Appunti Genetica prof.ssa Papi

METODI PER LA RICERCA DI RIARRANGIAMENTI GENOMICI.

Una parte delle mutazioni è legata a riarrangiamenti del DNA ovvero a delezioni o più

frequentemente a duplicazioni. La PCR può essere utilizzata direttamente per evidenziare

delezioni complete se queste sono in omozigoti o emizigosi (nel maschio xy quando sono

organizzate sulla y o sulla x), sarà facile vederle perché non si amplifica nulla perché i miei

primer non hanno posto per attaccarsi. Se invece è in eterozigosi si ha un allele deleto e

l’altro no, si amplifica ma non si riesce a distinguere perché ad un certo punto si arriva alla

fase di plateau (all’inizio la quantità di prodotto è proporzionale alla quantità di templato,

in seguito la PCR raggiunge il plateau, e si avrà lo stesso significato che si ampli una o

due), quindi non si può utilizzare solo la PCR per identificare la delezione. La distrofia

muscolare di Duchenne ha una significativa parte delle varianti patogene che sono

delezioni o interogene o in due aree del gene (1 che comprende gli esoni dal 2 al 20 l’altra

dal 44 al 53). In genere vengono eseguite PCR multiplex, quindi con la stessa PCR

vengono amplificati più frammenti, che devono avere dimensioni diverse tra loro in modo

che si possano distinguere con elettroforesi su gel di agarosio. Si mette anche un esone

che non c’entra nell’intervallo come frammento di controllo (esone 60 ad esempio slide

10) dell’avvenuta amplificazione. Le delezioni si riscontrano in circa il 70% dei maschi

affetti di Duchenne. Questo metodo lo posso utilizzare solo sul bambino ma non sulla

mamma per capire se è portatrice. Un’altra malattia in cui si hanno delezioni in omozigosi:

atrofia muscolare spinale (SMA) malattia degenerativa in cui vengono colpiti i neuroni



del midollo spinale, i bambini nati normali intorno ai 6 mesi hanno difficoltà nei movimenti

volontari; il muscolo è normale ma non essendo innervato va incontro a ipotrofia. La

malattia è legata a 2 mutazioni nel gene SMN: ognuno di noi ha due copie di questo gene,

sono geni altamente omologhi, hanno la stessa sequenza differiscono solo per 8

nucleotidi, 5 di questi sono all’interno degli introni, per sapere il gene deleto bisogna

amplificare solo quello di interesse ovvero il gene SMN1. Il 95% dei pazienti sono

omozigoti per la delezione dell’esone 7. Si fa un amplificato di controllo. Nell’affetto manca

del tutto la banda che corrisponde all’esone 7 del gene SMN1. Si mette anche un controllo

negativo: acqua che contiene tutta la miscela di reazione ma manca il DNA, si fa per

essere sicuri che non ci sia stata contaminazione.

Per identificare i portatori di mutazione in eterozigosi il metodo attualmente utilizzato è

MLPA (amplificazione di sonde multiple dipendente dalla loro ligazione). Ho

un’amplificazione che avviene solo se c’è ligazione delle sonde si avrà una sonda divisa



in 2 parti con una parte in blu, che si va a ibridare con la sequenza di interesse, nella parte

terminale delle due sonde ho le sequenze dei primer che sono uguali per tutte le sonde

che utilizzo (sequenza del primer forward e sequenza del primer reverse); una parte

variabile (stuffer sequence) che serve solo a determinare la lunghezza di questa sonda

che non si ibrida a niente, ma che serve a identificare sulla base della loro lunghezza le

varie sonde. Queste sonde, che sono multiple all’interno della miscela di reazione,

ibridano su sequenze adiacenti della mia sequenza target. Sono simili al metodo OLA. Se

c’è una perfetta complementarietà, aggiungendo l’enzima ligasi, questo unirà le due

sonde e si avrà un’unica sonda che avrà da un lato il primer forward e dall’altro il reverse

e che si sarà legata proporzionalmente al DNA che mi funge da stampo (templato). Dopo lo

step di ibridazione e ligazione amplificherò queste sonde con una coppia universale di

primer che amplicano tutte le sonde che avevo ligate al mio DNA e ciascuna sonda inserita

nel kit ha una propria lunghezza così che riesco a stabilire e a separare esattamente ogni

singola sonda. L’amplificazione è in ogni caso proporzionale alle mie sonde di partenza

quindi avrò al termine, quando ho separato le sonde, un’idea della percentuale di partenza

del DNA (se era in 0 copie, 1 copia, 2 copie ecc). Ricapitolando: denaturiamo il DNA a

doppio filamento, a questo si legheranno le sonde che si legano a sequenze adiacenti,

vengono poi legate insieme dalla ligasi, mediante il calore si staccano le sonde dal DNA e

si amplificano tutte con la stessa copia di primer. Alla fine si avrà una serie di prodotti di

amplificati con diversa lunghezza che si andranno a separare e a quantificare mediante

l’utilizzo dell’elettroforesi capillare. Si avranno una serie di picchi che si confronteranno

con delle sonde di controllo che servono per normalizzare l’altezza dei picchi del mio

campione con quella dei controlli, una differenza di altezza del picco indica una variazione

del numero di copie. Questo si vede bene per quanto riguarda il numero di copie del

cromosoma x (maschio con una sola x picco piccolo, femmina con 2 x picco più alto, tripla

x picco molto alto). Le alterazioni in omozigosi si vedono per l’assenza di picchi specifici.

Si vedono anche in eterozigosi (altezza del picco è circa la metà), questa è la particolarità.

Quando la delezione interessa un singolo esone questo deve essere sempre sequenziato

prima di poter asserire che è deleto, perché l’ibridazione di queste sonde è altamente

specifica, quindi se c’è anche solo un mismatch la sonda non si lega. Se avessimo una

mutazione puntiforme nel sito di legame della sonda noi identificheremo quella mutazione

come delezione erroneamente. Questo non può avvenire quando la mutazione interessa

più esoni perché non è possibile che si abbiano più mutazioni puntiformi nel punto di

attacco delle sonde su più esoni.

SEQUENZIAMENTO NGS.

Il metodo di Sanger si sta progressivamente abbandonando, al giorno d’oggi viene

utilizzato come metodo di conferma, mentre vengono utilizzati principalmente i

sequenziamenti di nuova generazione. E’ una tecnica completamente diversa dal Sanger:

mentre in quest’ultimo si prende il DNA del paziente e si sequenzia un unico gene esone

per esone, ora invece sono disponibili sequenziatori in cui il sequenziamento avviene

parallelamente su molecole di DNA amplificate in modo clonale. Questi cloni sono separati

gli uni dagli altri nelle celle a flusso. Nel Sanger si ha una separazione elettroforetica di

frammentini che differiscono di una base, che abbiamo ottenuto mediante reazioni singole

di sequenziamento, mentre nell’NGS si hanno cicli ripetuti di estensione nucleotidiche ad

opera di una DNA polimerasi (ora non più usato) o cicli iterativi di ligazione di

oligonucleotidi. Questa procedura è parallela e massiva ovvero l’estensione dei nucleotidi

avviene su tutti questi cloni diversi di molecole di DNA amplificate in modo clonale quindi

si riesce a sequenziare da centinaia di megabasi fino a sequenziare genomi interi in

un’unica seduta analitica. E’ anche detto sequenziamento massivo in parallelo. Vengono

impiegate diverse tecnologie: quella del Solid era una delle migliori ma non ha avuto

seguito, Roche, Illumina e Ion Torrent (i più utilizzati). Stanno incominciando a prendere

piede, ma non in diagnostica, i sequenziatori di 3° generazione con cui si andranno a

sequenziare le singole molecole di DNA senza avere amplificazione. Tutti i sequenziatori

in commercio comunque hanno delle cose in comune: 1) devono essere preparate delle

librerie frammentando il DNA, questo deve essere riparato alle estremità e legato con

degli adattatori, l’amplificazione avviene in modo clonale su una superficie solida e

quando abbiamo la reazione di sequenziamento abbiamo la determinazione di ciascuna

base incorporata ad un certo momento per tutti i cloni che sto sequenziando. Si chiama

sequenziamento massivo in parallelo perché in ogni singolo istante vengono raccolte le

immagini di centinaia di milioni di reazioni. Se con il metodo Sanger si possono

sequenziare circa 500 nucleotidi, con l’NGS solo 150-200 nucleotidi. Quindi si sequenzia il

DNA costituito da cromosomi, introni, esoni ed è tutto spezzettato in frammentini di 200

paia di basi. Il workflow prevede come primo step la preparazione della libreria, poi

l’amplificazione clonale che per l’apparecchio 454 avviene attraverso una PCR di

emulsione, mentre per gli apparecchi Illumina avviene attraverso una PCR a ponte su un

supporto di vetro. La reazione di sequenziamento è diversa nel 454 perché si basta sul

pirosequenziamento, mentre il sequenziamento nell’Illumina è molto simile a quello

Sanger, utilizza dei nucleotidi terminatori che però hanno una terminazione reversibile (il

blocco può essere eliminato e la reazione continuare). Il DNA genomico quindi viene

frammentato, sonicando il DNA o utilizzando miscele di numerosi enzimi di trascrizione,

questi frammenti vengono ligati agli adattatori e il DNA con gli adattatori ligati viene

denaturato e a questo punto è pronto per le successive reazioni (ovvero la PCR).

La tecnologia Roche utilizza la PCR in emulsione: amplificazione di una singola molecola di

DNA in un comparto costituito da un’emulsione di acqua e olio. Si prepara il frammento di

DNA, si attaccano gli adattatori, questa libreria viene denaturata e diluita con una

concentrazione tale che le molecole di DNA vengono ibridate su una singola biglia, che

viene poi catturata in una gocciolina di emulsione acqua-olio, l’acqua contiene tutti i

reagenti perché si possa effettuare la PCR. In ogni gocciolina avviene la reazione di

amplificazione di una molecola di DNA legata a una biglia. Le biglie sono fatte in modo tale

che hanno degli oligonucleotidi sulla loro superficie che sono complementari (hanno la

sequenza complementare) all’oligonucleotide dell’adattatore. Quindi il DNA denaturato si

andrà ad attaccare alla biglia, vengono aggiunti i primer o si utilizza per la prima reazione

il primer costituito dall’adattatore presente sulla biglia e da questo momento si ha

l’estensione. Al ciclo successivo si avrà un’ulteriore denaturazione, quindi la molecola è

divisa in 2, i primer si attaccano alla superficie della gocciolina e tramite questi, gli

oligonucleotidi si attaccano alla biglia e riparte la successiva reazione di PCR. Alla fine si

avrà in un’unica gocciolina tante molecole di DNA tutte copie dell’unica molecola di DNA

che avevamo fatto entrare dentro la biglia. Il problema è quando si hanno due molecole di

DNA nella stessa biglia, significa che non h