Appunti Genetica

Genetica: introduzione

Genetica deriva dal greco “ghenetikòs” (origine, fertile o produttivo). È una scienza nata 120 anni fa che si occupa dello studio delle proprietà e dei meccanismi di trasmissione dei caratteri ereditari. Si basa su un concetto conosciuto fin dai tempi antichi, ovvero “il simile genera il simile”. I figli, infatti, sono in una certa misura somiglianti ai genitori e tra di loro (eredità). Nello stesso tempo essi mostrano, rispetto ai genitori ed ai fratelli, delle differenze più o meno marcate (variabilità).

Storia della genetica

La nozione che ci siano dei caratteri trasmissibili di padre in figlio è certamente antichissima:

• Ippocrate (V-IV sec a.C) → teoria della trasmissione ereditaria, ripresa in tempi successivi, fino al XIX secolo;
• Aristotele (384-322 a.C) → reciproca indipendenza di alcuni caratteri, nelle unioni tra persone di razze diverse;
• Lamarck → “il bisogno crea l’organo, l’uso continuo lo perfeziona, il mancato uso lo atrofizza”.

Nel Settecento il problema dell’ereditarietà interessa parecchi studiosi. Jean-Baptiste de Monet de Lamarck (1744-1829) sosteneva che i caratteri acquisiti nel corso della vita da un individuo vengono conservati e trasmessi di padre in figlio. Questa convinzione sopravvisse per tutto l’Ottocento, più che altro per mancanza di una teoria alternativa.

Per spiegare la sua teoria, Lamarck eseguì un esperimento, dove rimosse le code da topi, facendoli accoppiare ed aspettandosi che la progenie nascesse senza. Ovviamente non nacquero mai topi senza coda.

Charles Darwin

(1809-1882) → “teoria della discendenza con modificazione attraverso la variazione e la selezione naturale”. La teoria si basa su:

• Selezione naturale, modificazioni favorevoli tendono ad essere conservate, mentre quelle sfavorevoli tendono ad essere eliminate;
• Eliminazione degli individui meno adatti;
• L’individuo meglio dotato trasmette ai propri discendenti le proprie caratteristiche;
• Esistenza in natura di una forte variazione casuale.

Tornando a “il simile genera il simile”, pur facendo affidamento su queste osservazioni, le persone erano però all’oscuro del meccanismo che regola la trasmissione dei caratteri. Nell’800 era diffusa la “teoria della mescolanza”, ovvero la credenza che l’ereditarietà funzionasse come la miscelazione dei fluidi. Ad esempio, unendo il colore rosso con il bianco si ottiene una pittura rosa, quindi ci si poteva aspettare che da un genitore alto e uno basso nascesse un figlio intermedio. Nonostante ciò, la teoria non spiegava come si potevano rivelare i colori “parentali”.

Gregor Mendel

(1822-84) → “legge dell’ereditarietà”. Mendel fu un monaco agostiniano che tra il 1856 e il 1863 eseguì degli esperimenti per spiegare come venivano ereditati i caratteri da genitore a figlio. Fece riprodurre per impollinazione incrociata o per autoimpollinazione diverse varietà di piante di pisello. La prima generazione aveva tutto colore viola (quindi non c’era mescolanza). Nella seconda generazione aveva sia piante a colore bianco che viola.

Mendel propose quindi che i fattori che controllano i caratteri si comportano come particelle, invece che come fluidi e che queste particelle non si mescolano ma vengono trasmesse intatte da una generazione alla successiva. Queste particelle, oggi, sono conosciute come geni. Inoltre, Mendel propose che per il colore del fiore esistevano due varianti geniche, una che condiziona i fiori viola e una che condiziona i fiori bianchi. Queste varianti geniche sono note come alleli. La sua teoria era giusta perché aveva scelto un buon organismo e dei buoni caratteri per i suoi studi, che vennero pubblicati sulla rivista “Proceedigs of the Natural History”, ma rimasero incomprese per 40 anni. Egli morì nel 1884 da sconosciuto.

William Bateson

(1900) → “genetica”. Bateson rilesse l’articolo originale e diventò “l’apostolo” delle leggi di Mendel. Nel 1905 egli coniò il termine genetica per indicare lo studio dell’ereditarietà. Bateson affermò che un’esatta determinazione delle leggi dell’ereditarietà probabilmente produrrà un cambiamento del modo in cui l’essere umano vede il mondo e nel suo potere sulla natura maggiore di ogni altro progresso prevedibile nelle conoscenze naturali.

Thomas Morgan

(1910) → “teoria cromosomica”. Si basò su studi di Sutton & Boveri, i quali in base ad osservazioni in meiosi, proposero due idee su dove si trovassero i geni nella cellula: la meiosi era il processo che genera le leggi mendeliane e i geni sono localizzati sui cromosomi. Morgan dimostrò che i geni di Mendel si trovano sui cromosomi, avvalorando la teoria per la quale fino a quel momento erano mancati i dati sperimentali.

Johansen

Linee pure, genotipo e fenotipo. A differenza dei geni mendeliani, per molti caratteri si osserva una variabilità continua. Johansen fu responsabile di esperimenti che chiarirono come questi caratteri quantitativi derivassero da un insieme di fattori genetici uniti all’effetto dell’ambiente. I caratteri continui sono controllati da più geni mendeliani (ipotesi multifattoriale). L’esperimento è basato sulla teoria delle linee pure: l’organismo da lui utilizzato era il fagiolo comune e come carattere quantitativo il peso.

Analizzando una linea pura, vi era una discreta variabilità nel peso dei semi. L’incrocio di fagioli pesanti con fagioli leggeri dà una progenie con ampia variazione di peso. Johansen distinse quindi il carattere ereditario (peso) e i suoi determinanti (ovvero un certo numero di geni mendeliani). Introdusse anche i termini genotipo e fenotipo. Definì che il fenotipo era conseguenza dell’interazione tra genotipo e ambiente e che lo sviluppo di un fagiolo di peso intermedio era il risultato di fattori sfavorevoli durante il suo sviluppo, oppure fattori favorevoli per un peso più basso.

Beadle e Tatum

Per spiegare il modo in cui i geni in una cellula controllano diversi stati di un carattere, come il colore del fiore, nel 1941 i due scienziati Beadle e Tatum proposero che i geni codificano per le proteine. Utilizzando la muffa del pane dimostrarono che i geni codificano enzimi che esercitano funzioni metaboliche nelle cellule. Nel caso delle piante di pisello c’è un gene che codifica un enzima necessario per produrre il pigmento viola nelle cellule del fiore (ipotesi un gene-un enzima).

Griffith

(1928) → Principio trasformante. Studiò lo Streptococcus pneumoniae, anche detto pneumococco, un batterio che causa la polmonite. Distinse due ceppi:

• Ceppo liscio (S=smooth) produce colonie lisce e lucenti ed è altamente infettivo (virulento).
• Ceppo rugoso (R=rough) produce colonie dall’aspetto rugoso ed è innocuo (avirulento).

Il ceppo S doveva la sua virulenza alla presenza della capsula, mentre il ceppo R presentava una mutazione che ne impediva la formazione. Le cellule di tipo S potevano mutare in cellule di tipo R e viceversa. Griffith inoculò i ceppi nei topi e osservò che quelli iniettati con S morivano, mentre quelli con R no. Uccidendo prima i ceppi S con calore e poi inoculandoli, i topi rimanevano in vita. Decise di unire negli stessi topi un ceppo R vivo e un ceppo S ucciso: osservò che questi morivano. Definì, quindi, che esisteva un elemento responsabile del cambiamento di virulenza, definendolo principio trasformante.

Avery, McLeod e McCarty

(1944) → DNA come principio trasformante. Tramite l’esperimento di Avery, riuscirono a dimostrate che il cosiddetto “principio trasformante” era il DNA. Sottoposero a lisi i ceppi S, separandone le componenti cellulari ed inoculandole in terreni con ceppi R vivi. Comparvero così colonie S e, osservandone il materiale genetico, riuscirono ad identificare come principio trasformante il DNA (o RNA).

Watson e Crick

(1953) → struttura del DNA. Negli anni '50 era in corso una sorta di competizione per rispondere a questa domanda. A vincerla furono Watson e Crick: la struttura molecolare del DNA consiste in una doppia elica, due filamenti di DNA avvolti uno accanto all’altro in una spirale. Si basarono su conoscenze già acquisite:

• Struttura dei nucleotidi: ogni nucleotide è composto da una base azotata, uno zucchero e un gruppo fosfato. Nel DNA di molti organismi la quantità di purine è uguale a quella di pirimidine, in particolare, la quantità di adenine (A) era pari a quella delle timine (T) e la quantità di guanine (G) era pari a quella delle citosine (C). Queste equivalenze erano divenute note come “regole di Chargaff”. I loro risultati suggerivano fortemente che T e A, così come C e G, fossero presenti nel DNA con un’interrelazione fissa;
• Franklin e la “foto 51”: la scienziata rese noti i modelli di diffrazione del DNA che indicavano come il esso avesse una struttura altamente ordinata, formata da substrutture ripetute a intervalli di 0,34 nm lungo l’asse della molecola.

Struttura del DNA e suoi meccanismi

I componenti di base del DNA sono i nucleotidi. Ogni nucleotide è composto da:

• Una base azotata, dove si distinguono 2 categorie: purine (doppio anello da 9 atomi) che sono adenina e guanina; pirimidine (singolo anello a 6 atomi) che sono timina, citosina e uracile;
• Uno zucchero, quale il deossiribosio tramite il quale le basi azotate si legano (legame fosfodiestere) formando il nucleoside;
• Un gruppo fosfato, il quale si lega al carbonio in posizione 5’ del nucleoside, formando il nucleotide completo.

Il polinucleotide si forma attraverso legami covalenti tra il gruppo fosfato di un nucleotide al 5’ e il carbonio di un altro nucleotide al 3’, dove questo legame 5’-3’ è definito legame fosfodiesterico.

Il DNA è una doppia elica, dove l’ossatura è data dall’alternarsi di zucchero-fosfato legati tramite legame fosfodiestere, mentre le basi azotate proiettano verso l’interno. Due filamenti polinucleotidici si avvolgono in senso destrorso, formando appaiamenti tra le basi complementari (A+T; G+C). Le due catene sono antiparallele, ovvero hanno polarità opposta. Le basi unite sono legate tramite legami H, 3 tra G e C e 2 tra A e T. Ogni coppia di basi dista dalla successiva 0,34 nm. Nell’elica sono evidenti due solchi, un solco maggiore e un solco minore.

Il DNA va incontro a 3 processi fondamentali: replicazione, trascrizione e traduzione. Questo permette di ottenere, da un alfabeto costituito da 4 sole lettere A, G, C, U (i nucleotidi con le basi azotate), un linguaggio di 20 parole (gli amminoacidi).

1 tripletta (3 nucleotidi) = 1 amminoacido. I primi indizi su come funziona questo meccanismo, si devono a Nirenberg e Matthaei (1961) che crearono RNA sintetici. Grazie alla polinucleotide fosforilasi (che non necessita di stampo), crearono omopolimeri (UUU) e li misero in 20 provette per la sintesi in vitro. La traduzione avvenne in tutte, ma la proteina radioattiva comparve solo in una, quella contenente fenilalanina marcata. Definirono quindi che la tripletta UUU codifica per l’AA fenilalanina.

Codice genetico

Il codice genetico è una “tabella” dove sono riportate tutte le possibili triplette tra le basi. Ad ogni tripletta corrisponde la sintesi di un AA, mentre ogni AA può essere sintetizzato da più di una tripletta. Il codice è (quasi) universale, la maggior parte degli organismi lo condivide. Il codice è degenerato: tranne due eccezioni (metionina e triptofano) per ogni amminoacido è presente più di un codone in grado di sintetizzarlo (Crick mutuò questo termine dalla fisica quantistica “stati fisici molteplici ma di significato equivalente” → ipotesi del vacillamento di Crick). I codoni che codificano per lo stesso amminoacido sono detti sinonimi. Il codice ha dei segnali di inizio e di fine (→ codoni di stop).

Si scoprì anche che esiste una molecola di RNA (acido ribonucleico) che trasporta l’informazione presente nel DNA dal nucleo al citoplasma dove vengono sintetizzate le proteine. Nel 1967, il diagramma di flusso per la trasmissione dell’informazione nelle cellule era finalmente noto come dogma centrale della biologia molecolare.

Replicazione del DNA

Watson e Crick ipotizzarono l’esistenza di un meccanismo di copiatura del materiale genetico. Nel processo da loro ipotizzato la doppia elica si rilassa e permette l’esposizione delle basi di ciascuno dei due filamenti di DNA. Ognuno dei due filamenti funziona da stampo molecolare per la sintesi di un secondo nuovo filamento.

Modello semi-conservativo (ogni molecola figlia mantiene una delle due eliche parentali); prima di questo pensiero, c’erano altre due teorie, risultate poi errate:

• Modello conservativo, le due eliche di DNA parentali rimangono insieme o si riassociano dopo la replicazione e nell’insieme funzionano da stampo per la sintesi di nuove doppie eliche di DNA figlie (doppia elica originale conservata, doppia elica figlia nuova);
• Modello dispersivo, tutte e due le doppie eliche contengono casualmente sia pezzi di DNA originale sia pezzi di materiale nuovo.

A confermare la natura semiconservativa della replicazione del DNA, furono nel 1958 Meselson e Stahl. Fondamento: possibilità di distinguere le preesistenti eliche di DNA parentale da quelle figlie di nuova sintesi. Pensarono di operare sulla composizione isotopica dei nucleotidi incorporati nei filamenti neosintetizzati: fecero crescere E.coli in un terreno la cui unica fonte di azoto era NH₄Cl. L’isotopo pesante N era presente in tutte le molecole contenenti azoto cresciute in quel terreno. Trasferirono dei batteri marcati in un terreno contenente l’isotopo N. Li lasciarono replicare e, in tempi diversi, prelevarono campioni. Estrassero il DNA e ne analizzarono la densità tramite centrifugazione ad alta velocità (con una soluzione di un sale pesante): dentro la provetta si sviluppa un gradiente di densità. Il DNA si muove verso il punto in cui la sua densità corrisponde a quella del sale. Il DNA con N si sposta verso il basso, mentre quello con N rimane verso la superficie. Analizzando i campioni con cicli di replicazione diversi, videro che le bande risultavano prima intermedie tra le due densità, per poi spostarsi verso il N. Questo poteva essere spiegato solo dal modello semi-conservativo.

Processo

La replicazione del DNA è un processo che avviene in un momento preciso del ciclo cellulare e dipende da un complicato network di elementi regolativi. È un meccanismo accurato e rapido: si ha un errore ogni 10 miliardi di basi inserite, in quanto è presente un meccanismo di proofreading (correttore di bozze). Si inizia in corrispondenza di una sequenza chiamata origine di replicazione, dove l’elica viene denaturata dando due singoli filamenti che fungono entrambi da stampo. Il segmento denaturato è detto bolla di denaturazione, dove la struttura a confine tra la denaturazione e gli stampi è detta forca replicativa. A livello di questa struttura parte il processo, catalizzato dall’enzima DNA polimerasi.

La polimerasi si avvale di enzimi chiamati DNA elicasi che sono in grado di srotolare la doppia elica. Le elicasi, a loro volta, reclutano la DNA primasi, in quanto la polimerasi da sola non è in grado di iniziare il processo, ma necessità di un primer di RNA. Da questo primer, in posizione 5’, la polimerasi inizia a costruire il nuovo filamento, muovendosi in direzione 5’→3’.

Dato che l’enzima catalizza la reazione contemporaneamente sui due filamenti stampo, il filamento con polarità 5’-3’ è definito filamento continuo, perché sintetizzato senza interruzioni, mentre il filamento con polarità opposta 3’-5’ è il filamento discontinuo, in quanto viene sintetizzato a frammenti. Per mantenere la polarità, la polimerasi sul filamento discontinuo, necessita sempre di nuovi primer per poter sintetizzare frammenti di DNA (definiti frammenti di Okazaki) che verranno poi uniti insieme dall’enzima DNA ligasi, creando così un filamento continuo. La replicazione termina dopo che tutto il DNA è stato copiato.

Trascrizione e maturazione dell’RNA

I primi gruppi di ricercatori avevano buoni motivi per pensare che l’informazione non fosse trasferita direttamente dal DNA alla proteina, ma doveva esistere un intermediario che portava l’informazione dal nucleo al citoplasma. Nel 1957 Volkin e Astrachan fecero un’osservazione che suggeriva che l’RNA fosse tale intermediario.

La trascrizione è la sintesi di un singolo filamento di RNA copiato da un segmento di DNA. Solo uno dei due filamenti viene usato come stampo, dato che la funzione e l’informazione dell’RNA dipende dalla sequenza di basi da cui origina. Ci sono 4 tipi di RNA:

• mRNA → codifica per una sequenza di AA. Sono i trascritti dei geni che codificano per proteine;
• rRNA → codifica per proteine ribosomiali;
• tRNA → porta AA al ribosoma;
• snRNA → forma complessi per la maturazione degli RNA.

Processo

Viene catalizzata dall’RNA polimerasi. La direzione di sintesi è sempre 5’→3’ e il filamento di DNA utilizzato è definito filamento codificante. I precursori dell’RNA sono i ribonucleosidi trifosfati (NTP). Il meccanismo è simile alla replicazione, ma con alcune differenze. L’RNA polimerasi è in grado di iniziare la sintesi senza bisogno di un primer, ma avvia il processo legandosi ad una regione del filamento stampo chiamata promotore, composta da più elementi (es. TATA box).