e la SEPARAZIONE delle nuove molecole

di DNA comportano l’intervento di una serie di fattori proteici fra cui le TOPOISOMERASI.

Le DNA LIGASI intervengono saldando le interruzioni rimaste tra i frammenti del filamento discontinuo.

La replicazione procede BIDIREZIONALMENTE, fino a raggiungere una SEQUENZA TERMINALE TerC circa a 180° rispetto ad

Ori:

Le sequenze terminali hanno più di un sito, perché devono terminare la replicazione le forcelle che arrivano da direzioni

opposte.

Sono siti di legame per le proteine Tus, direzionali/ polari, responsabili del blocco fisico della replicazione, in una

determinata direzione, interagendo con la DNA elicasi; una proteina Tus con polarità opposta arresterà la replicazione

nell’altra direzione.

Negli eubatteri:

• complesso proteico ORC:

o Riconosce sequenze all’origine di replicazione ricche in TA.

o Posiziona la polimerasi.

• Complesso pre-RC: elicasi, p. SSB, primasi.

L’apparato replicativo è localizzato al sito di formazione del setto di divisione cellulare; man mano che il DNA si replica,

l’origine si sposta verso i poli opposti della cellula.

FORMAZIONE DEL SETTO DI DIVISIONE (contemporaneamente a duplicazione e segregazione del DNA)

PROTEINE coinvolte nella formazione del setto di divisione sono state studiante su mutanti, osservandone i fenotipi:

FtsZ: mutanti temperatura sensibili → non avviene la formazione del setto e si osservano lunghi filamenti di cellule non

divise.

FtsA, FtsQ, FtsI: mutanti privi della sequenza codificante → blocco setto all’inizio della formazione, quando comincia ad

espandersi all’interno della cellula.

FtsK, FtsL, FtsN, FtsW: come sopra → effetto meno pronunciato.

MinC, MinD, MinE: mutanti → cellule figlie più piccole a causa della formazione non centrale del setto, con distribuzione

diseguale del DNA. SITI POTENZIALI DI DIVISIONE IN E. COLI

PROTEINE DEL DIVISOMA

Proteine politopiche = proteine di membrana multipasso.

FtsZ (presente in ca. 15'000 copie/ cellula) è una proteina G, che si associa in filamento e dopo l’idrolisi del GTP curva fino

a formare un anello, che avvolge 15-20 volte la cellula, nella posizione dove si formerà il setto di divisione e recluta le altre

proteine del divisoma che si associano alla membrana.

Le prime proteine ad assemblarsi all’anello di FtsZ sono FtsA e ZipA, seguite dalle alte proteine richieste per la formazione

del setto.

Le proteine MinC, MinD e MinE determinano la POSIZIONE di formazione del setto:

MinC: INIBITORE della formazione del setto, interagisce con la proteina FtsZ → no formazione anello Z e no reclutamento

altre proteine.

MinE: FATTORE DI SPECIFICITÀ TOPOLOGICA, fornisce a MinC la posizione di accumulo, limitando la sua attività alle zone

non centrali.

MinD: proteina che permette l’associazione delle altre Min alla membrana.

Nelle cellule normali (wild-type) MinC-D si accumula ai poli, spostandosi continuamente da un polo all’altro (ogni 10 s) →

formazione di GRADIENTE con concentrazione massima alle estremità e unico punto di concentrazione tale da permettere

la formazione del setto è lungo l’anello centrale.

Il movimento di MinC-D è coadiuvato da MinE, che forma un anello il quale depolimerizza continuamente MinC-D

associati alla membrana, lungo la zona centrale.

Azione combinata di MinC-D e MinE determina la formazione centrale del setto.

La formazione del setto comporta sintesi di nuova membrana citoplasmatica e parete cellulare.

Si formano invaginazioni della membrana = mesosomi, punti di ancoraggio del cromosoma:

• funzione di “guida” nella replicazione del materiale nucleare.

• partecipazione alla formazione di setti durante il processo di divisione della cellula nelle due cellule figlie.

ACCRESCIMENTO NEI BATTERI BASTONCELLARI

1. Accrescimento unipolare (bipolare?) fino al raddoppio della lunghezza della cellula (accrescimento di parete

discontinuo).

2. Formazione del setto in zona mediana.

L’organizzazione del materiale all’interno della cellula è importante per ottimizzare i tempi di divisione.

ACCRESCIMENTO NEI BATTERI COCCOIDI

1. Inizio sintesi a livello equatoriale (accrescimento di parete equatoriale).

2. Abbozzo del setto.

3. Setto completato: liberazione di enzimi autolitici per la separazione fisica

delle 2 cellule figlie.

SEGREGAZIONE DEL DNA

Lo spostamento delle origini di replicazione ai poli è determinata dalle proteine del citoscheletro dei batteri:

• PROTEINA MreB: omologo strutturale e funzionale dell’actina, responsabile della segregazione dei cromosomi alle

cellule figlie, la quale polimerizza e forma un’elica lungo il corpo del batterio (consumo ATP), la quale spinge le

origini complessate con le proteine SMC (MukB).

• PROTEINA ParM: omologo strutturale e funzionale dell’actina, responsabile della segregazione dei plasmidi.

• PROTEINA FtsZ: omologo funzionale della tubulina.

• CRESCENTINA: omologo funzionale dei filamenti intermedi, nelle cellule batteriche curve.

(meccanismo dei batteri non a bastoncello, meno studiato).

– Mutanti di E. coli che non producono la proteina MreB, perdono la forma cellulare e risultano sferiche.

– Mutanti che non producono la proteina FtsZ, non formano ssetti di divisione e originano cellule con morfologia

allungata.

– Mutanti di Caulobacter (bacilli ricurvi) che non producono la proteina crescentina, assumono forma bacillare

normale.

CICLO CELLULARE

CICLO CELLULARE= intervallo di tempo compreso tra due processi di divisione.

In Escherichia coli il ciclo cellulare può essere diviso in 3 periodi:

• PERIODO I (INIZIO): preparazione alla replicazione del cromosoma (periodo lungo in cellule a crescita lenta, può

essere a