Microbiologia enologica - Appunti COMPLETI di microbiologia enologica presi al computer durante le lezioni in presenza - 60 pagine

Microbiologia enologica

Informazioni generali

Chiave di accesso: ME_1819

Professor: Luca Cocolin, microbiologo

Ore totali: 60 di cui 16 di esercitazione

Gli esami propedeutici li ho dati. Per il laboratorio è utile comprare un pennarello vetro grafico con punta fine. Nell’esame ci saranno domande sull’esercitazione nel pre-test.

Programma

Lezioni frontali (44 ore)

• Lieviti
• Fermentazione alcolica
• Batteri lattici
• Fermentazione ML
• Batteri acetici
• Fermentazione spontanea ed utilizzo di starter
• Biotecnologia delle fermentazioni dei mosti
• Alterazioni dei vini

Esercitazioni (16 ore)

• Campionamento di lieviti e batteri lattici da uve e mosti
• Conta, isolamento ed osservazione
• Identificazione

Testo non necessario, bastano appunti.

Esame

Pre-test a risposta multipla (10 domande per 15 minuti di tempo) con massimo errori: 2.

Test scritto (o orale dipende da quanti saremo). Si terrà a Grugliasco.

–14 Marzo 2019 prima lezione

Introduzione

Il processo di trasformazione è guidato da dei microrganismi. C’è una prima fase in cui agiscono degli Eucarioti ed una seconda in cui si attivano dei procarioti. La prima è la fase caratterizzata dal processo fermentativo alcolico in cui i principali agenti sono i lieviti. La seconda fase è una fase che non sempre avviene (prevista per alcuni vini, soprattutto quelli che devono essere invecchiati ed affinati, e da evitare per altri come per esempio i vini bianchi) ed è quella che caratterizza il processo fermentativo malo-lattico.

Nella prima fase gli zuccheri sono trasformati in alcol (+CO₂ e altri composti), nella seconda fase l’acido malico si trasforma in acido lattico. Queste due fasi sono altamente impattanti sulle caratteristiche del prodotto: da un substrato molto zuccherino (il mosto contiene dai 200 g/L a 280 g/L di zuccheri) si forma un substrato alcolico che avrà un impatto sui microrganismi (alcol grande disinfettante non a caso). Inoltre la trasformazione da un acido all’altro è un processo che aiuta il microrganismo a resistere alle condizioni ambientali.

Un altro elemento molto impattante è il pH che nel mosto è su valori di 3.2-3.4 e sono molto limitanti per lo sviluppo dei MO che di norma vivono in pH neutri. Tra questi i più resistenti sono i batteri lattici. Sempre più spesso la divisione non è più temporale e le due fermentazioni avvengono insieme. Se tutto va bene, in 15 giorni si produce un vino che ha già fatto la FA e la FML.

È molto importante lo studio degli agenti che causano queste due: i lieviti e i batteri lattici (che tratteremo a fine corso).

I lieviti

Sono Eucarioti (cellule dotate di nucleo ben definito e separato) mentre nei procarioti il DNA è immerso nel citoplasma. Sono capaci di localizzare all’interno delle cellule determinate funzioni metaboliche: sono dotati di organelli (mancanti nei procarioti) che vanno visti come luoghi dove avvengono delle reazioni biochimiche specifiche. Il mitocondrio è il luogo deputato alla sintesi energetica. L’apparato di Golgi è deputato a reazioni di idrolisi. In una cellula procariotica avviene tutto nel citoplasma, l’unico organello dei procarioti sono i ribosomi che sintetizzano le proteine che sono fondamentali perché enzimi e hanno importanti funzioni strutturali.

I lieviti sono degli eucarioti particolari perché sono molto semplici essendo unicellulari. Sono eucarioti, ma essendo unicellulari possono essere trattati alla stessa stregua dei procarioti in molte delle procedure che si utilizzano al fine di contarli/coltivarli in laboratorio. Mi permette di contare il numero di lieviti presenti andando a contare le cellule! Cosa che non si può fare se ho degli organismi pluricellulari perché la singola cellula non mi rappresenta più l’individuo.

La moltiplicazione è per gemmazione (la cellula madre produce delle estroflessioni che poi si staccano ed è il modo più comune) o scissione binaria (tipica dei batteri: cellula madre che si allunga, si formano dei setti che la dividono in due) molto utilizzata dagli Schizosaccharomyces che si moltiplicano per Schizogenesi che è scissione binaria. Sono entrambe di tipo asessuale: medesimo corredo genetico tra madre e figlie. I lieviti a differenza dei batteri hanno anche possibilità di riprodursi sessualmente.

La riproduzione asessuale la fanno quando le condizioni sono ottimali: temperatura, cibo e altro. Questo perché come dispendio energetico conviene. Se le condizioni sono complicate vanno in riproduzione sessuale: prima fase di duplicazione del DNA (mitosi) seguita da dimezzamento durante la meiosi durante la quale può esserci il crossing over con possibile modifica del DNA → può portare dei vantaggi alla progenie. Alcuni lieviti non fermentano zuccheri e quindi non sempre sono positivi.

La classificazione tassonomica (difficilmente ci chiederà):

• Sottofamiglia schizosaccharomycetoideae
• Tutte le specie del genere Schizosaccharomyces
• Sottofamiglia Nadsonioideae
• Tutte le specie del genere Hanseniaspora e Saccharomycodes
• Sottofamiglia Saccharomycetoideae
• Specie del genere Dekkera, Pichia, Hansenula, Saccharomyces ecc
• Famiglia Cryptococcaceae
• Specie del genere Brettanomyces, Candida e Kloeckera

I lieviti possono essere sporigeni o non sporigeni che si sovrappone alla classificazione di lieviti perfetti od imperfetti. Quando parliamo di spora si deve associare alla capacità di riprodursi sessualmente. La spora dei lieviti è diversa da quella batterica. Essa rappresenta il gamete sessuale cioè quello che risulta da una riproduzione di tipo sessuale, deriva dalla meiosi che produce 4 gameti di segno sessuale diverso e nel nostro caso sono le spore. Dunque i lieviti sporigeni hanno 4 spore che possono tra di loro combinarsi per dare origine ad un organismo. La differenza tra i due è dunque evidente. Gli Asporigeni usano solo la gemmazione e sono definiti anche imperfetti mentre i lieviti sporigeni sono chiamati perfetti.

Esistono dei generi di lieviti nei quali vi è sia la forma perfetta che imperfetta. Di norma si scopre subito la forma imperfetta (perché le gemmazioni sono frequenti), ma se poi questi lieviti sottoposti a stress vanno in sporificazione sono entrambi. Pochi generi hanno dunque entrambe le forme. All’inizio del processo fermentativo ci sono lieviti del genere Kloeckera (forma a limone) che è la forma imperfetta del genere Hanseniaspora. Questi sono forti produttori di acido acetico. Brettanomyces e Dekkera hanno lo stesso rapporto dei precedenti due. Tra i lieviti sporigeni sono importanti gli spermophtoraceae e saccharomycetaceae. Le spore sono anche utili per distinguere i generi in base alla forma.

Identificare i lieviti è molto importante. Esso avviene perché hanno delle particolarità morfologiche evidenti. I saccharomyces hanno forma a sfera. Se dopo 3-4-5 giorni ci sono ancora cellule a limone vuol dire che il processo fermentativo non sta partendo. Qual è la metodologia più rapida per capire se il processo fermentativo sta andando bene? Osservazione a microscopio ottico! (Potrebbe chiederlo). Ci sono tanti fattori da controllare per capire quale lievito ci troviamo di fronte e sono elencati nelle slides.

I lieviti asporigeni si moltiplicano per gemmazione. Per identificarli si deve andare su aspetti fisiologici come la formazione di pigmenti, miceli, assimilazione di nitriti, capacità di fermentazione alcolica ed altri che trovo sulle slides. Perché sono così importanti? Perché sono gli attori dei processi di fermentazione alcolica. Considerata essa il principale processo nella formazione del vino, senz’altro i lieviti sono fondamentali. È più importante l’uva o il lievito? Per la caratterizzazione del vino? Secondo lui entrambe perché è vero che l’uva è fondamentale per la caratterizzazione, ma è anche indubbio che la scelta del processo fermentativo va ad imporre una caratterizzazione qualitativa importante. Concetto di vino standardizzato: non ha accezione negativa perché riuscire a fare un vino ogni anno con simili qualità e valori è un grande obiettivo anche delle grandi aziende. Questo può accadere solo grazie all’utilizzo di lieviti selezionati.

Sono importanti anche per la loro capacità alterativa: sono in grado di produrre importanti alterazioni sia nel mosto sia nel vino. L’elemento di differenziazione in questo caso è che gli alteranti del vino devono resistere all’etanolo. Kloeckera ed Hanseniaspora sono dei classici alteranti dei mosti perché producono acetato che non è possibile eliminare. Infine possono influenzare la qualità del vino con l’autolisi: alla fine della fermentazione, le cellule di saccharomyces si lisano. In questo momento rilasciano tutta una serie di elementi nutritivi che arricchiscono il vino in aminoacidi e vitamine. Questo arricchimento è particolarmente utile per innescare i processi malo-lattici perché favorisce i batteri lattici. Nel vino infatti ho pochissimi zuccheri e nutrienti (assorbiti dal lievito per nutrirsi), ma ho il malato. Essendo i lattici batteri molto esigenti, hanno bisogno della lisi dei lieviti.

Questo sulla carta, perché le fermentazioni malo-lattiche sono il processo che causa più problemi agli enologi. L’autolisi va favorita quando voglio la ML altrimenti uso lieviti con bassa capacità autolitica. La classificazione più utilizzata è quella che differenzia i lieviti enologici dai selvaggi. I primi hanno degli impatti positivi sul processo di trasformazione e sono molto frequentemente associati con tutti gli ambienti di cantina.

Le fonti sono 3: uve, cantina (colonizzano molto bene gli ambienti di cantina nonostante i lavaggi e possono rimanere per tantissimo tempo) e i lieviti starter che noi aggiungiamo. Durante il primo anno di cantina è molto complicato avere delle fermentazioni spontanee. I lieviti selvaggi una volta erano considerati negativi ed erano surclassati da lieviti enologici. Questo termine oggi fa riferimento al fatto che derivano dalle uve, ma come vederemo la diversità di lieviti sulle uve è molto elevata e può contemplare lieviti positivi e negativi. Tra questi troviamo Kloeckera, Hanseniaspora, Debaryomyces, Hansenulae Metschnikowia che sono tutti lieviti apiculati (a limone, immagine a basso a pagina precedente).

L’aggiunta di solforosa nel mosto seleziona i lieviti positivi e negativi perché i negativi sono più sensibili. Il 98% dei ceppi commerciali sono Saccharomyces. Negli ultimi 10 anni il mercato è stato arricchito di lieviti non-Saccharomyces che sono inoculati prima di Saccharomyces (fermentazioni scalari) perché da soli non completano la fermentazione. La differenza è che c’è tutto il contributo che il Saccharomyces non dà e il vino avrà note aromatiche più importanti, diverse. I lieviti più importanti da un punto di vista industriale sono appartenenti al genere Saccharomyces anche usati per la birrificazione e per il pane nel quale la CO₂ viene trattenuta e causa la lievitazione. Nel pane non trovo etanolo perché viene eliminato con la cottura.

Le due specie più importanti sono Cerevisiae e Bayanus che è un ibrido: lievito generato dalla coniugazione di due spore provenienti da lieviti diversi, in questo caso di Cerevisiae e Uvarum. Cerevisiae fermenta a 25 gradi, Bayanus preferisce temperature inferiori.

Cambiamenti nel mosto

L’acidità di un succo d’uva si trasmette a livello di vino inalterata perché durante le fermentazioni non vi è modificazioni di pH. Esso si modifica a seguito delle fermentazioni ML perché dall’acido malico si passa al lattato che è meno forte e dunque il pH si alza. In questo modo il mio vino diventa più suscettibile a variazioni microbiologiche.

L’aumento della temperatura si manifesta anche in ambito enologico perché i mosti diventano sempre più zuccherini e meno acidi, ciò comporta maggior quantità di etanolo. Inoltre i mosti hanno pH alti (3,5-3,6) che lasciano spazio ad alterazioni microbiche. L’acidità oggi è stata persa e dunque si stanno selezionando lieviti non Saccharomyces che abbiano capacità acidificante. Il cervesiae non ha capacità acidificante. I composti azotati vengono consumati nella fermentazione con macerazione, ma il lievito attacca comunque un minimo perché ha bisogno di azoto per moltiplicarsi e per fermentare e si può addirittura bloccare la fermentazione in caso non fosse sufficiente.

Non si vede la differenza perché lo 0,1 che viene utilizzato poi viene rilasciato nell’autolisi. Tutte le modifiche sono a carico dei lieviti.

Origini dei lieviti

Il Cerevisiae è isolato da uve arricchite. Sono isolati da uve o dalle cantine. I lieviti starter sono sintetizzati e si trovano in bustine. Le uve sono trasportatori di specie non Saccharomyces che è presente in una percentuale veramente bassa, di norma meno di 10-100 colonie per grammo di succo. Degli altri lieviti si trovano 100’000 cellule e dunque mascherano completamente Saccharomyces. Si usa allora l’arricchimento: non campiono direttamente le uve dopo l’ammostatura. Quel mosto lo metto a temperatura ottimale per Saccharomyces che cresce velocemente e quindi successivamente aumenta di numero fino a sufficienza per crescere sulle piastre senza essere mascherato. Anche se è molto poco è in grado di crescere velocissimo in presenza di zuccheri, producendo alcol che ha effetto inibente sulle altre popolazioni di lievito. È dunque difficile isolare saccharomyces dalle uve.

Lieviti da cantina

Presenti anche a livelli di igiene ottimali. L’igiene incide maggiormente sulla presenza dei batteri acetici. In questo ambito i lieviti formano delle comunità vere e proprie nel legno che dovrebbe essere sottoposto a rasatura che non può essere fatta tutti gli anni. Brettanomyces è un lievito molto bravo a colonizzare il legno. In questo caso l’unica cosa che si può fare è buttare la botte perché poi il vino saprà di Brett.

Lieviti batteri e funghi si possono insediare sulla bacca. In questo senso ci sono fattori biotici e abiotici che influenzano questo processo sulla superficie della bacca. Se una bacca è integra, la contaminazione microbica è molto bassa. Se è danneggiata la contaminazione che può portare in vinificazione è molto elevata. La superficie è molto molto povera di nutrienti, non ci sono zuccheri o composti azotati, c’è solo una sostanza cerosa che è la pruina (lipidica). Quando aumenta di volume possono esserci degli essudati specialmente nell’attacco del picciolo. Una bacca sana difficilmente raggiungerà una carica superiore a 10⁴, mentre se è danneggiata arriva anche a 10⁷. Il microbioma dipende dalla rottura. La rottura dipende da molti fattori:

• Insetti
• Pioggia
• Grandine
• Irrigazione
• Altitudine del vigneto
• Umidità
• Fertilizzazione
• Oidio, Peronospora
• Uccelli

Se ho bacche danneggiate crescono anche dei Saccharomyces, ma assieme avremo anche tanti non-Saccharomyces pericolosi. Alcune pratiche prevedono di disperdere lieviti nella fase di riposo vegetativo, ma molto raro.

Batteri

I più presenti sono bacilli, acetici e lattici.

Muffe

Aspergillus, Penicillum, Rhizopus, Mucor e Botrytis che può svilupparsi come muffa grigia (dannosa) o nobile (forma larvata): le ife penetrano nella bacca e la disidratano e va a produrre dopo pigiatura dei mostri molto zuccherini 350 g/L per dare dei vini molto dolci (i passiti di Pantelleria). Aspergillus produce micotossine che sono tossiche anche per l’uomo. Causano delle malattie croniche che possono portare anche alla comparsa di tumori al fegato. I funghi filamentosi sono aerobi stretti. L’ossigeno diminuisce nelle prime fasi del processo fermentativo. Quando lasciamo le bucce nel mosto esse salgono in superficie e se non mi occupo di questo “cappello” attraverso il rimontaggio possono essere colonizzate da Aspergillus e avere delle micotossine. Nel caso fossero presenti si devono fare dei tagli, ultimamente si sta provando ad eliminarle assorbendole. Le muffe sono responsabili dell’odore di tappo, ma lo sviluppo non avviene nella bottiglia tappata, ma nei processi di maturazione del sughero.

Uve danneggiate

Fuoriuscita di succo che va a lambire le colonie di MO che iniziano a svilupparsi producendo già sull’uva metaboliti indesiderati come acido acetico (ineliminabile). I lieviti Schizosaccharomyces causano la fermentazione malo-alcolica. Ciò comporta una deacidificazione, ma aumento del grado alcolico. I lieviti Killer producono delle tossine dette “tossine killer” che disattivano dei membri molto vicini a loro stessi. Alcuni Saccharomyces cerevisiae producono tossine contro altri Saccharomyces cerevisiae. Alcuni producono tossine contro lieviti alteranti come Brettanomyces. I batteri lattici sono sufficientemente sensibili alla solforosa. Per cui se si calcola bene questi non hanno alcuna possibilità. La fregatura è che si è sotto una forte pressione dell’opinione pubblica per diminuire la solforosa nel vino perché è un composto chimico.