Metodologie avanzate in analisi chimica-tossicologica

SECONDA PARTE

ANALIZZATORI A QUADRUPOLO

Questo analizzatore agisce da «filtro» di massa utilizzando la combinazione di un

potenziale elettrostatico e di un potenziale derivante da una radio frequenza.

La proprietà degli analizzatori a quadrupolo di separare le masse si basa sulla stabilità

o instabilità intrinseca dello ione all’interno dello strumento.

L’analizzatore a quadrupolo consiste di quattro poli o barre cilindriche disposte

parallelamente e collegate elettricamente a due a due a un generatore di potenziale

elettrostatico e ad un generatore di radiofrequenza. Si ottengono due campi elettrici

ortogonali, uno generato dalla corrente continua (DC) mentre l’altro oscilla a una data

radiofrequenza (RF). Risulta un campo quadrupolare.

Si dice campo quadrupolare un campo elettrico la cui dipendenza lineare dalle

coordinate spaziali è:

Questo campo si instaura tra quattro elettrodi di sezione cilindrica quando si applica

un potenziale composto da una componente continua (dc) U e una componente a

radiofrequenza (ac-rf) V.

Gli ioni escono dalla sorgente spinti da un debole potenziale di accelerazione (5-15

volts) ed entrano nell’analizzatore lungo l’asse longitudinale. Qui subiscono l’azione

dei due campi combinati (campo quadrupolare) e assumono traiettorie complesse. Il

risultato è che per un certo valore del rapporto Potenziale

elettrostatico/radiofrequenza solo alcuni ioni aventi un certo rapporto m/z riescono a

passare oltre il quadrupolo e arrivare al rivelatore; tutti gli altri si scaricano sulle barre

metalliche.

Variando sia il potenziale elettrostatico che la radiofrequenza del quadrupolo è

possibile selezionare gli ioni nell’intervallo di massa. Il risultato è creare una frequenza

di risonanza per ogni valore di m/z e gli ioni che risuonano alla frequenza del

quadrupolo sono in grado di attraversarlo e essere rilevati.

METODOLOGIE AVANZATE IN ANALISI CHIMICA-TECONOLOGICA

La scansione viene effettuata con la variazione

sistematica della forza di questi campi e il

conseguente cambiamento del valore di m/z

trasmesso attraverso l’analizzatore.

In questo modo i vari ioni con diverso valore m/z

vengono fatti giungere al rivelatore uno dopo l’altro,

registrando così l’intero spettro di massa.

Range: 30 – 1000 m/z

Velocita di scansione: 1 sec

La sensibilità dello strumento a quadrupolo è maggiore di quello a settore

magnetico/elettrostatico. La risoluzione del quadrupolo è minore di quella del

magnetico/elettrostatico (1 amu mentre quella del magnetico è 0,001 amu) ed è

costante in tutto l’arco di masse. La velocità di scansione del quadrupolo è maggiore

di quella del magnetico.

ANALIZZATORI A TRAPPOLA IONICA

È simile al quadrupolo ma non agisce da filtro. È costituita da un elettrodo anulare al

centro e da due coperchi sopra di esso. Usa campi generati da radiofrequenza (RF) e

da corrente continua (DC).

La trappola ionica si può immaginare come derivata dalla rotazione lungo l’asse z del

quadrupolo: la coppia di elettrodi A formerà un iperboloide continuo mentre gli

elettrodi B formeranno due iperboloidi separati, a tappo. La trappola ionica è un

sistema a tre elettrodi.

È costituita da un elettrodo centrale ad anello di sezione toroidale e da una coppia

d’elettrodi a calotta. All’elettrodo ad anello è applicato un potenziale variabile a

radiofrequenza mentre gli elettrodi a calotta sono collegati a terra.

METODOLOGIE AVANZATE IN ANALISI CHIMICA-TECONOLOGICA

Applicando all’elettrodo anulare un voltaggio RF di appropriata grandezza e frequenza

sono intrappolati ioni che coprono un vasto intervallo di massa. Gli ioni orbitano

all’interno della trappola finché non sono espulsi a causa della variazione del voltaggio

elettrico.

Quando si vuole registrare uno spettro di massa viene aumentata l’ampiezza del

voltaggio. Si ha come conseguenza che gli ioni a m/z sempre più elevato diventano

instabili (il loro moto all’interno della camera aumenta in ampiezza e li porta oltre i

confini fisici del sistema). A questo punto sono espulsi dalla trappola in una sequenza

di massa attraverso dei fori presenti sull’elettrodo terminale.

Lo spettro viene prodotto aumentando l’ampiezza del voltaggio; ioni con m/z sempre

più elevati diventano instabili e vengono espulsi dal sistema in una sequenza di massa

attraverso un foro applicato all’ elettrodo terminale, verso il rivelatore. Lo spettro di

massa dell’analita, in un selezionato range, è ottenuto dal cambiamento sequenziale

di frequenze, emettendo un solo rapporto m/z in un certo tempo.

Trattiene gli ioni al suo interno: applicando all’elettrodo anulare un voltaggio RF di

appropriata grandezza e frequenza sono intrappolati ioni che coprono un vasto

intervallo di massa. Variando il potenziale è quindi possibile far giungere al rivelatore

gli ioni con il rapporto m/z voluto.

METODOLOGIE AVANZATE IN ANALISI CHIMICA-TECONOLOGICA

In alternativa, i potenziali possono essere scelti in modo tale che solo ioni con un m/z

selezionato seguano una traiettoria stabile, rimanendo intrappolati, mentre altri con

differenti valori di m/z assumano traiettorie instabili e siano quindi espulsi dalla

trappola. Sullo ione intrappolato si possono eseguire ulteriori esperimenti.

Range: 30 – 2000 m/z.

Velocita di scansione: 1 sec.

Risoluzione unitaria (Dm=1).

C’è la possibilità di ridurre notevolmente il rumore di fondo. Lo ione d’interesse viene

trattenuto all’interno della trappola e ulteriormente frammentato, mediante un gas

respingente. Questo permette di eseguire analisi MS/MS. La funzionalità

dell’analizzatore a trappola ionica si basa sul parametro tempo, a differenza del

quadrupolo il cui lavoro di separazione avviene in base allo spazio.

ANALIZZATORI A RISONANZA CICLOTRONICA

Uno ione posto in un campo magnetico B è

sottoposto ad una forza che lo costringe ad una

traiettoria circolare. La frequenza di rotazione dello

ione su questa orbita è detta «frequenza ciclotronica

naturale» e dipende dal campo magnetico B e dal

rapporto m/z dello ione.

Se si sottopone lo ione al campo elettrico di una

radiofrequenza (rf), quando la rf è uguale alla

frequenza ciclotronica naturale, avverrà un

fenomeno di risonanza: lo ione assorbirà energia dal

campo rf e si muoverà in un percorso a spirale

(moto orbitale coerente).

Gli ioni in moto orbitale emettono un debole segnale (immagine) che viene raccolto

dalla piastra di rivelazione. La frequenza del segnale misurato alla piastra di

rivelazione è uguale alla frequenza orbitale dello ione e all’inverso del suo rapporto

m/z.

Il segnale totale, trasformato dal dominio del tempo al dominio delle frequenze dalla

trasformata di Fourier, genera lo spettro di massa. Se il vuoto è molto spinto, il moto

orbitale degli ioni può essere mantenuto per tempi relativamente lunghi e la frequenza

misurata numerose volte per una accuratezza molto elevata.

METODOLOGIE AVANZATE IN ANALISI CHIMICA-TECONOLOGICA

Gli strumenti FT-ICR sono in grado di produrre spettri di massa ad alta risoluzione e

alta sensibilità. Elevato costo strumentale e elevate spese di gestione del criomagnete

(richiede come fluidi criogenici azoto e elio liquidi).

ANALIZZATORI A TRASFORMATA DI FOURIER ORBITRAP

Nel 2005 è stato lanciato lo spettrometro di massa a trasformata di Fourier Orbitrap.

L’Orbitrap utilizza un campo elettrostatico per intrappolare gli ioni obbligandoli a

gravitare intorno a un elettrodo perno. Le oscillazioni degli ioni sono rilevate come

corrente immaginaria che può essere convertita in un valore di massa molto accurato

(risoluzione fino alla quinta decimale). Gli ioni iniettati nella trappola gravitano

intorno al perno centrale per attrazione

elettrostatica.

Gli ioni oscillano avanti e indietro con una

frequenza che è funzione della loro massa.

Le oscillazioni degli ioni sono rilevate come

corrente immaginaria e l’informazione è

convertita in massa attraverso la

trasformata di Fourier.

METODOLOGIE AVANZATE IN ANALISI CHIMICA-TECONOLOGICA

RIVELATORE Ogni ione generato nella sorgente e

separato dall’analizzatore arriva al

rivelatore per essere «contato».

Al rilevatore, per ogni ione, un

elettromoltiplicatore induce una cascata

di elettroni: una serie di dinodi moltiplica

il numero di elettroni (di un fattore 105)

prima che questi raggiungono l’anodo

dove si misura la corrente.

Ogni ione generato nella sorgente e separato dall’analizzatore arriva al rivelatore per

essere «contato».

Al rilevatore, per ogni ione, un elettromoltiplicatore induce una cascata di elettroni:

una serie di dinodi moltiplica il numero di elettroni (di un fattore 105) prima che questi

raggiungono l’anodo dove si misura la corrente. L’intensità della corrente generata è

proporzionale al numero di ioni (per ogni valore m/z). Si registra lo spettro di massa

normalizzato a 100.

SPETTROMATRIA DI MASSA

Calibrazione

Gli spettrometri di massa necessitano di calibrazione. Si usano standard con massa

esatta e nota per riconoscere l’esatto valore del campo a cui corrisponde un dato

valore di massa. Nei sistemi a E.I. i più comuni standard di calibrazione sono:

Perfluorokerosene (PFK);

 Perfluorotributilammina (PFTBA);



(Standard fluorurati hanno massa nominale prossima a19 uma).

La PFTBA (Perfluorotributilammina) genera ioni abbondanti con massa inferire a 219

m/z e segnali deboli sopra questo valore. La calibrazione viene eseguita su 5 ioni a m/z

69,131,219,264, 502 in condizioni di E.I. Si cerca un compromesso tra risoluzione e

sensibilità. Si visualizzano gli ioni in profilo, oltre che nella visualizzazione classica con

il baricentro dei picchi in istogramma.

METODOLOGIE AVANZATE IN ANALISI CHIMICA-TECONOLOGICA

Risoluzione

Esprime la capacità dell’analizzatore di distinguere due ioni di differente valore m/z.

Viene calcolata identificando la più piccola differenza di massa D m tra due picchi tra

di loro risolti.

Risoluzione= ∆m

Potere risolvente= m/∆m

Maggiore è il potere risolvente di uno spettrometro di massa, migliore è la sua

capacità di separare due picchi aventi masse simili.

Range di massa: indica il limite inferiore e superiore di m/z che può essere misurato

dall’analizzatore.

Velocità di scansione: esprime la velocità con la quale l’analizzatore compie la

scansione (secondo o millisecondo).

METODOLOGIE AVANZATE IN ANALISI CHIMICA-TECONOLOGICA

SPETTRO DI MASSA

Lo s