Appunti Genetica

Appunti di genetica

Identità biologica e variabilità genetica

Esistono due forze all'interno della cellula contrastanti, una che tende a mantenere la propria identità biologica e l'altra che invece tende a far esistere una variabilità genetica che serve all'evoluzione dei sistemi. L'identità biologica viene mantenuta dalle cellule grazie a un processo di duplicazione cellulare molto preciso chiamato mitosi, che consta di molte fasi. La cosa importante è che quando il DNA si duplica, si raggomitola a formare dei cromosomi che poi si dispongono lungo un piano, in modo che un cromatidio si riporti verso un polo della cellula ed un cromatidio verso l'altro polo.

Grazie ai centrioli vengono immesse all'interno del citoplasma delle fibre contrattili, predecessori dell'actina e della miosina, che vanno a legarsi al centromero. A un certo punto esse si contraggono e trascinano i cromatidi ai due poli della cellula. In questo modo si formano due cellule perfettamente identiche dal punto di vista genetico e viene così mantenuta l'integrità biologica della cellula stessa.

La meiosi e la variabilità genetica

Esiste poi una forza diversa attraverso cui si può generare della variabilità genetica e questo avviene, negli organismi a riproduzione sessuale, ma non negli altri, tramite la meiosi. È composta da due divisioni cellulari successive, la prima delle quali ha il senso di duplicare il DNA e di far sì che i cromosomi omologhi (di origine paterna e materna), invece di mettersi sullo stesso piano, si affiancano e i segnali che ci sono durante la meiosi sono completamente diversi da quelli che ci sono durante la mitosi.

Una volta affiancatisi nei cromosomi omologhi avviene il processo di crossing-over, ovvero lo scambio di materiale genetico tra cromosomi omologhi, processo responsabile della ricombinazione genetica. Durante la prima duplicazione cellulare avviene che un intero cromosoma, quello paterno o quello materno, si muove verso un polo e l'altro verso l'altro polo. La prima divisione meiotica serve a far sì che ci sia un rimescolamento genetico, che è di due tipi: la prima è chiamata intra-cromosomica, perché è quella dovuta al crossing-over, cioè si spezza un cromosoma in un punto, un altro cromosoma in un altro punto e si scambiano le parti. L'altra invece è la ricombinazione inter-cromosomica, nel senso che se in una cellula i cromosomi omologhi si dispongono in una certa posizione, in un'altra cellula possono disporsi in maniera diversa.

La seconda divisione cellulare invece serve a ridurre a metà il numero di cromosomi e quindi corrisponde a un processo mitotico, i cromosomi si dispongono come in un processo mitotico. Da un'unica cellula madre diploide vengono fuori 4 cellule apolidi geneticamente diverse l'una dall'altra. Questo fa sì che quando è comparsa la riproduzione sessuale, c'è stata un'esplosione di vita, inimmaginabile prima della comparsa della mitosi e della meiosi.

Meccanismi di variabilità genetica negli organismi non sessuali

La meiosi avviene negli organismi a riproduzione sessuale, quindi come fanno gli altri organismi a variare geneticamente? Ci devono essere dei meccanismi molecolari e cellulari che creano variabilità genetica. Cominciamo a vedere come siamo arrivati a capire che il DNA è la molecola informazionale e la molecola che contiene l'informazione genetica.

Esperimento di Griffith

1953: non solo si è capita la struttura del DNA, ma si è scoperto tantissime altre cose. Tutto comincia nel 1923 con l'esperimento di Griffith. Non esisteva il microscopio elettronico, ma si sapeva che il batterio Streptococcus pneumoniae causava la polmonite nei topi. Esistevano due ceppi diversi di Streptococcus, uno virulento e uno avirulento (capace o no di creare la polmonite). Venivano chiamati R (avirulenti) e S (virulenti). La differenza tra questi due ceppi era la presenza o l'assenza di una capsula polisaccaridica all'esterno; nel ceppo virulento era presente, nell'avirulento no.

Griffith alla fine degli anni '20 fa un esperimento molto semplice. Lui prende dei batteri di tipo R (non virulenti) e li inietta in alcuni topi. Questi sopravvivono. Dopodiché lui sacrifica il topo e va a vedere se nel sangue e nei tessuti si trovano i batteri virulenti, cosa che non trova. Fa esattamente la stessa cosa ma con ceppi S (con la capsula) e li inietta nei topi. Lui vede che in questo caso muoiono, ma non basta; non solo vede che muoiono ma vede anche che nei tessuti e nel sangue sono presenti i batteri S.

Ripete l'esperimento per assicurarsi dei risultati, e ottiene infatti sempre gli stessi. Quindi non è un caso che i batteri S uccidano il topo e si trovano i batteri nel sangue. A questo punto Griffith ipotizza che la malattia potrebbe essere causata da due cose: o dalla capsula in sé oppure dal fatto che i batteri S debbano essere vivi. Allora prova ad uccidere con il calore i batteri S e li inietta in un topo e quello che vede è che i topi sopravvivono. Li sacrifica e vede che i batteri sono assenti nel sangue e questo avviene anche negli esperimenti seguenti. Quindi questo vuol dire che la capsula polisaccaridica non è sufficiente ma il batterio deve anche essere vivo.

A quel punto fa un ultimo esperimento. Lui sa che i batteri vivi S uccidono il topo, i batteri S uccisi con il calore non uccidono il topo e i batteri R non uccidono il topo. Lui prende i batteri non virulenti di tipo R (che quindi da soli non uccidono), prende poi dei batteri S uccisi con il calore che da soli non uccidono. Li inietta quindi simultaneamente nel topo e da un punto di vista della logica si immagina che il topo dovrebbe sopravvivere. Il topo però muore. Analizzando i topi trova batteri S vivi (virulenti). Non può essere lo scambio della capsula perché questa non è sufficiente a rendere un batterio virulento. Ci deve essere qualcosa che è passato dal ceppo S morto all'altro, R, e lo ha trasformato rendendolo virulento. Griffith chiama questo qualcosa che è passato da un ceppo all'altro, principio trasformante. Qualcosa che passa da una cellula morta ad una viva e la trasforma in virulenta, e che si tramanda anche alle generazioni successive. Quindi è in qualche modo quel principio che contiene l'informazione genetica. Ma Griffith non sapeva qual era il principio trasformante.

Esperimento di Avery, MacLeod e McCarthy

Si sapeva che nelle cellule c'erano quattro grossi tipi di macromolecole: carboidrati, lipidi, proteine e acidi nucleici. Si sapeva anche che le proteine erano molto diverse tra loro. Il DNA sappiamo che è formato dal ripetersi di quattro basi diverse: Adenina, Guanina, Citosina e Timina. Le proteine sono formate dall'assemblaggio di 20 tipi di amminoacidi. Quindi la logica dice che la proteina è la molecola che ha più variabilità. Il quesito rimaneva: chi è che trasporta il principio trasformante, la proteina o l'acido nucleico?

Nel 1942 Avery, MacLeod, McCarthy fanno un altro esperimento e suggeriscono che il principio trasformante è un acido nucleico. Per acido nucleico noi conosciamo due tipi, il DNA (acido deossiribonucleico) e l'RNA (acido ribonucleico). Loro tre suggeriscono che il DNA è la molecola informazionale e non l'RNA. Noi sappiamo che le macromolecole sono di 4 tipi in una cellula. Prendono allora i ceppi batterici R e S usati da Griffith. Usano cellule S e le distruggono facendo un lisato cellulare, o estratto cellulare. Dopodiché questo estratto viene suddiviso in 5 aliquote, in 5 provette ognuna contenente la stessa quantità di questo estratto cellulare. Una di queste aliquote viene lasciata esattamente com'è e serve come aliquota di controllo. Nelle altre 4 aliquote ci mettono: in una delle proteasi, enzimi che distruggono le proteine; in un'altra ci mettono delle lipasi e quindi distruggono i lipidi; in un'altra ci mettono degli enzimi che distruggono gli zuccheri e in un'altra ci mettono gli enzimi che distruggono gli acidi nucleici (DNAasi e RNAasi). Inserisco in queste 5 provette il ceppo batterico R. Si aspettano che nell'aliquota in cui c'è l'estratto integro del ceppo S il ceppo R diventi virulento. Se la molecola che trasporta il principio trasformante è una sola mi aspetto che in 3 provette i ceppi si trasformino, mentre in quella che contiene gli acidi nucleici non si ha trasformazione.

Esperimento Hershey-Chase

Negli anni '40 tre scienziati Avery, McCarthy e MacLeod fanno un esperimento grazie al quale viene suggerito che la molecola informazionale, ovvero la molecola che trasporta l'informazione genetica, in realtà è l'acido nucleico. Partono da questo presupposto, se è vero che il ceppo S è capace di trasformare il ceppo R dovrebbe essere possibile, quindi c'è qualche molecola che passa (il principio trasformante) da una cellula morta ad una cellula viva, e la trasforma da non virulenta a virulenta, allora dovrebbe essere possibile capire di che tipo è la molecola del principio trasformante facendo il seguente esperimento. ((Vedi sopra)) Estraggono quindi i batteri da ognuna delle 5 provette e li iniettano in 5 topi diversi. Vedono che i batteri che provengono dalla provetta di controllo sono capaci di uccidere il topo. Questo dimostra che realmente c'è qualcosa nell'estratto delle cellule virulente morte capace di trasformare le cellule non virulente. Vedono poi che iniettando nel topo i batteri prelevati dalla provetta trattata con gli enzimi che distruggono gli zuccheri, il topo muore. Vuol dire che non sono gli zuccheri a trasportare il principio trasformante. E vuol dire anche che potrebbero essere le proteine, gli acidi nucleici o i lipidi. Fanno lo stesso esperimento iniettando in un topo i batteri prelevati dalla provetta trattata con le lipasi. Il topo muore. Questo suggerisce che non possono essere i lipidi il principio trasformante, perché il topo sarebbe dovuto sopravvivere e suggerisce anche che il principio trasformante è rappresentato dalle proteine o dagli acidi nucleici.

Rifanno l'esperimento iniettando nel topo i batteri dalla provetta trattata con le proteasi e il topo muore. Questo suggerisce che le proteine non sono il principio trasformante (suggerisce non dimostra). Per cui questi dati suggeriscono che potrebbe essere uno o più acidi nucleici il principio trasformante. Fanno l'ultimo esperimento e vedono che iniettando nei topi i batteri prelevati dalla provetta in cui c'erano le nucleasi, il topo sopravvive. Questo suggerisce, in parte dimostra ma non completamente, che uno o più acidi nucleici siano il principio trasformante. Rifanno lo stesso esperimento utilizzando in un caso le DNAasi e in un caso le RNAasi. Vedono che il topo sopravvive solo quando gli vengono iniettati i batteri provenienti dalla provetta trattata con le DNAasi. Nell'altro caso il topo muore. Quindi che questo afferma che teoricamente il DNA è la molecola portatrice dell'informazione genetica perché quando la distruggo non è più capace di trasformare un ceppo in un altro. Si scopre però che le proteasi usate non distruggevano completamente le proteine (tripsina, non spezzetta completamente le proteine ma ne fa dei lunghi frammenti). Chi può escludere quindi che questi filamenti non siano capaci ancora di trasformare il ceppo non virulento in virulento? Gli risposero nel 1953 due ricercatori con un altro esperimento.

L'esperimento di Hershey e Chase utilizza il batteriofago T2. Un batteriofago è un virus. I virus si pensa che non siano organismi viventi, anche se non sappiamo neanche come si sono originati. Il loro unico scopo è moltiplicare loro stessi. Si vedono solo al microscopio elettronico e possono infettare i batteri o i procarioti, oppure possono esserci virus animali o altri che infettano le cellule vegetali. Generalmente se un virus infetta un batterio non è capace di infettare un animale e viceversa. I batteriofagi si attaccano ai batteri e sono molto importanti dal punto di vista sperimentale perché in tempi brevissimi (poche ore) da un batteriofago ne possiamo ottenere qualche migliaio di miliardi. E poter lavorare con numeri così elevati in tempi brevi permette di fare un'analisi statistica che invece con esseri che si riproducono più lentamente non è possibile.

I virus hanno una testa che ha un suo volume all'interno della quale ci sta la molecola informazionale (acido nucleico). La lunghezza di tale molecola ovvero la quantità di informazione che un virus può portare dipende solo dalla grandezza della testa. Questa testa è formata dall'assemblaggio di proteine tutte uguali, tante copie della stessa proteina. Sotto la testa c'è una specie di corpo centrale, contrattile in alcuni casi, e poi ci sono alla fine delle fibre proteiche che hanno la funzione di attaccarsi alle cellule. Per poter aderire devono incastrarsi perfettamente con qualcosa che è presente sulla superficie del batterio. In modo tale che gli atomi delle fibre della coda del fago formino dei legami deboli (idrogeno, Van der Waals) con gli atomi dei recettori che si trovano sulla superficie cellulare. Quando si diceva che le molecole che si parlano, si parlano in questo modo, incastrandosi perfettamente l'una con l'altra tramite legami deboli. Questo crea un problema dal punto di vista biologico. Il virus una volta che ha trovato l'incastro, sa che a quel punto può permettersi di moltiplicarsi. Arriva un segnale che fa sì che la materia contrattile del corpo centrale della guaina, si schiacci, per iniettare la propria molecola informazionale dentro la cellula batterica attraverso la parete cellulare. Poi attraversa la membrana ed entra nel citoplasma.

Il DNA quindi ha due strade alternative. Può entrare in un percorso detto via litica, ovvero alla fine viene distrutta la cellula batterica e vengono emessi tanti virus identici. L'alternativa è non lisare le cellule ma trovare un'altra via di moltiplicazione. Il DNA virale entra e si integra nel DNA del batterio diventando parte della sua informazione genetica. Quando il batterio si duplica automaticamente trasporta nella generazione successiva anche il DNA virale integrato (via lisogena). Quali sono le forze e i segnali che dicono al virus quale via scegliere tra la via litica e la via lisogena?

Il virus si attacca a dei recettori sulla superficie della cellula, il che vuol dire che il batterio è pronto ad accettare il virus. Il destino finale del batterio però è morire. Per quale motivo dovrebbe legarsi ad una particella che sa che lo porterà alla morte? Questo va contro con l'idea di mantenere la propria entità biologica. Ma se durante l'evoluzione si sono sviluppati dei recettori con la specifica funzione di legarsi ai virus evidentemente deve avere un significato biologico.

Nella via litica le varie parti del virus si formano ma qualcosa deve poi guidare l'assemblaggio delle parti diverse. Nessuno glielo dice. Se abbiamo tante proteine della testa, queste si cercano e una volta trovatesi cominciano ad assemblarsi. Quindi l'assemblaggio di un virus è spontaneo. Niente lo guida se non le interazioni perfette tra molecole della testa e della coda e si dispongono sempre nello stesso modo. Questo perché la struttura tridimensionale della testa è tale che permette alle molecole di assemblarsi solo ed esclusivamente in quel modo. Il DNA virale entra nella testa, si formano le varie fibre, ed infine il virus ha un'informazione genetica per produrre degli enzimi che distruggono la cellula che viene distrutta solo quando è piena di virus. Questo significa che questi enzimi devono essere prodotti alla fine del ciclo, questo vuol dire che l'informazione genetica del virus è strutturata in modo tale che prima viene comunicato il cromosoma virale poi vengono fatte le proteine della testa e della coda e alla fine sintetizzati gli enzimi che lisano la cellula. Quindi c'è un'attivazione temporale dell'informazione genetica perfetta in modo che la cellula scoppi solo quando alla fine del ciclo essa è piena di virus.

Marcatori radioattivi e virus

Si sapeva già alla fine degli anni '40, inizio anni '50 che le proteine erano fatte da Carbonio, Idrogeno, Ossigeno, Azoto e Zolfo. Negli acidi nucleici del DNA, abbiamo i nucleotidi formati uno zucchero, un gruppo fosfato e una base. I costituenti sono Carbonio, Azoto, Fosforo, Idrogeno, e Ossigeno. Quindi quattro di questi sono in comune. Ma le proteine contengono Zolfo che non è presente nel DNA e questi contengono Fosforo che non si trova nelle proteine. Si conoscevano già a quel tempo gli isotopi radioattivi del fosforo e dello zolfo.

Hershey e Chase prendono due colture batteriche liquide di Escherichia coli, in due beute con la stessa quantità di cellule e lo stesso terreno liquido. I batteri si moltiplicano e si duplicano ogni mezzora, però in una delle due beute ci mettono anche l'isotopo dello zolfo e nell'altra ci mettono l'isotopo del fosforo. Il fosforo e lo zolfo vengono incorporati dalle cellule. Quindi nella beuta dello zolfo tutte le molecole che lo contengono diventeranno radioattive e quindi anche le proteine, ma non il DNA. Nell'altra beuta il fosforo viene assorbito e tutte le molecole che lo contengono diventeranno radioattive compreso il DNA. Quindi hanno una beuta in cui viene marcato il DNA ed una in cui sono marcate le proteine. Dopo un po' di tempo ci mettono la stessa quantità, in entrambe le beute, di batteriofago T2. Hershey e Chase sapevano che il batteriofago T2 era formato da DNA e proteine. Per cui il batteriofago che infetta le cellule cresciute in presenza di zolfo darà dei fagi radioattivi per lo zolfo marcati nelle proteine. Dall'altra parte i virus che fuoriescono sono sempre radioattivi ma marcati nel DNA. Quindi alla fine hanno due preparazioni pure di batteriofagi marcati una nel DNA e una nelle proteine.