Appunti di Microbiologia generale

8 CF

esercitazione 13 april

prova scritta 11 domande aperte 60 minuti (punteggio max per domanda = 3), 10 riguardanti programma e 1

riguardo laboratorio

orale facoltativo (+/- 2 pt

1/03/202

virus come “oggetti”, non è vivo.

microbiologia studia i microrganismi (non visibili a occhio nudo) - esistono come cellule singole o

come gruppi di cellule + studio dei virus

microrganismi si differenziano dai macrorganismi (es noi) perché possono svolgere un ciclo vitale

indipendentemente da altre cellule

E. coli: batterio gram-negativo simbionte, vive nel colon e ci fornisce vitamine e molecole con attività

antibiotica

varianti di E.coli possono essere patogene per l’uomo.

un’unica cell può dare discendenza in nita (riproduzione asessuata)

3 pilastri della microbiologia:

siologia dei microrganismi (come sono fatti e come funzionano, metabolismo e nutrizione)

genetica (genomi, ereditarietà e come esprimono geni e come questi variano nel tempo

ecologia (interazione che microrganismi stabiliscono con ambiente o altri organismi

ma anche

biochimica microbica (enzimi e reazioni chimiche nelle cellule)

sistematica microbica (classi care e dare un nome ai microrganismi

virologi

e applicazioni in campo medico (malattie infettive), agricoltura, industriale (antibiotici, bevande

alcoliche…), acquatico, biotecnologico (produzione di proteine da organismi geneticamente modi cati).

microrganismi: dimensioni tra 10 m (micron, batteri) e 10 (qualche decina di nanometri, virus

-6 -8

microscopio ottico ( no a 10 circa) e elettronico

-7

procarioti (batteri e archea

una cellula è tale in quanto è in grado di

-fare metabolismo: acquisire nutrienti e sostanze chimiche dall’ambiente e trasformarle grazie ad energia e

liberando all’esterno degli scarti = per la produzione di nuove cellul

-si riproduc

-differenziare (per diversa espressione di set di geni in certe condizioni, per manifestazione di un fenotipo

differente; con possibilità di ritornare in condizione vegetativa pre-differenziazione

-comunicare (scambio messaggi es chimici per variazione atteggiamenti individuali e sociali

-mobilit

-evoluzione nel tempo (cambiamenti fenotipici che sono risultato della selezione) - questo è in comune ai

viru

espressione genica: batteri, funghi, protozoi hanno DNA a doppia elica che può replicare, trascrivere e

tradurr

cenni storici: Robert Hooke 1664 (ha visto e descritto organismi microscopici e ha scritto “microgra a”) ;

van Leeuwenhoek (costruzione microscopio e osservazione dei corpuscoli “animalcula”); Pasteur

(fermentazione lattica e alcolica, pastorizzazione latte, vino, sterilizzazione, vaccino contro antrace, vaccino

colera polli e rabbia); Robert Koch (scoperta batterio responsabile della tubercolosi - “postulati del Koch”

postulati veri cati qualora un microrganismo sia considerato responsabile di una malattia

1

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4/0

raggiungimenti della microbiologia negli ultimi 65 ann

primordi (van Leeuwenhoek, Pasteur, Koch

tra il 1941 e il 1986 periodo della microbiologia molecolare e generale (DNA come materiale genetico,

struttura DNA, codice genetico, sequenziamento

dall’86 microbiologia molecolare, genomica e proteica (PCR)

Mondo microbico - due modell

1)modello procariota (delimitato da un involucro interno; “caos” interno) es.

helicobacter modesticaldum

2) modello eucariota (vedo involucri contenenti zone delimitate da membrane

e grosso sacco centrale alcune delle quali de niscono spazi) es.

Saccharomyces cerevisiae con d=8 micron

nota: pili (tubi di proteine) ≠ cilia

Tassonomia se noi andiamo a considerare le parentele

evolutive ( logenetiche) tra tutto ciò che

vive in questo pianeta, questo può essere

raggruppato in tre categorie.

2

3 fi i ) ) i fi

LUCA : last universal common ancestor (vissuto dai 3.5 ai 3.8 miliardi di anni fa - da LUCA si sono

originati i 3 rami di batteri, archea, eucarioti

Struttura e funzione della cellula procariotic

organismi microscopici con dimensioni e forme vari

la maggior parte hanno dimensioni nell’ordine di qualche micron (millesimo di mm

superbatteri (biovolumi di 200milioni e 3milioni di micrometri - quasi piccole cellule

forme: bacilli (eng: rod) e cocchi (sfere

cocchi: può diversi su un piano dando ordine a un diplococco; catenella di cocchi invece si chiamano

streptococchi.

su due piani danno origine a gruppi di 4 cellule/tetradi

bacilli: uno che si replica band ordine a due che rimangono appicciati sono diplobacilli; poi streptobacilli.

Con forma più arrotondata sono coccobacilli. Incurvati sono vibrioni. Avvolto su se stesso sono spirilli o

spirochete se gli avvolgimenti sono tanti.

rapporto super cie-volume; più sono piccoli, meglio funzionano

nomi: nome del genere maiuscolo puntato, nome della specie esteso in corsivo (E.coli

La forma di un procariota è determinata da due fattori: parete cellulare (se presente) e il citoscheletro.

nello staphiloccocus aurea la forma è data sostanzialmente dalla parete cellulare; all’interno c’è un anello di

una proteina (FtsZ

il citoscheletro ne determina l’allungamento (proteina MreB) —> bastoncell

per i vibrioni: proteina crescentina che determina l’incurvazione.

Staphylococcus aureus: modello di batterio gram positivo

Escherichia coli: modello di batterio gram negativo

al TEM vedo zona chiara centrale corrispondente al nucleoide/genoma. La zona intorno al nucleoide è più

scura con puntini (ribosomi). Parete cellulare esterna alla membrana citoplasmatica/cellulare.

3

fi ) ) ) e a . i ) ) )

La parete cellulare

può essere Gram positiva o Gram negativ

È una struttura rigida (non uida come la membrana cellulare) che conferisce forma al procariota. Protegge

da danni meccanici (es schiacciamento) e previene la lisi osmotica (maggior pare di procarioti vivono in

ambienti ipotonici in cui l’acqua tenderebbe a entrare spontaneamente dentro, facendo aumentare il

citoplasma no a portare a lisi/scoppio della cellula

Può anche avere funzione di barriera selettiva nei Gram-negativ

Partecipa alla determinazione degli aspetti patogenetici delle infezioni sostenute dai batteri e può quindi

essere bersaglio di molti antibiotici.

Sacculi: strutture residuali di parete cellulare dopo l’eliminazione della cellula contenuta all’interno

(protoplasto

Il lisozima presente nelle secrezioni mucose è importante nella immunità innata; è un enzima capace di

degradare la parete cellulare di un batterio - zone di lesione nella parete in cui l’acqua che entra diluisce il

citoplasma nché la membrana si lisa. Perché ciò che accada si deve essere in soluzione ipotonica (non

isotonica, altrimenti il protoplasto fuoriesce senza spaccarsi/senza lisi della membrana)

Colorazione di Gra

Gram positivo o negativo in base alla reattività alla colorazion

Come si fa: si prende un campione di microrganismi e lo si distribuisce sulla super cie di un vetrino con

un’ansa da batteriologia. Uccisione di batteri con calore = ssazione al calore. Segue la colorazione e

l’osservazione microscopica in immersione.

nir

—> primo colorante: cristal violetto - penetra nelle cell ule e tutto si colora di viola

poi mordensatura: si aggiunge qualche goccia di

iodio e ioduro di potassio; si complessa col cristal

violetto dando origine a complessi insolubili

poi fase di decolorazione con soluzione di alcol e

acetone che estraggono i complessi iodio-cristal

violetto solo da alcune cellule. Le Gram+

rimangono viola, le Gram- sono colorless

poi colorazione di contrasto con safranina (rossa)

che colora ciò che si era scolorato prima. Chi ha

assunto safranina sarà Gram-, le cellule viole sono

invece Gram+. Questo è a causa della differenza

nelle pareti

cellular

nel G+ unico

grosso strato

principalmente di

peptidoglicano,

mentre nel G- due

strati ed

esternamente una

membrana interna,

molto simile a

quella

citoplasmatica

visti dall’esterno,

il G+ ha una

super cie liscia, mentre il G- appare rugoso a causa dalla presenza della membra esterna.

4

fi e fi i fi fi

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5/0

ricorda che la membrana cellulare non fa parte

della parete cellulare

Peptidoglicano forma una rete tridimensionale

parte glicanica: alternarsi di N-

acetilglucosammina (NAG/G) (derivato del

glucosio, acetilato) e di acido N-acetilmuramico

(NAM/M). legami β,1-4; siti di taglio del

lisozima - ruolo di protezione per noi dai batteri

Questa struttura si ripete n volte. Il NAM è un

derivato del NAG in cui in posizione 3 c’è una

sostituzione con un gr di un acido lattico, con un

gr -COOH libero che può essere legato da aa

(parte peptidica) da legame peptidico. L-alanina

alla quale è legato l’acido D-Glutammico

(forma D, non L come ci si aspetta. troviamo

alternanza nella catena peptidica di L e D

amminoacidi), poi in posizione 3 acido

mesodiaminopimelico (forma L), poi in posizione 4 D-alanina. La differenza tra G+ e G- è l’aa in

posizione 3. Nei Gram+ in posizione 3 abbiamo la L-lisina. Sovrabbondanza di gruppi reattivi. In

entrambi i casi c’è una catena laterale che presenta un gruppo amminico che può fare legame

peptidico col gruppo carbossilico di un aa carbossi-terminale (proprio nella D-alanina). Così il gr

carbossilico possa formare un legame peptidico con gr amminico presente su un’altra catena di una

la parallela. Grazie alla presenza di questi due aa in posizione 3 che sporgono è possibile la

formazione di legami interpeptidici (tra peptidi che appartengono a le parallele). Nei Gram- (es.

E.coli) avrò legami interpeptidici 3-4 diretti; nei Gram+ legami interpeptidici tra posizione 3-4 con

interposizione di 5 Gly, quindi legame interpeptidico indiretto. Grande rigidità.

Parete cellulare dei Gram positiv

Nei Gram+ notiamo presenza di acidi teicoici;

polimeri di glicerol-fosfato o di ribitol-fosfato

(glicerol-teicoico (rossi) e ribitol-teicoico

(verdi)); in nero legami peptidici

funzione: riserva di fosfato, attribuiscono carica

negativa per attirare ad es. ioni metallici,

positivi, fondamentali per il metabolismo delle

cellule.

Li chiamiamo acidi lipoteicoici quando

l’estremità verso la cell è legata covalentemente

alle teste dei fosfolipidi del foglietto più esterno

della membrana citoplasmatica

Proteine associate alla parete cellulare (ma in quantità minore rispetto a quelle della parete dei G-

5

fi 3 ! . i : . fi )

Parete cellulare dei Gram negativi

Nei Gram- al microscopio elettronico si

vede uno strato sottile più scuro, tra due

strutture (membrana plasmatica e

membrana esterna) con due strati più

densi e uno in mezzo più chiaro.

Non ci sono acidi teicoici.

Struttura: membrana cell - rete di

peptidoglicani, strato sottile - struttura a

doppio strato lipidico in cui quello verso

la cell è costituito da fosfolipidi, quello

verso l’esterno è costituito da

lipopolisaccaridi (è la membrana esterna,

molto simile a quella citoplasmatica e fa

parte della parete cellulare)

Spessore membrana esterna = circa 8 n

Quindi la parete cellulare di un G- sarà costituito dallo strato sottile di peptidoglicani e dalla

membrana esterna

Periplasma: spazio tra membrana cellulare e membrana esterna - ricco di proteine e ovviamente

peptidoglicani (“annegano” nel periplasma)

Abbiamo pochi legami diretti 3-4 interpeptidici. Alcune di queste catene peptiche sono legate a

livello della D-alanina a una lipoproteina che quindi collega covalentemente il peptidoglicano alla

membrana esterna

Lipopolisaccaride (LPS - anche noto come endotossina); lipide di membrana, quindi antipatico.

Rappresenta la rma (PAMP) speci ca dei Gram-; lipide A (comune a tutti batteri G-; porzione

idrofobica determinata dalla presenza delle code idrocarburiche degli acidi grassi che hanno

esteri cato dei residui/gruppi sulla molecola della NAG - consente inserimento nella membrana

esterna), core polisaccaridico (comune a tutti i G- della stessa specie) e antigene O/polisaccaride O

(più esterno - stimola produzione anticorpi - speci co per il ceppo isolato, può essere diverso

all’interno della stessa specie per segmento interno che si ripete n volte, con n che può essere

diverso).

Core: troviamo zucchero KDO (acido 2,3-ketodeossiottonico) lo troviamo solo nel LPS della parete

dei G-; molecole a 7C Hep (eptosio, può essere fosforilato)

forme del LPS: batteri con LPS

completo danno origine a colonie

lisce (S, smooth); altrimenti R, rough.

La differenza risiede nello stato di

completamento del LPS. Una via di

mezzo è SR-LPS (semi-rough)

Proteine canale - porine (trimeriche, 6

fi fi .

. . . fi m . fi

in rosa); ltrano molecole; alcune speci che per le molecole da trasportare, importanti per il

trasporto di nutrienti. Struttura tridimensionale a beta-barile; formate da foglietti Beta che vanno in

senso antiparallelo tra loro formando dei cilindri.

es: OmpA = outer membrane protein (funz strutturale), OmpC e OmpF (formano pori per passaggio

di molecole idro liche piccole no ai 750 Da), LamB (trimeriche, porine per il maltosio

dall’ambiente esterno; passa nel periplasma grazie a un trasportatore e viene raccolto da proteine

speci che che lo trasportano dalla porina alla super cie della membrana plasmatica

Lipoproteina in giallo; ancora il liquido uido della membrana esterna al peptidoglicano

mureina o peptidoglicano = sinonimi; quindi lipoproteina morenica è quella che collega il

peptidoglicano alla membrana estern

quanto visto nora (per G+ e G-) è valido per batteri che hanno parete cellulare

batterio Mycobacterium tubercolosi

parete cellulare è una modi cazione della parete cell di un G+; non si colora perché ha una parete

estremamente idrofobica attraverso la quale non passano i coloranti.

Uso colorazione per acido e alcol resistenza - colorazione a caldo per facilitare ingresso del primo

colorante e poi eseguire una decolorazione fatta con lavaggi di alcol etilico e HSO decolorando

4

tutto tranne il micobatterio che continua a trattenere il primo colorante (rosso)

Quello che si decolora verrà poi

ricolorato con un colorante di contrasto

(blu). Sarà così possibile mettere in

evidenza cellule di M. tubercolosis.

Perché non si colorano col metodo di

Gram? Perché la parete cellulare di un

micobatterio è complessata da una serie

di molecole idrofobiche che vanno a

inserirsi sopra e dentro lo strato di

peptidoglicano.

All’esterno dello strato di peptidoglicano

troviamo molecole di arabinogalattano e

acido micolico. Impermeabilità al

passaggio di soluzioni acquose.

Sintesi della parete cellular

in ambiente estern

cocchi: si dividono e la parete cellulare sarà per metà vecchia e per metà di nuova sintesi

aggiunta al peptidoglicano già preesistente di nuovi monomeri sintetizzati nel citoplasma della

cellula.

Monomero base: disaccaride di M-G, con catena di 5 aa legata a M; gli ultimi due sono due

molecole di D-alanina (ho un glicanpentapeptide); formatosi da UDP NAM e UDP NAG

(uridindifosfato nam e uridindifosfato nag), si lega poi a un trasportatore di membrana, il

bactoprenolo (molecola a 55C che presenta due gr P - idrofobico - consente al monomero il

passaggio attraverso alla membrana citoplasmatica - si ribalta portando all’esterno il

glicanpentapeptide). Le transglicosilasi catalizzano l’attacco di due monomeri; si libera il

bactoprenolo che rientra e il ciclo può ripetersi.

Legami interpeptidici fatti dalle trasnpeptidasi/carbossipeptidasi presenti nel periplasma di G+ e G-.

L’idrolisi del legame peptidico del quinto aa (la seconda D-ala) fornisce l’energia necessaria

7

fi fi fi fi

o fi fi e a s fl fi fi . ) . .

af nché le transpeptidasi formino il legame 3-4 diretto/indiretto tra gr carbossilico della D-ala che

rimane e il gr amminico del DAP di una la glicanica parallela.

Le transpeptidasi sono il bersaglio molecolare delle penicilline, che impediscono propio queste

reazioni di transpeptidazione. sono inibitori competitivi delle transpeptidasi. Se queste sono

bloccate non si formano legami interpeptidici; le le glicaniche uttuano e la parte cellulare perde

rigidità, funzione di contenimento e protezione = lisi cellulare.

Non hanno attività tossiche su di noi in quanto noi non abbiamo parete cellulare di peptidoglicano/

non abbiamo le transpeptidasi

Un gruppo di Archea appartenenti ai metanogeni hanno una parete costituita da pseudo-peptiglicano

(NAM e uno zucchero che non è acido N-acetilmuramico, ma NAT, acido N-

acetiltalosaminouronico); i legami inoltre sono β 1-3, quindi resistono al lisozima. Inoltre troviamo

solo aa in forma L che formano legami interpeptidici).

Se vogliamo distinguere batteri, archea, eucarioti dalla parete:

- peptidoglicano (solo nei batteri) e quindi sensibilità ad antibiotici β-lattanici

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Membrana citoplasmatic

qui troviamo concentrate funzioni essenziali per un procariota, mentre negli eucarioti queste sono

distribuite nel sistema di membrane interne.

Simile a struttura di quella degli eucarioti.

funzione primaria di contenere l’interno cellulare - controllo scambi con l’esterno - sede di

importanti funzioni metaboliche (es metabolismo energetico

le proteine integrali hanno code che sporgono verso l’interno e verso l’esterno; LPP (lipoproteine)

collega il doppio strato lipidico della membrana con il foglietto interno della membrana esterna.

opanoidi: nei batteri sostituiscono gli steroli

La maggior parte degli ac