Appunti Genetica prof.ssa Papi

Lezione 1: Imprinting

Maschio 100% sani. Il malato c'è solo nelle donne. Figli malati sono solo figli dei maschi. Il manifestarsi della malattia è legato al sesso. Questo è legato all’imprinting genomico. I geni soggetti a imprinting sono presenti in duplice copia ma solo uno dei due viene espresso, il materno o il paterno. Imprinting paterno: la copia che viene ereditata dal padre è silenziata e quindi non viene espressa (non viene trascritto né tradotto). Viene espressa la copia ereditata nel cromosoma della madre. Imprinting materno: la copia che viene ereditata dalla madre è silenziata e quindi non viene espressa.

Imprinting materno: funziona il gene situato nel cromosoma paterno e il soggetto sarà sano. Quando è trasmesso dal padre questo gene dovrebbe essere espresso ma il gene è mutato quindi si esprime la malattia. In entrambi i casi si ha un’alterazione della trascrizione. Branca della genetica che si occupa dei cambiamenti dell’espressione genica senza modificazioni della struttura del DNA epigenetica.

La causa dell’imprinting umano è dovuta a una metilazione del DNA che interessa le citosine in posizione 5 primo a livello delle sequenze CG (queste sequenze si trovano nel promotore). Più il promotore è metilato meno il gene viene trascritto fino a esserci un completo silenziamento (completa assenza di trascrizione nel gene). Le DNA metilasi inseriscono i gruppi metilici nel nuovo filamento.

Meccanismi di silenziamento genico

Come mai le citosine metilate silenziano il gene? Due spiegazioni: 1) inibiscono per ingombro meccanico il legame con i fattori di trascrizione, quindi questi fattori non si possono posizionare a livello del promotore; 2) possono chiamare inibitori specifici (MECB1 e MECB2) della trascrizione che si posizionano a livello del promotore che quindi non funziona più. Le mutazioni di MECB1 e MECB2 sono responsabili della malattia di Rett.

Quindi il promotore viene metilato dalla metilasi de novo poi la metilasi di mantenimento mantiene la metilazione sull’elica nascente copiando la metilazione del filamento che funge da stampo. Si può avere una demetilazione attiva quando mi serve che una regione venga altamente trascritta, da differenziare con la demitilazione passiva che determina la perdita progressiva di alcuni gruppi metilici. Alterazioni delle metiltransferasi: sindrome ICF.

C’è un imprinting tessuto-specifico che interessa le cellule somatiche, si mantiene per mitosi mediante la metiltrasferasi di mantenimento. C’è anche un imprinting specifico durante lo sviluppo embrionale, che interessa i gameti e si instaura ex novo dopo la meiosi ed è dato dalla metiltrasferasi de novo. Come si fa ad avere una metilazione de novo in base al sesso del feto?

Imprinting e ereditarietà

Lo zigote ha un mantenimento dell’imprinting per cui viene mantenuto l’imprinting sui geni ereditati da madre e padre, l’unica zona in cui viene cancellato è nelle cellule germinali primordiali. L’imprinting deve essere cancellato e riprogrammato a seconda del sesso (se il feto è maschio: imprinting maschile; se il feto è femmina: imprinting femminile), così che si possa ripetere questo processo all’infinito.

Come venne scoperto? Studio di un paziente portatore di una traslocazione bilanciata dei cromosomi 15 e 22 (due cromosomi che si scambiano un pezzettino), l’ha trasmessa in forma bilanciata ai figli, la figlia ha avuto un bambino con una traslocazione sbilanciata (gli mancava un pezzo di cromosoma 15 e aveva un pezzo in più del 22) che aveva sindrome di Angelman (ritardo mentale, ipotonia, crisi di riso incontrollato).

Il paziente ha figli con un altro coniuge, trasmette ad alcuni figli la traslocazione sbilanciata, in due trasmette lo stesso sbilanciamento cromosomico, ma hanno un’altra sindrome: sindrome di Prader-Willi (grave obesità, ipogonadismo, ritardo mentale). Abbiamo quindi 2 sindromi completamente diverse a seconda che sia ereditata dalla madre anziché dal padre.

Sindromi di Prader-Willi e Angelman

Spiegazione: i geni nella regione del cromosoma 15 sono soggetti a un imprinting materno e paterno sono espressi i geni della regione Prader-Willi sul cromosoma paterno e i geni della Angelman sul cromosoma materno; mentre il gene Angelman sul cromosoma paterno è silenziato per metilazione del promotore, analogamente sono silenziati i geni Prader-Willi sul cromosoma materno.

Quindi se sul cromosoma 15 manca la regione di questi geni sul cromosoma ereditato dal padre si ha la sindrome di PW perché manca il gene funzionalmente attivo che fa esprimere i geni della regione PW, che ci sono sull’altro cromosoma ma silenziati. Se la delezione è sul cromosoma materno i geni della regione PW sono normalmente espressi ma manca l’espressione dei geni localizzati nella regione A, quindi si ha la sindrome di A.

Difetti imprinting possono essere causati anche da un meccanismo di disomia: trasmissione delle due coppie di un cromosoma dallo stesso genitore. Eterodisomia: le due coppie ereditate da un unico genitore comprendono i due diversi cromosomi. Isodisomia: soggetto eredita due copie dello stesso cromosoma (lo stesso cromosoma due volte).

Come si possono formare queste disomie? Spiegazione: generalmente sono causate dal "recupero dalla trisomia" che si verifica quando un feto nasce con 3 cromosomi, andrebbe incontro a morte, nelle prime divisioni elimina casualmente un cromosoma; oppure un’altra spiegazione è il "recupero dalla monosomia" ovvero un feto nasce con un cromosoma, andrebbe incontro a morte, duplica l’unico cromosoma che ha per ritornare alla euploidia.

Se questi recuperi interessano un cromosoma sottoposto a imprinting possono causare malattie da imprinting. Nullisomia: nell’ovocita assenza di cromosoma 15, uno nello spermatozoo monosomia → recupero dalla monosomia. Non tutti i cromosomi sono soggetti ad imprinting solo i cromosomi 15, 11, 7, 6, 14.

Lezione 3: Metodi per la ricerca di mutazioni

La ricerca delle mutazioni germinali si fa utilizzando metodi diretti quindi si va direttamente a cercare la mutazione responsabile della malattia. La prima fase della ricerca delle mutazioni è sempre l’amplificazione del DNA che si ottiene attraverso la PCR.

Tipi di PCR

• Hot start PCR: la taq polimerasi si attiva solo nel momento della denaturazione (alte temperature): anticorpi si distaccano e permettono alla taq polimerasi di funzionare. Se i nostri 2 primer hanno anche solo poche basi di complementarietà, formano DNA a doppio filamento con poche basi a singolo filamento. La taq polimerasi allunga il filamento, i due primer si attaccano e formano i tridimeri.
• Touch down PCR: si cambia progressivamente la temperatura di annealing dei primer. La prima temperatura sarà molto alta in modo che si attacchi meno primer al DNA ma quando si attacca siamo sicuri che questo sia altamente specifico. Poi si comincia a ridurre la temperatura in modo da ottenere una maggior amplificazione.
• Nested PCR: doppia PCR che si usa per ottenere una buona quantità di DNA quando la quantità del DNA di partenza è estremamente bassa. Si fa una prima PCR e si utilizza l’amplificato di questa prima PCR come templato della seconda PCR. Si devono utilizzare del primer interni a quelli utilizzati nella prima amplificazione. Le possibilità di inquinamento sono molto alte.

Una volta ottenuto il DNA amplificato bisogna separarlo elettroforesi. Si può fare su gel di agarosio o di poliacrilammide (maggiore definizione, si usa quando si deve distinguere due frammenti di DNA che differiscono di poche basi) e con elettroforesi capillare (in capillare è presente un derivato dell’acrilammide, il DNA migra all’interno) utilizzata nei sequenziatori automatici che funzionano anche come un analizzatore di frammenti (primer collegato con un fluorocromo).

Identificazione di mutazioni note

1) Analisi di restrizione. Gli enzimi di restrizione tagliano le molecole di DNA riducendole in frammenti più piccoli, in un processo chiamato digestione da restrizione. Questi enzimi spezzano l’ossatura del DNA rompendo i legami tra il gruppo ossidrile all’estremità 3' di un nucleotide e il gruppo fosfato all’estremità 5' del nucleotide successivo.

Esistono numerosi enzimi di restrizione, ciascuno dei quali taglia il DNA a livello di una specifica sequenza di basi (normalmente 4-6 basi), definita sequenza di riconoscimento o sito di restrizione. Se cambia anche una sola base, l’enzima non taglia più.

Per esempio, l’enzima EcoRI taglia il DNA soltanto quando incontra la seguente sequenza di basi appaiate nella doppia elica del DNA: la sequenza è la stessa su entrambi i filamenti: è un palindromo. La maggior parte degli altri enzimi di restrizione lavora riconoscendo sequenze palindrome e operando un taglio «obliquo» nel filamento di DNA. Questi tagli «sfalsati» sono fondamentali per ottenere DNA ricombinante.

Gli enzimi di restrizione possono venire isolati ed estratti dalle cellule che li producono per essere utilizzati in laboratorio come se fossero delle «forbici biochimiche». Infatti il DNA di qualsiasi organismo, se incubato in provetta con un enzima di restrizione, verrà tagliato in tutti i punti in cui è presente il relativo sito di restrizione (cioè una sequenza di basi specifica).

Oggi disponiamo di centinaia di enzimi di restrizione, purificati a partire da vari microrganismi. Perciò uno stesso campione di DNA può venire tagliato da più enzimi che riconoscono siti di restrizione diversi. In questo modo i biologi molecolari possono scegliere con precisione chirurgica dove tagliare un campione di DNA optando tra molti siti diversi. I tratti di DNA che si ottengono sono chiamati frammenti di restrizione.

Se una mutazione crea o abolisce un sito di restrizione si può vedere facilmente (ed in modo economico) facendo la PCR, amplificando il campione e digerendo l’amplificato con il particolare enzima di restrizione. In seguito si fa un’elettroforesi (in genere su agarosio), si colora con etidio bromuro (colorante fluorescente altamente mutageno che si lega al DNA a doppio filamento, quindi riesce a identificare il DNA sul gel di agarosio) e si guarda la differenza delle basi.

Se la mutazione crea un sito di taglio si avrà una banda in più rispetto al Wild Type, se invece la abolisce si avrà una banda in meno rispetto al WT. Si può sapere anche se il soggetto è omozigote o eterozigote per la mutazione. Se la mutazione non altera un sito di restrizione si può creare artificialmente inserendo il sito di restrizione con uno dei primer. Il primer viene modificato in modo che una volta che inizia ad amplificare la sequenza si venga a creare un sito di restrizione nell’amplimero normale mentre questo sito non c’è quando si amplifica l’allele mutato o viceversa.

Si inserisce o si toglie un sito di restrizione. È una tecnica ultrasensibile e può essere utilizzata per identificare mutazioni che riguardino soltanto una parte degli alleli, come spesso avviene nelle neoplasie. Come si fa: ho la sequenza dell’introne e dell’esone, inserisco un primer che non è complementare al punto in cui è presente la mutazione, che attaccato alla sequenza normale mi definisce un sito di taglio per l’enzima. Il primer e il DNA non sono perfettamente allineati ma non importa perché è situato in una posizione tale che l’assenza di appaiamento di una base non impedisce che parta la PCR. In questo modo si avrà nell’allele WT un prodotto digerito mentre nell’allele mutato il prodotto non sarà digerito.

Tecniche per mutazioni specifiche

Quando si hanno poche mutazioni si può utilizzare:

2) ASO (tecnica che utilizza oligonucleotidi allele specifici). Ho due oligonucleotidi, tipo primer ma che uso come sonde, uno di questi si andrà a legare all’allele WT, l’altro sarà specifico per l’allele mutato. Gli oligonucleotidi sono fatti in modo tale che il mismatch (mancato appaiamento delle basi nel DNA che causa la mutazione) sia localizzato nella parte centrale dell’oligonucleotide. L’oligonucleotide si lega all’allele mutato con un mismatch e all’allele WT normalmente. Le sonde si ibridano solo ed esclusivamente con la sequenza che è perfettamente complementare.

Test utilizzato per malattie in cui una o poche mutazioni sono responsabili della malattia, e quando ci sono tanti test da fare (es. utilizzato in Sardegna per la ricerca delle mutazioni della beta talassemia). Come si fa: si amplifica il DNA in PCR, si mette DNA amplifico su una membrana (filtro), si immobilizza, si fa ibridare il DNA con gli oligonucleotidi nella membrana, si fanno più repliche dello stesso filtro (1 si ibrida con la sonda del WT l’altro con la sonda specifica per il mutato), si fanno poi dei lavaggi.

Nel filtro ibridato con oligonucleotide specifico per il WT si può avere un segnale forte se il genotipo è omozigote WT, non si avrà segnale se il genotipo è omozigote mutato e si avrà segnale leggero se è eterozigote. Nel filtro ibridato con oligonucleotide specifico per la mutazione avviene lo stesso. Si fanno due ibridazioni perché è solo dal confronto dei due che si riesce a capire se un soggetto è omozigote o eterozigote c’è bisogno del controllo della sonda normale. Si lasciano sempre dei pozzetti in cui non c’è il DNA che ci servono come controllo negativo (è la prova che non c’è stata ibridazione aspecifica).

Si inseriscono anche dei controlli positivi per le mutazioni (nella slide 35: la mutazione 1-5 il K+ è nel pozzetto C8; A11 è presente nella sonda mutata ma non in quella normale WT quindi il soggetto è un omozigote mutato; A4 è presente in entrambi i pozzetti quindi il soggetto è un eterozigote mutato). In questo test il DNA è fisso su una membrana e utilizziamo le sonde, mentre nel Reverse Dot blot abbiamo le sonde fissate su una membrana e utilizziamo l’amplificato di PCR come sonda. Come si fa: abbiamo una membrana che contiene tutte le sonde corrispondenti alle varie mutazioni e i WT, amplifichiamo il DNA e lo facciamo legare alla biotina, utilizziamo l’amplificato come sonda, viene fatto reagire con la nitrocellulosa, la rivelazione avviene mediante streptavidina coniugata a fosfatasi alcalina e viene prodotto un precipitato viola quando c’è l’unione con il nostro DNA amplificato.

Questa metodica si applica principalmente per vedere le mutazioni della fibrosi cistica. Questa è causata da tante mutazioni, ma prevalentemente da una (F508del), che viene ricercata attraverso questo metodo. Sono due striscine: la prima ricerca 19 mutazioni, l’altra 17, in queste sono spottate le varie mutazioni e i corrispettivi normali, a seconda di dove abbiamo l’ibridazione si capisce di che mutazione si tratta. La fibrosi cistica è una malattia autosomica recessiva quindi si hanno due mutazioni che si trovano sui due alleli, materno e paterno, quindi la dimostrazione prevede di trovare una mutazione nell’allele del padre e una in quello della madre (potrebbero essere anche entrambe sullo stesso allele).

3) OLA (ligazione degli oligonucleotidi). Si costruiscono tre oligonucleotidi (3 sonde): una sonda allelica è complementare all’allele WT e termina esattamente nel punto di mutazione (nella base che diventa mutata); la sonda comune si va ad ibridare dalla base successiva a quella mutata (primer complementare a questa sequenza WT finisce con una G, complementare alla C che è a sua volta complementare all’allele mutato); l’altra sonda allelica è complementare all’allele mutato e finisce con A.

Quindi si fa un’ibridazione: la sonda mutata andrà ad ibridare con l’allele mutato, la sonda WT con il WT e la sonda comune si legherà. Poi avviene la ligazione: queste sonde ibridate, non ancora legate tra di loro, se vi è un allineamento perfetto (lega solo quando vi è una perfetta complementarietà delle basi e i due frammenti sono allineati) la ligasi determina una ligazione di queste sonde. Se ci fosse un mismatch non si avrebbe la ligazione perché il nucleotide non sarebbe perfettamente complementare.

La sonda comune è coniugata con un colorante fluorescente e le dimensioni delle sonde alleliche variano con l’aggiunta di un nucleotide in coda che permettono di distinguere le dimensioni di questi frammenti. Si estrae il DNA, si fa una PCR in cui si amplificano contemporaneamente tanti frammenti di DNA, il DNA amplificato viene ibridato con le sonde, avviene poi la ligazione e questi prodotti vengono poi separati con un’elettroforesi capillare corsa sul sequenziatore. Ogni volta che il mio frammento migra avrò il raggio laser che eccita il colorante, lo manda al detector e il risultato verrà visualizzato al computer.

Si vedono dei picchi per ciascuna mutazione che si va a vedere. Per ciascuna mutazione si possono avere le 3 diverse possibilità: soggetto omozigote WT, soggetto omozigote per la mutazione, eterozigote (dimensioni del picco più basse rispetto all’omozigote). Utilizzando fluorocromi diversi legati alla sonda comune è possibile vedere fino a 36 mutazioni. Esempi: paziente con mutazione di splicing deltaF508, il secondo paziente è omozigote perché non ha in vicinanza il picco dell’allele WT, inoltre il picco è alto.

4) ARMS (amplificazione allele-specifica). Si utilizzano primer diversi complementari uno alla mutazione, uno al WT e un primer in comune, in reazioni separate. Se il primer si lega perfettamente, il DNA viene amplificato, altrimenti no.