Appunti di Microbiologia generale

Ecoding sequence di cro; il trascritto è complementare all'ORF cro, quindi non loco di ca, e continua andando avanti e trascrivendo cI. cI è il repressore di lambda. A questo punto c'è tutto per decidere se fare ciclo litico o lisogenico. Cosa determina la decisione? Le condizioni nutrizionali del batterio. Ma come se ne accorge lambda? Ha evoluto cII in modo che diventi substrato di una proteasi batterica h (high frequency of lisogenization) - la sua assenza determina l'alisogenia. Il suo substrato è cII. Se lo "mangia" questo non può più attivare la trascrizione da P e quindi permettere la sintesi del repressore di lambda o di int. cII e cIII si complessano in modo che cIII "protegga cII", ma non abbastanza da renderlo insensibile a h. Se cII è attivo si ha sintesi del repressore di lambda e ciclo lisogenico. Correlazione h con stato nutrizionale del batterio; se cresce bene ha tempi brevi di generazione.

c'è un'alta concentrazione di h. Al contrario, h è basso e cII e cIII possono attivare i promotori P e PE IViene prodotto il repressore di λ; forma un dimero grazie alle porzioni C-terminali, mentre la porzione N-terminale lega gli operatori sul DNA. Un operatore è composto da tre sequenze (O 1, 2, 3 a seconda che siamo su R/L promotore L o R) di 17 coppie di basi intervallati da spaccar do 6/7 basi che si sovrappongono parzialmente al promotore P e al promotore P.L RDiverse affinità di cro e ccI: OR1>OR2>OR3Cro: OR3>OR2>ORSe c'è poco cro, il primo operatore a cui si lega sarà 3, bloccando pM e la trascrizione di cI. Una maggiore quantità di cro legherà poi 1 e 2, bloccando così anche la propria sintesi. Al contrario cI se ce n'è poco lega prima 1, bloccando sintesi cro. Azioni antagoniste di cro e cI66fi fi . fi . fl fl 1 . I . fl . fl . . fi ! fl Se si fa ciclo

litico si ha espressione di proteine virale enella cellula si accumulano, vengono liberati virioni. Nelcaso della lisogenia, l’unica proteina espressa di lambdaè cI. Ricombinazione sito speci ca. Il genoma viralecircolare a doppia elica viene integrato (integrasi) in unsito speci co del genoma di E.coli dove c’è unasequenza att. Lambda lisogeno è immune ad altri fagilambda simili perché produce il repressore, unicaproteina virale ad essere espressa. Blocca espressione deigeni virali essenziali per ciclo liticoRepressore di lambda è substrato di recA, proteasiUn dano al DNA viene riconosciuto da recA e ne attivala capacità proteasica. Togliendo il repressore si ha latrascrizione dei geni OSOS che intervengono nellariparazione dei danni al DNA indotti da mutageni sici ochimici. LexA e repressore di lambda sono substrati di recA. (Vedi libroSistema immunitario procarioticSi basa su due pilastri: sistemi di restrizione-modi cazione R-M

(paragonabile a un sistema di immunità innata, sempre presente e attiva) e sistema CRISP-CAS (paragonabile a quello adattivoR-M: costituito da due enzimi presenti naturalmente in batteri ed archea: endonucleasi di restrizione (taglia nei restriction sites il DNA a doppia elica - processo di restrizione) e sempre uno o due enzimi di modifica per modicare il DNA batterico e proteggerlo (da endonucleasi di restrizione!), es per metilazione.

EcoRI: taglia il legame desossirobosio-fosfato tra G e A, liberano estermità 5' sporgenti (stick ends

EcoRV: taglia tra T e A dando estremità blunt/piatte

Le metilasi associate saranno metilasi EcoRI o metilasi EcoRV che emiliano sulla A.

Nome EcoRI: E=escherichia; co=coli; R=ceppo RY13; I= primo enzima identicato il quel ceppo di E.coli

CRISP-CAS: Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated syste

Ci sono pezzi in cui ci sono ripetizioni anche di centinaia di volte di sequenze parzialmente

palindromiche intervallateda spacers (pezzetti che non si ripetono, diversi gli uni dagli altri, non batterici).67fi fi fi .

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fi .

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fiSistema costituito da una serie di enzimi codi cai da geni CAS, che tagliano DNA che viene dall'esterno (es virale/plasmidico) e lo integrano in piccolissimi pezzi dentro i loci CRISPR.Producono RNA che verrano maturati formando guide per altri enzimi CAS che porteranno questi enzimi CAS sul DNAdell'invasore, che in un secondo momento può infettare il batterio. Il DNA virale entra e il sistema CRISPR-CAS si èricordato! Mettendo un pezzo di DNA fagico integrato dentro il genoma batterico.Fase adattativa:piccoli frammenti di DNA a doppia elica di un virus o plasmide sono incorporati in un focus crispr, eenzimi cos tagliano il DNA dell'invasore, ne prendono un pezzo piccolo e lo integrano nelle sequenze parzialmentepalindromiche ripetute, repeats di 20-50bp (locus CRISPR - qui si immagazzina

L'informazione per la difesa). Le ultimele mettono sempre più vicine al promotore. In un secondo momento avviene la maturazione di un crRNA (crisprRNA). Si forma dunque un pre-crRNA, molto lungo, dal quale la RNA ribonucleasi III matura delle guide, piccoli crRNA, che possono guidare un enzima effettore Cas su delle sequenze speci che. Queste guide contengono infatti lo spacer, le basiche derivano da pezzi di fagi a cui il batterio era sopravvissuto in precedenza. Questi crRNA guidano la nucleasi (esCas9) sul crRNA, che si appaia alla sequenza contenuta nel genoma virale, che diventa target per l'azione dellanucleasi. Spacco del DNA invasore e sopravvivenza batterio. È necessario che vicino alle sequenze dello spacer sia presente una sequenza PAM, che consente il riconoscimento da parte delle proteine Cas1 e Cas2 nella fase adattativa e nella fase effettrice, per il riconoscimento degli spacer. Sistema molto diffuso nei procarioti, ma non serve solo a difendere

batteri da DNA invasore; coinvolto anche in altre funzioni 68.

Genome editing: modifica sito-specifica precisa che si può fare in una cellula; si basa su nucleasi o sul sistema crispr-cas, con cui si inseriscono pezzi di DNA in modo specifico e attivare geni e rimpiazzare sequenze sempre in modo specifico. Si taglia il genoma dove si vuole, si forma dunque un ds break che la cellula cerca di riparare con sistemi di homology repair o meno. Nel primo caso si potrebbe introdurre in una cellula un temprato che abbia omologia di sequenza con estremità del taglio, in cui dunque possiamo inserire DNA esogeno. Oppure non si inserisce DNA esogeno e si aspetta che avvenga un riattacco delle due estremità; a ciò si associa un'introduzione di errori. Ciò può inattivare un gene (magari per inserimento di STOP).

Vari applicazioni, anche in agricoltura.

Ricorda: RM e crispr sono tutti sistemi naturali! Evoluti dai procarioti per protezione daivirus3/0Sistematica: studio della diversità con cui i microrganismi procariotici si presentano su questo pianeta + aspetti relativi alle interazione tra loro e altri organismi. Mette insieme la tassonomia e la logenesi. La tassonomia si occupa di identificazione, denominazione (nomenclatura), classificazione nell'ambito delle conoscenze già possedute. Tassonomia polifasica si basa su criteri genotipici, fenotipici, logenetici e caratteristiche osservabili (morfologia, chimica cellulare, metabolismo, analisi lipidi). Analisi fenotipica: analisi delle caratteristiche osservabili come morfologia, motilità, nutrizione e fisiologia, relazione con O2, tolleranza a temperatura e pH ecc. Test API 20 di colture; si prendono in considerazione 20 "gallerie", aperte da un lato in cui si inseriscono liquido e batteri. A fondo di questo materiale di terreno di coltura disidratato che contiene vari componenti. Si incuba 24h poi si aggiungono reattivi chimici che mettono inevidenza un certo aspetto chimicoQuantità di GC usata per identi care microrganismi; altra tecnica è ibridizzazione DNA-DNA. Si prende l’acidonucleico di un microrganismo conosciuto, lo si marca radioattivamente, lo si ibrida con eccesso di altri microrganismi.Si creano condizioni sperimentali che permettono la riassociazione del DNA radiomarcato con eccesso del DNAdell’organismo xIn base alla percentuale di complementarietà tra eliche si stabilisce il grado di parentela.Se la percentuale di ibridazione è di almeno 70%, i due microrganismi, di cui 1 lo si conosce, sono della stessa specie.Se almeno del 25%, stesso genere. Se inferiore al 25%, generi diversiRibotyping: valido no a livello di specie. Si prende delle colonie di un microrganismo, si ampli ca RNA16s con PCR;l’ampli cato digerito con enzimi di restrizione e i frammenti si dividono per gel elettroforesiSi confronta con banca dati di bande di ribotyping e si può dire cheuna certa corsa ha il pattern di un rna16s appartenente a micorganismo xyz.
Analisi multilocus MLST: amplificazione DNA di nuovo isolamento di batterio x, con una serie di primers che consentono di amplificare allo stesso tempo 6/7 geni tramite PCR. Vengono poi sequenziati. Si fa paragone di sequenze di questi 6/7 geni con altri ceppi della stessa specie, si possono costruire alberi di correlazione - si stabiliscono istanze genetiche di correlazione, che possono variare da 0 no a 1, se sono molto distanti. Pag 389
Orologio evolutivo: usata molecola rRNA 16s (procarioti) e 18s (eucarioti). 16s costituisce impalcatura subunità minore dei ribosomi batterici e degli archea. Deve essere presente in tutti gli organismi che vogliamo confrontare e in cui vogliamo fare della logenesi molecolare. Deve avere la stessa funzione in tutti (omologo funzionale). I cambiamenti nella sequenza aa o nucleotidica che si possono accumulare devono riflettere la storia evolutiva; che siano poco frequenti e cambino.

Poco nel tempo, in modo che questa possa essere valutata come parametro tra microrganismi che si confrontano. 695

Fi fi fi.

Fi fifi fi fifi.

…

Fi fi fi fi.

Fi.

Fl fi.

.

Fi.

Fi Si ottengono sequenze, poi si calcolano le distanze evolutive, che sono proporzionali alle distanze evolutive tra i microrganismi considerati. Si possono quindi costruire alberi logenetici, i cui rami sono di lunghezza proporzionale alle quelle evolutive. Si ottengono così i domini degli archea, bacteria e eukarya. Si deve anche tener conto dell'impatto del trasferimento genico orizzontale; ha un effetto sull'alogenesi e sulle parentele evolutive. Acquisizione mitocondri e cloroplasti. Sono di origine microbica. Se si valuta la sequenza degli rRNA 16s nei mitocondri e lo si confronta con quello dei batteri, notiamo che ci sono somiglianze con alcuni proteobatteri (Rhizobium e Rickettsia), che sono parassiti intracellulari di piante e di animali. Trasferimento genico orizzontale da questi.

eucariota primitivo, che