Appunti di Microbiologia

Microscopio ottico a contrasto di fase

• PROCEDURA 1. Se si parte da una coltura in terreno liquido, con una pipetta prelevare direttamente una goccia (10-20 µl) di coltura e porla sul vetrino portaoggetti. Saltare il punto 2. Se si parte da una coltura su terreno solido, prelevare una goccia di SF e porla sul vetrino portaoggetti. Procedere secondo il punto 2. 2. Con un'ansa o uno stecchino sterile prelevare un po' di patina del/i microrganismo/i cresciuto/i su piastra e stemperarla nella SF aliquota su vetrino. 3. Appoggiare delicatamente sul preparato un vetrino coprioggetti evitando di provocare la formazione di bolle. 4. Eventualmente assorbire l'eccesso di liquido all'esterno del vetrino coprioggetti con un pezzetto di carta assorbente. 5. Osservare il preparato al microscopio ottico a contrasto di fase usando l'obiettivo 20x e/o 40x. TIPI DI TERRENO: It cannot- Complex media (terreno massimo)- Defined media(terreno minimo)- Differential and selective media (terreno dicui conosco tutti gli ingredienti)

Per far crescere i microrganismi non basta acqua e glucosio ma anche sali minerali (ad esempio magnesio fondamentale per la funzionalità dell'adna polimerasi), fonti di azoto, fosforo ed amminoacidi. Proteine: se prendiamo ad esempio il triptone questo è la tipica caseina che si trova nell'atte digerita, in modo che il microrganismo può utilizzare la proteina con più facilità.

Complex media:

• LB: è uno dei terreni più utilizzati, contiene triptone, estratto di lievito (si ottiene dall'ievito i vari sali minerali), NaCl (per regolare la pressione osmotica, gli enterobatteri non amano gli stress osmotici) e agar (per la solidificazione)
• Sabouraud: contiene moltissimo glucosio (è un terreno specializzato nella crescita dei funghi che sono organismi complessi), enzimi digeriti, agar, cloranfenicolo (è un antibiotico a largo spettro)

selezionare la crescita dei soli funghi)

• MacConkey agar: terreno selettivo, differenziale e complesso. Contiene triptone, lattosio, NaCl, sali di bile, agar, ha un indicatore di ph (se il terreno diventa rosso il metabolismo è acidico e quindi fermenta i lattosio, se è giallo non fermenta il lattosio e quindi non sarà acidico), crystal violetto (seleziona ancora meglio gli enterobatteri insieme ai sali biliari). In questo terreno cresceranno solo gli enterobatteri gram negativi e che possiamo differenziare.
• Nutrient agar: simile ad LBAlessandro Giramondi 49
• Minimal salt M9: è un terreno minimo, contiene glucosio, biotina (cofattore per le reazioni di carbossilazione), tiamina (cofattori essenziali per molti enzimi), MgSO4, CaCl2, sali in soluzione

LEZIONE 12 CICLO DELL'AZOTO: come nel caso del carbonio dove la fonte naturale più abbondante è la CO2 atmosferica anche in questo caso la fonte principale è l'azoto atmosferico, dal

Il punto di vista chimico sull'azoto è che è una molecola biatomica, i due atomi di azoto sono legati da tre legami covalenti. L'azoto è considerato un gas inerte a causa dei tre legami che sono molto difficili da scindere, rendendolo poco reattivo.

In natura esistono organismi capaci di prendere l'azoto atmosferico e trasformarlo in ammoniaca (NH3), una sostanza fortemente alcalina e molto dannosa per gli organismi viventi. L'ammoniaca non viene quindi stoccata all'interno della cellula ma utilizzata per la sintesi di amminoacidi e proteine. Successivamente, l'ammoniaca rientra nel ciclo e viene utilizzata dalle piante, ma contemporaneamente ci sono processi che portano alla liberazione dell'azoto fissato e al suo trasferimento in atmosfera.

La fissazione dell'azoto atmosferico è un processo che le attività agricole hanno riconosciuto da molto tempo come problematico nell'utilizzo dei campi per la coltivazione di specie agricole.

Di interesse economico, se lo stesso appezzamento di terreno veniva seminato anno dopo anno con la stessa specie vegetale, la resa calava fino quasi ad azzerarsi. Per ripristinare la resa i campi venivano messi a riposo tramite la coltivazione di specie vegetali specifiche come l'erbamedica o luppolo, una volta che queste erano cresciute il campo veniva arato lasciando nel terreno queste specie vegetali cresciute in modo che tornasse fertile. Questo era dovuto al fatto che le piante hanno bisogno che prendono dal terreno sotto forma di sali azotati, questi sali nel terreno sono in quantità limitata quindi una volta utilizzati del tutto le piante non crescevano. L'industria agricola odierna ovvia a questo problema con l'introduzione di concimi con alto contenuto di azoto in grado di reggere il passo con le tecniche di agricoltura intensive odierne. Ma perché si poteva arricchire nuovamente il terreno se questo veniva seminato con precise specie vegetali?

L'immagine è di una radice di pianta di soglia, si osservano dei noduli a livello delle radici all'interno dei quali sono cresciuti microrganismi azoto fissatori capaci quindi di prendere l'azoto atmosferico e di trasformarlo in ammoniaca incorporata successivamente negli amminoacidi. Molti organismi azotofissatori vivono nel suolo e molti tendono a vivere in associazione con determinate specie vegetali, questa associazione è specifica tra la piante di soia e una determinata specie di organismi azoto fissatori. Quello che succede è che gli organismi liberi nel terreno possono associarsi con la radice formando queste strutture in diretto contatto con i vasi linfatici delle piante ed in questo caso c'è un'utilità reciproca, i vasi linfatici portano sostanze nutrizionali ai batteri indispensabili per eseguire l'azoto fissazione poiché pur utilizzando enzimi è comunque un processo.

Dispendioso dal punto di vista energetico. Quindi la pianta fornisce le sostanze nutrizionali mentre i microrganismi ripagano la pianta immettendo i composti azotati nei vasi linfatici, si ha quindi un importante scambio reciproco.

In questo esperimento è stato creato un appezzamento di terreno artificialmente privato di Sali di azoto, sono state piantate piantine di soia. A sinistra ci sono piante prive di noduli radicali visti precedentemente, a destra piante che hanno i noduli radicali. Si può quindi osservare chiaramente l'importanza di queste strutture in quanto le piante con i noduli sono cresciute molto bene mentre quelle non nodulate hanno una crescita estremamente stentata.

Pia Piant

STADI DELLA FORMAZIONE DEL NODULO RADICALE IN UNA LEGUMINOSA

Ante

Ci sono i noduli e le radici della pianta nel terreno, nel terreno ci sono microrganismi. La pianta che può vivere in associazione con organismi azoto fissatori ha radici che rilasciano nel terreno molecole segnale che

possono essere identificate da determinate specie di microrganismi azoto fissatori, si ha una chemiotassi positiva. Quando il microrganismo individua questo segnale si lega ai peli radicali della pianta, e si forma il nodo di infezione e alla fine si creano i noduli sulle radici della pianta, quindi la formazione di queste strutture derivano da un processo altamente specifico. L'enzima fondamentale per la fissazione dell'azoto atmosferico è l'enzima nitrogenasi che funziona solo in condizioni di anaerobiosi stretta, è estremamente sensibile all'ossigeno che lo inattiva permanentemente. Questo crea alcuni problemi perché molti microrganismi azoto fissatori sono aerobi, quindi devono conciliare due aspetti importanti del loro metabolismo: hanno bisogno dell'ossigeno per vivere, ma se vogliono sfruttare l'azoto atmosferico devono far lavorare la nitrogenasi in condizioni anaerobie. Ci sono varie soluzioni, una delle quali è quella

Impiegata dai noduli delle leguminose. All'interno dei noduli ci sono delle zone rossastre, in quanto quando si forma l'associazione tra la leguminosa e il microrganismo azoto fissatore viene indotta la produzione della leg-emoglobina o emoglobina delle leguminose, il compito principale dell'emoglobina è quella di trasportare l'ossigeno. In questa situazione l'ossigeno non è libero ma viene trasportato soltanto nelle zone dove c'è bisogno del suo utilizzo, quindi all'interno della cellula non c'è ossigeno libero e la nitrogenasi non viene a contatto con esso permettendo così il funzionamento sia del metabolismo che della fissazione dell'azoto atmosferico. Quando negli anni 80 si cominciò a studiare a fondo questo meccanismo di azoto fissazione e si iniziò ad avere in mano gli strumenti per l'ingegneria genetica e la possibilità di rimaneggiare il dna si studiò

la possibilità di modificare questi organismi azoto fissatori per migliorare la produzione agricola. L'idea era di avviare alla mancanza di composti azotati con fertilizzanti chimica che però avevano il problema dell'inquinamento, si pensò quindi di migliorare il sistema di azoto fissazione in modo da farsi che ci sia una ridotta necessità di azoto aggiunto mediante fertilizzanti chimici. L'idea di creare piante transgeniche in grado di utilizzare l'azoto atmosferico fu abbandonato quando si scoprì che il processo di fissazione dell'azoto era anaerobio stretto, nelle piante c'è una grande quantità di ossigeno liberato anche dalla fotosintesi. L'altra idea era quella di aumentare la quantità di organismi azoto fissatori in modo da permettere il processo anche in assenza di un nodulo radicale. In realtà tutti questi tentativi non hanno avuto successo, l'azoto fissazione è un

Il processo di fissazione dell'azoto è estremamente dispendioso anche per le cellule batteriche. Se si inserisce un organismo azoto fissatore in un terreno con composti azotati, non esegue il processo di fissazione ma li utilizza. Il sistema è fortemente regolato per far risparmiare energia alla cellula batterica e quindi questo non ha permesso di sviluppare un metodo valido per il miglioramento delle attività agricole.

CICLO DELLO ZOLFO

La fonte di zolfo più abbondante in natura è lo zolfo elementare presente nelle rocce e minerali (carbone, cuprite, ecc..). Questo può essere ossidato dai batteri per darci dei solfati, sali utilizzati dal mondo vegetale per andare a formare le proteine (gruppi sulfidrilici). Entrano così nei composti organici, vengono utilizzati dagli organismi viventi per il loro metabolismo e durante i processi di digestione o di degradazione operata dai batteri sulla materia organica morta viene liberato sotto forma di acido solfidrico (H2S) che può essere.

ossidatodai