Appunti di Microbiologia

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Microbiologia prof.Mastromei

Lezione 5 (le altre lezioni sono sul quaderno)

CAPSULA: rivestimento più esterno, molto spesso in molti casi.

Non è indispensabile per la cellula, nell’immagine il colorante

colora solo la capsula senza entrare nella cellula.

Di cose è fatta? Da polimeri di glucidi

(zuccheri) o amminoacidi, ad esempio

Leuconostoc presenta colonie differenti

nei terreni con glucosio e saccarosio.

Nel saccarosio abbiamo la capsula e quindi colonie mucillagginose e

abbastanza grandi, a sinistra invece dato che è presente solo glucosio

la cellula deve fare una scelta, o per il metabolismo o per la

formazione della capsula della cellula. Quindi in questo caso la cellula utilizza il glucosio per

il suo metabolismo e non forma la capsula. Da vicino inoltre le colonie sono rugose e non lisce

come nel saccarosio. Quando un microrganismo cerca di invadere il corpo di un altro si

scatena una reazione immunitaria in quest’ultimo, la presenza della capsula rallenta la

risposta immunitaria. Siccome le prime fasi di una malattia sono un gioco tra chi arriva prima

tra il patogeno o anticorpi, in microrganismi capsulati spesso la capsula è segno di

patogenicità dello stesso.

PARETE: presente nella maggior parte dei procarioti,

bacteria ed archea, ed è fondamentale per la

sopravvivenza. Ci sono microrganismi senza parete che

pero devono sopperire alla sua mancanza, la parete è un

guscio rigido, NON è UN FILTRO, non bisogna confondere la

funzione della parete con quella della membrana.

Se trattiamo la parete con un enzima, LISOZIMA, che

degrada la parete in soluzione, in un ambiente ipotonico

quello che succede è che la cellula continua a richiamare

acqua, si gonfia e scoppia.

Se si esegue lo stesso procedimento ma in condizioni

isotoniche, non cè pressione osmotica quindi la cellula non

scoppia ma viene rilasciata una cellula priva di parete

chiamata PROTOPLASTO che è una cellula vitale, in

laboratorio con alcuni accorgimenti può rigenerare la parete.

Questo esperimento ci dimostro che, dato che gli organismi quasi sempre vivono in ambienti

ipotonici, la parete è estremamento utile poiche impedisce alla cellula di dilatarsi e quindi di

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non acquisire troppa acqua. L’enzima lisozima si trova nella saliva e nelle lacrime, a livello

dell’occhio non ci sono difese immunitarie per questo la sua presenza è importante, infatti

nei trapianti di cornea non c’è rischio di rigetto nella stragrande maggioranza dei casi.

Costituenti della parete: peptidoglicano (mureina) costituito da una parte glucidica ed una

altra amminoacidica, in particolare NAG (N-acetilglucosammina) e NAM (N-acetilmuramico),

gli AA sono anche nella forma D e per ottenere questi amminoacidi si deve impiegare un

enzima che è la racemasi. Alcuni AA della sintesi proteica vengono sequestrati e convertiti

nella forma D per costituire la NAM.

NAM e NAG sono legati in modo lineare, in corrispondenza del NAM sono legati 5

amminoacidi, le prime tre posizioni sono variabili ma in posizione 4 e 5 troviamo sempre la

D-alanina. Mureina nei batteri gram negativi: NAM

VERDE, NAG ROSSO, CERCHIETTI BLU

SONO GLI AA. Abbiamo un legame

peptidico diretto che collega l’aa di una

catena con l’aa della catena adiacente. ae

Mureina nei batteri gram positivi: in questo caso abbiamo 5 glicine

che collegano l’aa in posizione 3 della catena con l’aa in posizione 4

della catena adiacente, il legame peptidico è accompagnato da un

ponte interpeptidico ( quindi non è detto che ci siamo 5 glicine).

Quindi il legame diretto è tipico dei batteri gram negativi, nei gram

positivi solitamente il ponte che collega gli aa varia tra i vari

microrganismi.

SITO DI AZIONE DEL LISOZIMA: rompe i legami della catena polisaccaridica, rompendo il

legame tra NAM e NAG.

BIOSINTESI DELLA MUREINA

Nucleotide di park, catena pentapeptidica legato al NAM e

all’uridina tramite due legami fosforici. Park notò

l’accumulo di questo nucleotide nel processo di biosintesi

della mureina essendo esso un intermedio.

FRUTTOSIO-6-P viene trasformato in glucosamina-6-p,

l’acetil coenzima a dona il gruppo acetilico e abbiamo la

formazione della NAG-6-P, il gruppo P passa dalla posizione 6 alla 1 e successivamente

l’attacco dell’uridin difosfato alla n-aceil-glucosamina ottenendo UDP-NAG. Alla fine l’UDP-

NAG viene trasformato in UDP-NAM. Si è formata quindi una parte del nucleotide di park

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poiché manca la catena amminoacidica. Quindi ad esempio L-alanina viene attaccata con

l’utilizzo di un ATP, l’acido L-glutammico viene trasformato in D-glutammico e poi attaccato,

viene legata anche la L-lisina ed infine da 2-L-alanina di forma un dimero di Ala-D-Ala con

l’utilizzo di 2 molecole di atp. Il nucleotide di park a questo punto si è formato, UDP-NAM

pentapeptide. La molecola dovrà attraversare la membrana, al nucleotide di park viene

legata una molecola di BACTOPRENOLO ottenendo pentapeptide-NAM-P-P-bactoprenolo, a

questo punto l’UDP NAG viene addizionato alla molecola formando NAM-

NAG(pentapeptide)-P-P-bactoprenolo. Abbiamo ora 5 glicil t-rna, le 5 glicine si legano all’aa

in posizione 3 rilasciando il t-rna, questo punto entra in gioco il bactoprenolo che con due

gruppi P fornisce l’energia necessaria per il legame della mureina al NAG. Il bactoprenolo è

un trasportatore ciclico, portando fuori la mureina e tornando all’interno della cellula in

forma difosfata.

Meccanismo d’azione della transpeptidasi: forma un legame

peptidico tramite la scissione della D-alanina in posizione 5,

questo è il motivo per cui durante la biosintesi abbiamo un

catena di 5 aa legati al NAM e alla fine del processo ne abbiamo

4.

GRAM POSITIVI vs GRAM NEGATIVI

In linea generale la parete nei bateri gram positivi è molto più spessa rispetto ai gram

negativi, senza mureina non c’è rigidità, ma sono importanti anche altri componenti come

lipopolisaccaridi, lipidi soprattutto nei gram negativi. IL peptido glicano è più abbondane nei

gram positivi. Il fatto di avere meno peptidoglicano non vuol dire che la parete dei gram

negativi sia meno robusta dei gram positivi, sono entrambe abbastanza resistenti per un

ambiente ipotonico.

Parete gram positivi parete gram negativi

Peptid Pepti

Me

est

Me

citopl

Me

citopl Sp

I gram negativi presentano una membrana esterna (verde) costituita da lipopolisaccaridi e fa

in modo che si crei uno spazio periplasmatico (azzurro) assente o presente in minoranza nei

gram positivi. Lo spazio periplasmatico è importante, per attaccare macromolecole è più

facile secernere enzimi che importare il substrato all’interno della cellula, tutta via l’enzima

secreto diminuisce la sua concentrazione mano a mano che si allontana dalla cellula ed

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inoltre cè il rischio che il prodotto della degradazione enzimatica venga utilizzato da quelche

altro organismo, quindi la membrana esterna permette l’entrata del’substrato (molto più

facile rispetto alla membrana citoplasmatica) in un area intermedia tra citoplasma e

ambiente esterno ovvero il perplasma.

Acidi teicoici: Con il termine acidi teicoici si indicano tutti i polimeri della parete, della

membrana e della capsula contenenti residui di glicerolfosfato e ribitolfosfato. Gli acidi

teicoici sono tipici dei batteri Gram-positivi.

PARETE GRAM POSITIVI

Composta da uno strato esterno di peptitoglicano che

aderisce alla parte esterna della membrana

citoplasmatica, al di sopra osserviamo acidi tecoici, acidi

lipotecoici e proteine associate di membrana

PARETE GRAM NEGATIVI

Composta da una sezione di peptidoglicani che danno

rigidità e dalla membrana esterna con minore

permeabilità rispetto alla membrana citoplasmatica,

sulla superfice esterna della membrana esterna i

polisaccaridi sono legati a lipidi (cubetti gialli) queste

catene sono la parte più sporgente della cellula ed in

molti casi ne permettono il riconoscimento. Sono

presenti anche condotti che permettono il collegamento tra ambiente esterno e spazio

periplasmatico, costituiti da proteine chiamata purine che si dispongono a formare cerchi

quindi condotti quando di sovrappongono, non hanno il compito della membrana plasmatica

di selezionare gli agenti di entrata ed uscita.

ARCHEA PSEUDOPEPTIDOGLICANO: NAT (acido N-acetiltalosaminuroico), legame tra NAG e

NAT avviene con un legame beta 1-3 glicosidico.

MEMBRANA CITOPLASMATICA: propria di tutte le cellule, è un

sistema di separazione, decide chi può entrare e chi può uscire.

Abbiamo una regione idrofila superiore e inferiore, una sezione

interna formata da acidi grassi idrofobica, il doppio strato

fosfolipidico è accompagnato da proteine di membrana che

mettono a contatto l’ambiente interno con quello esterno. Le

proteine non sono ferme ma galleggiano in un mosaico fluido

di fosfolipidi.

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MEMBRANA DEGLI ARCHEA: abbiamo sempre un glicerolo legato al fosfato tramite un

legame etere, inoltre c’è ramificazione nella catena di phytanile (prime molecole ramificate

apparse sulla terra)

perché viene prodotta una

membrana monostrato? A destra si

nota come le code dei lipidi siano

continue. A livello degli archea ci

sono organismi che crescono a

temperature superiore a 100gradi,

la membrana monostrato funziona

male a temperature anche di 70

gradi ma nelle condizioni in cui vivono i microrganismi ipertermofili ha una funzionalità

ottimale.

Funzionalità principali della membrana: sito di ancoraggio

di proteine , conservazione dell’energia della forza proton-

motrice.

Meccanismi di trasporto:

-semplice, trasporto di molecole senza alcuna modifica

tramite l’energia associata alla forza protomotrice

-traslocazione di gruppo, modificazione chimica della sostanza trasportata

- sistema ABC, utilizza atp e proteine di legame periplasmatiche

EVENTI DI TRASPORTO

Uniporter, antiporter, symporter

Un esempio classico di traslocazione di gruppo è il trasporto del glucosio, il glucosio-6-P viene

formato per inserire direttamente la molecola nella via metabolica ed impedirne l’espulsione.

Membrane fotosintetiche, fa in modo che gli organismi coinvolti

nella fotosintesi risiedano in posizioni ben precise.

Separazione fisica: Formazione di strutture lamellari nei batteri

fotosintetici; formazione del mesosoma. Il mesosoma forma il

setto al momento della divisione e serve a ripartire il

cromosoma nelle due cellule figlie.

Permeabilità: Regola l’ingresso di ioni e metaboliti all’interno

della cellula, mantenendo una concentrazione superiore a quella esterna.

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LEZIONE 6

NUCLEOIDE: materiale genetico della cellula

Nell’immagine in rosso è

colorato il DNA della cellula,

notiamo come sia localizzato in

una regione centrale Cellula di escherichia coli che ha rilasciato il proprio DNA, la cellula è

stata trattata delicatamente in modo da far rilasciare all’esterno l’intero

DNA senza rompersi. Capiamo quindi che la lunghezza del filamento di DNA

è enorme rispetto alle dimensioni della cellula. In

rapporto ad una cellula di qualche micron il DNA

raggiunge qualche millimetro, ne consegue che deve

essere impacchettato per occupare poco spazio, allo stesso tempo il DNA

porta l’informazione genetica e questa deve essere fruibile e chiara, ci

devono essere dei meccanismi che permettono di accedere

all’informazione. in questa immagine notiamo come il DNA (zona scura centrale)

sia rinchiuso all’interno di una membrana, che ricalca quella

nucleare. In realtà questo è un nucleo “finto” poichè è sempre

di una cellula procariotica, ma visivamente è molto simile a le

cellule eucariotiche.

DNA -> trascrizione -> RNA -> traduzione -> PROTEINE: poi si

differenziano le loro funzionalità in anticorpi (difese), ormoni

(proteine segnale, vedremo che anche nei procarioti ci sono

dei sistemi di segnalazione per la comunicazione intercellulare), proteine strutturali (modifica

della forma cellulare), enzimi. Questo è il flusso dell’informazione genetica che deve essere

regolare e continuo, esiste anche un flusso inverso dove in particolari situazioni

l’informazione va dall’RNA al DNA.

Gli acidi nucleici sono formati da nucleotidi composti da una base, uno zucchero ed un gruppo

fosfato, le basi sono divise in basi pirimidiniche e puriniche, si ritrovano nel DNA e RNA ad

eccezione di timina(dna) ed uracile(rna). Il DNA è una molecola a doppio filamento, con

regole ben precise per quanto riguarda l’associazione delle basi e legami. I filamenti hanno

un inizio, chiamato estremità 5’ ed una fine, estremità 3’, il filamento complementare avrà

polarità opposta. Nell’RNA si ha un singolo filamento, sono molecole lineari, più corte e con

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l’uracile al posto della timina. In natura all’interno della cellula è difficile trovare l’RNA nella

forma distesa, in quando se trova sequenze complementari tra loro forma regioni

d’appaiamento tra le base e quindi strutture secondarie, queste hanno ruoli importanti

all’interno della cellula.

mRNA: porta il messaggio per la sintesi proteica, l’informazione per mettere assieme gli aa

tRNA: legge l’informazione del messaggero in modo da portare l’aa corretto, consente il

passaggio da sequenza amminoacidica

rRNA: componente importante dei ribosomi

MOLECOLA DI DNA NELLA CELLULA

REPLICAZIONE: sfrutta la complementarietà delle basi, l’informazione su un elica viene letta

e viene sintetizzata l’elica complementare. Si otterranno quindi due nuove molecole di dna.

TRASCRIZIONE: porta alla sintesi di una molecola di rna, utilizza solo una delle due eliche.

L’informazione viene letta a gruppi di tre, triplette o codoni, ognuna dei quali codifica per un

amminoacido.

PROCARIOTE

Nella cellula procariote tutto avviene nel

citoplasma, questo è alla base della regolazione

della cellula batterica. Le sequenze codificanti sono

compattate e vicine tra loro nei procarioti, l’rna

polimerasi quando effettua la trascrizione, forma un

trascritto (mRNA) che porta l’informazione di più

geni. Un messaggero che porta l’informazione di

due, tre, quattro geni vengono chiamati

policistronici. La trascrizione e traduzione avvengono entrambe nel citoplasma,

fondamentale nei batteri poiché non è necessario che un passaggio termini per far iniziare

quello successivo.

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EUCARIOTE

Il dna è nel nucleo, la trascrizione avviene nel nucleo ma la

traduzione avviene nel citoplasma, quindi sarà necessario

più tempo. L’informazione genetica negli eucarioti è

spezzata, ovvero sono

presenti gli introni

(sequenze non

codificanti) che si

intromettono nella

sequenza degli esoni.

Avviene quindi la

trascrizione e

successivamente c’è il

fenomeno dello

splicing con cui gli introni vengono rimossi e gli esoni

legati assieme, a questo punto si ha il trasporto

dell’mrna nel citoplasma dove avviene la traduzione

nella proteina. Per ogni mrna si ha un gene. Questo processo crea dei problemi ai virus

animali, il primo problema è che la cellula eucariote ha una divisione spaziale,

compartimentazione, e in secondo luogo si formano mRNApolicistronici virali, inoltre in

questo caso occorre molto tempo poiché dall’attivazione del gene al suo prodotto si ha molta

latenza, cosa che non avviene nei batteri.

Informazione gentica nei procarioti: le sequenze cromosomiche possono avere origini

differenti, ad esempio informazioni fornita da virus che non serve a formare un nuovo virus,

è stata incamerata nel genoma. Sono presenti anche frammenti di dna plasmidico quindi

extracromosomico, abbiamo anche i trasposoni o elementi mobili. Si ha una sorta di puzzle

che va a comporre l’informazione genetica.

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SUPERAVVOLGIMENTO DEL DNA: se si ha un taglio a singola elica si ha il fenomeno del

rilassamento per cui il cerchio si apre. Questo fenomeno avviene facilmente in molecole di

dna circolari piccole, nelle molecole più grandi si creano delle anse stabilizzate dalla presenza

di proteine, chiudendo questa regione si ha una lunghezza del dna

ben definita che permettono il superavvolgimento, quindi si ha il

superavvolgimento di regioni e non dell’intero dna. La

compattazione del dna avviene grazie a proteine chiamate istoni che

permettono anche lo svolgimento delle regioni interessate quando

il dna deve essere letto, nei procarioti ci sono proteine “inston like”

che svolgono funzioni simili a alle proteine istoniche.

Per molti anni si è ritenuto che i procarioti avessero esclusivamente

genomi circolari mentre negli eucarioti fossero tutti lineari, negli

eucarioti l’informazione genetica è suddivisa in più cromosomi, nei procarioti si pensava che

ci fosse un solo cromosoma. Successivamente si sono scoperte cellule batteriche con

informazione distribuita su più cromosomi. Le dimensioni sono esposte come Mb ( milione

di paia di basi), possiamo dire che i batteri hanno avuto il tempo nel corso dell’evoluzione di

affinare la capacità di compattare l’informazione in un unico cromosoma, si conoscono

batteri con genomi di 200-300 paia di basi ovvero la dimensione di alcuni dei più grandi

genomi virali, si sta cercando di capire quindi qual è la dimensione minore possibile del

genoma compatibile con la vita. All’estremo opposto si notano gli streptomiceti con un

genoma di 8,66Mb (genoma medio circo 4Mb), molto probabilmente si pensa che questo

genoma s