Appunti di Genetica II

Analisi delle mutazioni nelle regioni regolative e dei polimorfismi associati alla variante texel

Allora possiamo avere mutazioni nelle regioni regolative, cerchiamo polimorfismi associabili alla variante texel; di 20 polimorfismi disponibili, 18 li scartiamo, in quanto presenti in altre razze. Un polimorfismo si trova a 20kbasi dal promotore, ma non è esclusivo delle texel, mentre l'altro polimorfismo è al 99% presente solo nelle texel, e questo polimorfismo è relativo alle sequenze consensus dei microRNA.

Cosa ha creato questo SNP 3' utr? Una sequenza target illegittima: questo SNP ha creato una regione target per il microRNA illegittima sul gene della miostatina, quindi la miostatina è stata silenziata incorrettamente, portando alla morfologia texel, grande carnosità.

Formulata l'ipotesi, come la verifichiamo? Cerchiamo i microRNA complementari al sito creato, in particolari quelli espressi nel tessuto muscolare: troviamo questo miRNA1, espresso nel muscolo e conservato nelle specie. Facciamo infine la prova del nove, tramite utilizzo.

di gene reporter: creiamo un gene reporter, mettiamo nel 3' utr la sequenza target dell'miRNA che abbiamo trovato, e vediamo se una pecora viene silenziata. Vediamo che dove abbiamo una A nella sequenza della luciferasi, essa viene silenziata, ma solo se in presenza del miRNA1, altrimenti non abbiamo differenza: allora il miRNA1 silenzia il costrutto con la variazione in A, ma non quello con la variante G, come vediamo nello schema a destra. Quindi, abbiamo capito quanto succede. (nel disegno a destra, pcDNA3 è il vettore vuoto, è il confronto senza miRNA1) (HSV-TK è il promotore per far esprimere miRNA1). La mutazione crea un sito riconosciuto dal miRNA1, che ne causa un blocco della miostatina, ne deriva ipertrofia muscolare, con successiva selezione da parte dell'uomo. Una selezione positiva da parte dell'uomo in tempi recenti implica che l'aplotipo texel sia unico, in quanto non c'è stato il tempo per la formazione di altri.

aplotipi texel. Poiché tutto l’aplotipo é conservato, é anche difficile capire qual è la variante che effettivamente controlla il carattere, e quali regioni invece sono trascinate passivamente, venendo conservate; dobbiamo sempre trovare altre scremature, infatti abbiamo cercato se altri SNP fossero presenti in altre razze non texel.

Ma un’altra mutazione tipica dei miRNA implica il riconoscimento di altri geni, e sembra essere la causa di alcune sordità nell’uomo. Abbiamo famiglie con sordità, e per prima cosa dobbiamo escludere l’influenza di geni già noti.

Possiamo fare uno studio di associazione l'approccio genetico é interrogare tutti gli SNP gene wide: noti nel genoma sordi e nel genoma dei controlli, quindi ci domandiamo: questo SNP é più presente nei sordi che nel controllo? Sì, allora facciamo controlli più efficaci sugli alberi genealogici: dove vediamo che il carattere si

trasmette nella famiglia, e vediamo che gli elementi esterni alla famiglia non presentano lo SNP. Questo miRNA96 può quindi causare la sordità, e come capiamo il suo meccanismo? cerchiamo se esistono mRNA che nel loro 3' utr possiedono sequenze complementari a questo miRNA96 mutato, questo miRNA96 può silenziare geni incorretti, e perdere la corretta silenziazione. troviamo quindi 20 geni papabili con sequenze target biotitiche complementari, come capiamo se sono diventati target effettivi? facciamo una validazione con geni reporter come prima: usiamo la luciferasi, mettiamo al posto della sua sequenza a 3', il 3' utr dei geni complementari al miRNA96, e vediamo cosa succede: poiché alcuni vengono repressi effettivamente dal miRNA, allora effettivamente questo può avere un ruolo.

Lezione di Genetica II, di Lorenzo Di Palmaa

Come studiare la struttura del gene: il sistema crispr/cas9

Il primo problema dello studio è riuscire a trovare

la sequenza genica da sostituire o modificare. Il sistema crispr/cas9 presentava grande facilità, introducendo un taglio a doppio filamento nella sequenza desiderata. Inserito questo taglio, le due sequenze possono venir tagliate e poi riparate, con modificazioni nucleotidiche nella riparazione, si distrugge la continuità rottura del gene, sistema low-fidelity, si inseriscono modificazioni. Se noi diamo una regione omologa al taglio, la sequenza taglio+regione omologa, abbiamo la sostituzione della regione del taglio con la mia regione, quindi abbiamo o possiamo inserire il nostro gene, o possiamo avere un'intera nuova gene correction, regione. Il processo è molto più efficiente e si possono modificare più geni contemporaneamente, distruggere geni, operare knockout multipli. La prima tappa è stata scoprire, sequenziando il genoma di alcuni archaea, la presenza di sequenze ripetute di basi, interposte da regioni diverse; successivamentesiscoprì che queste sequenze erano ripetute e conservate fra specie, allora avevano un ruolo regolativo. Queste sequenze separative che rendevano diverse le regioni erano sequenze virali o plasmidi tipici di quel batterio in cui venivano trovate, quindi questo sistema Crispr era un sistema immunitario. In Francia si studiarono diversi ceppi di y. pestis, e presentavano spacer molto ripetuti, che si capì essere ceppi extracromosomici. A Strasburgo si lavorava con batteri acido lattici per la fermentazioni, che potevano essere infettati da virus; si accorse che vi era una correlazione tra e resistenza, più maggiore le spacers spacers resistenze. Fagi con modificazioni negli erano capaci di infettare i batteri, come se le spacers modificazioni in esse permettessero loro di bypassare la resistenza. Contemporaneamente si sono identificate le proteine crispr-cas9, cs9 a cas7, sistema immunitario batterico. Come prova del 9 si è capito che il target del sistema battericoè proprio il DNA, quindi si è tentato di ingegnerizzate il sistema, per capire se è capace di tagliare il DNA di interesse a piacimento. Vediamo le unità ripetute, in rosa, che essendo palindromiche degli erpin. Gli sono sequenze spacers di colore diverso, che si trovano nelle unità ripetute, a seconda delle infezioni che il ceppo ha ricevuto. Immaginiamo una prima infezione del virus al ceppo batterico: il virus inserisce il proprio DNA nel batterio, e questo DNA viene frammentato dagli enzimi Casp, che lo inseriscono nel locus crispr. Ad una seconda infezione, il locus crispr viene costantemente trascritto nel preloscuscrisprRNA; quando il virus infetta il suo DNA, crispr e cas9 riconoscono per complementarietà il DNA e lo tagliano. Il complesso Crispr-cas9 permette di tagliare il DNA solo per una sequenza PAM, di poche paia di basi, nelle prossimità; la sequenza PAM permette di riconoscere il vero DNA esogeno, dal frammento nel genoma, altrimenti.si rischierebbe di tagliare il genoma nelle prossimità dello spacer. Possiamo inserire tutti gli elementi del sistema in un unico vettore, e vediamo come il vettore tiene il guideRNA, legato al trackRNA, noi cloniamo le sequenze di basi in corrispondenza della sequenza grigia 19-20 basi complementari alla sequenza target, dove vogliamo che tagli; esiste nello stesso vettore la cas9, sotto controllo del promotore; abbiamo anche il GFP che permette la selezione. Una volta che il sistema raggiunge la sequenza target: - la rottura a doppio filamento introduce piccole sezioni, mutazioni che causano knockout del gene; - se al sistema viene fornita una sequenza con omologie intorno al taglio, avviene riparazione omologa, con quei frammenti che riparano la sequenza, e possiamo o inserire una nuova sequenza, o eliminare la sequenza. Altre applicazioni sono le caspasi in cui è stata mutagenata la sequenza della dead caspase, tagliare: quindi non possiamo più tagliare, ma con questa guida possiamo.sfruttare per reclutare altre attività, come modulatori epigenetici, per controllare e regolare la trascrizione; oppure altre attività di ingegneria genetica in modo da avere un sistema inducibile. Altro passo avanti è stata la primer-Crispr-cas9, per ovviare al rischio di tagliare regioni di DNA non volute, off-targets. La tecnologia prime-Crispr-cas9 non permette tagli di DNA, bensì di ibridi RNA/DNA che diventa poi DNA/DNA. Applicazione della Crispr-cas9 nella terapia umana La prima patologia che è stata affrontata è stata la β-talassemia, perché le sue mutazioni sono molto note, modello conosciuto. Per correggere una mutazione β-talassemica possiamo: 1. introdurre nelle cellule la versione sana del gene, tramite vettori virali appropriati, sicuri, non devono inserirsi in regioni sbagliate, e devono garantire una buona espressione, con regolatori tessuti specifici; l'efficienza delle cellule corrette deve essere sufficiente.

1. Inoltre le cellule corrette devono sopravvivere, ed attecchire nellenicchia del midollo osseo.
2. Tramite la Crispr-cas9 correggiamo direttamente il gene, con il vantaggio che ripristinando il gene, questo si autoregolerà autonomamente.
3. Inattivare il gene BCL11A, repressore della emoglobina fetale, di norma l'emoglobina fetale viene inespressa nell'età adulta; possiamo fare quindi il knockout sul gene repressore, in modo da esprimerla nell'adulta, tuttavia poiché BCL11A è multifunzionale, è meglio attuare knockout specifico sull'enhancer eritroide-specifico di BCL11A.
4. Tramite terapie di gene editing, la correzione della cellula è uno dei tanti passaggi: dobbiamo prelevarle, modificarle, farle crescere, vedere se sopravvivono, se non hanno mutagenesi, se non ci sono off-targets, e poi riuscire a farle attecchire nel midollo.
5. Oltre le le applicazioni di Crispr-cas9 sono elevatissime: dalla sterilizzazione del gene.

therapy, plasmodio della malaria, all'eliminazione di antigeni negli organi di maiali per evitare rigetto quando trapiantati; tecniche di miglioramento agricolo.

I dubbi etici nell'utilizzo del sistema crispr/cas9 sono ancora molteplici: ha fatto molto scalpore un esperimento attuato nel 2018, dove sono state prodotte due gemelline resistenti al virus dell'HIV, CCR5, ma al contempo importanti per il recettore del sistema nervoso. Lo scienziato è stato bandito dalla sua università e gli è stato impedito di esercitare la professione ulteriormente.

Lezione di Genetica II, di Lorenzo Di Palmaa

La genetica dei trasposoni

Elementi genetici capaci di cambiare posizioni nel genoma, tramite meccanismi molecolari, si chiamano trasposoni, TGE, capaci di causare mutazioni, perdite di fusioni o riarrangiamenti cromosomici/traslocazioni. Gli elementi trasferibili sono presenti negli organismi eucarioti e procarioti, con classi differenti.

Per capire l'impatto

Il nostro genoma contiene delle sequenze trasponibili, che rappresentano circa il 45% del totale.