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ANTIBIOTICI
Sostanze organiche a basso peso molecolare, nella maggior parte dei casi prodotte da organismi eucarioti (muffe, funghi) e tra i procarioti dagli streptomiceti. Funzionano a concentrazioni relativamente basse inibendo la crescita microrganismi in due modi: - Battericidi: uccidono i batteri - Batteriostatici: ne bloccano la crescita. Possono avere struttura molto complessa poiché sono prodotti dal metabolismo di altri organismi; non sono riconducibili ad un'unica classe chimica. Hanno diversi meccanismi d'azione. Sono caratterizzati da tossicità selettiva, ovvero interferiscono con proprietà uniche dei microrganismi, in modo da non danneggiare altre cellule. La specificità invece riguarda la capacità di danneggiare solo determinati tipi di batteri. Rivestimenti esterni alla membrana: - Parete: struttura rigida di rivestimento. Ci permette di distinguere i batteri in due grossi gruppi: gram positivi e gram negativi. Gli Archea si differenziano.perché pur avendo una parete è diversa da entrambi i gruppi batterici. La parete è presente in quasi tutti i tipi di batteri. - Capsula: generalmente composta da polisaccaridi, ma in alcuni pochi casi anche da proteine. È una struttura non essenziale, ovvero non sempre presente e non necessaria alla sopravvivenza, ma se presente conferisce ai batteri importanti proprietà. - Strati S: sono rivestimenti proteici con struttura estremamente regolare, definita quasi cristallina, che avvolgono tutta la cellula. LA PARETE Struttura rigida immediatamente esterna alla membrana cellulare, sensibile all'azione dell'enzima idrolitico lisozima che digerisce la parete. Esso è ampiamente diffuso negli organismi, prodotto da una serie di cellule (anche umane) con funzione antibatterica. Funzioni della parete: determinare la forma della cellula e proteggerla dalla lisi osmotica. Danni alla parete portano spesso alla morte della cellula per lisi. La struttura eLa composizione della parete ci permette di distinguere i Bacteria in due gruppi: gram positivi e gram negativi. Sono così chiamati perché rispondono in modo diverso ad una specifica colorazione detta di Gram. Il microscopio elettronico a scansione non è in grado di farceli distinguere, ma si usa il microscopio elettronico a trasmissione. Nei gram positivi la parete è a diretto contatto con la membrana plasmatica ed è costituita da un unico spesso strato di peptidoglicano, mentre nei gram negativi è pluristratificata per la presenza della seconda membrana. Oltre al microscopio elettronico a trasmissione, un metodo di riconoscimento è la colorazione di Gram, che mette in evidenza la diversa struttura e composizione della parete cellulare dei due gruppi batterici. In realtà la risposta alla colorazione di Gram non sempre corrisponde alla classificazione tassonomica dei batteri. La classificazione, come vedremo, tiene conto di alcune
Peculiarità non sempre evidenziabili con la colorazione di Gram.
COLORAZIONE DI GRAM
Venne messa a punto dal microbiologo danese Gram a fine 800, prima che fossero disponibili strumenti di indagine fine, come analisi biochimiche, e quindi non si conosceva ancora la composizione precisa della parete cellulare. È usata ancora adesso, perché è semplice, non richiede attrezzature particolari ed è piuttosto rapida (15-20 minuti). È un metodo di indagine molto potente, perché, con qualche eccezione, ci permette di stabilire il gruppo di appartenenza dei batteri e quindi la struttura cellulare. Come si esegue?
- Si prende un po' di coltura del batterio che vogliamo esaminare e la si pone su un vetrino. Si asciuga il liquido, in modo che sul vetrino rimanga solo lo strato di batteri.
- Processo di fissazione: il vetrino viene passato rapidamente alla fiamma per garantire una salda adesione della coltura batterica al vetrino.
- Colorazione vera e propria:
propria: Cristalvioletto. Le cellule si colorano di violetto.
Si aggiunge un mordenzante, una soluzione di iodio (liquido di Lugol) che faaderire più fortemente il colorante alle strutture cellulari.
Decolorazione con soluzione contenente alcol per 20-30 secondi. Questo è lo stepche consente di discriminare i batteri gram positivi dai negativi. I positivitrattengono il colorante anche dopo il trattamento, mentre i negativi sonorapidamente decolorati.
Contro colorazione. I batteri vengono trattati con un altro colorante, la safraninache colora di rosa. I gram positivi risultano violetti, mentre i gram negativi rosa.
4. Esame al microscopio Colorazione gram su popolazione mista di batteri.L'appartenenza al gruppo di gram positivi o negativi non è in alcunmodo correlata alla forma.è la più semplice delle due. Il doppioParete gram positivi:strato fosfolipidico della membrana plasmatica è a contattodiretto con uno
Spesso strato di peptidoglicano, in cui però sono presenti altre molecole: polisaccaridi come aciditecoioci o lipotecoici (questi ultimi con modificazione lipidica per ancorarsi al foglietto esterno della membrana plasmatica sottostante) e proteine dette proteine associate alla parete, perché covalentemente ancorate al peptidoglicano, che svolgono specifiche funzioni. Gli acidi tecoici hanno il ruolo di rafforzare la parete, conferiscono alcune proprietà chimico-fisiche alla parete e costituiscono antigeni di superficie specifici che sono riconosciuti dalle cellule del nostro sistema immunitario, in modo che possa mandare opportune risposte. Al di sopra della membrana plasmatica c'è un sottile strato di peptidoglicano e al disopra di questo la membrana esterna. Lo strato tra le due membrane è il periplasma. La membrana esterna è di natura lipidica ma, a differenza della membrana plasmatica, è asimmetrica perché
contiene fosfolipidi nel foglietto interno e un lipopolisaccaride nello strato esterno e poi ci sono una serie di proteine associate. Le due pareti hanno struttura e composizione diversa, messe in evidenza dalla colorazione di gram. Come accade? La decolorazione con alcol danneggia il lipopolisaccaride della membrana esterna dei gram negativi a cui era legato il cristalvioletto. I gram negativi quindi si decolorano e possono poi colorarsi di rosa con l'aggiunta della safranina. Il peptidoglicano costituisce una struttura rigida a cui corrisponde uno strato sottile nei gram negativi e molto più spesso nei gram positivi, ma hanno composizione praticamente identica. Nell'immagine al microscopio elettronico a fianco sono evidenziati dei sacculi di mureina (sinonimo di peptidoglicano) isolati dal Bacillus megaterium, batterio di dimensioni maggiori alla media. Dalla figura si vedono i "sacchetti" di mureina che contenevano i batteri e che si sono aperti a causa della.blanda digestione con lisozima che ne ha provocato una parziale rottura per consentire il rilascio delle cellule batteriche. Esse, rivestite unicamente dalla membrana, fuoriescono dalla struttura rigida della parete; si recupera solamente l'involucro quasi del tutto intatto, utile per capire come sono fatti i sacculi, il cui insieme crea lo strato di peptidoglicano. Abbiamo visto che le due funzioni del peptidoglicano sono dare forma alla cellula e proteggerla. Se la cellula è posta in soluzione ipotonica in presenza di lisozima (o qualsiasi altra cosa danneggi la parete o impedisca la sintesi del peptidoglicano), esso digerisce parzialmente la parete del batterio. Questo processo porta la cellula a fuoriuscire dalla struttura di rivestimento, ma dal momento che la concentrazione di soluti nella soluzione è molto bassa, l'acqua tende ad entrare nella cellula batterica, fino a causarne la lisi. Se la parete è intatta la lisi non accade, perché la pareteproteggedalla lisi osmotica, impedendo all’acqua di entrare nella cellula batterica. È molto importante perchéle soluzioni ipotoniche sono la maggior parte degli habitat dei batteri, di conseguenza la lisi osmoticaè un processo molto comune. Se la soluzione invece è isotonica(condizione difficilmente ritrovata in natura), la cellula batterica restaintatta anche una volta che la parete è stata distrutta dal lisozima. Lacellula batterica rivestita solo di membrana cellulare prende il nome diprotoplasto. I protoplasti hanno tipicamente forma sferica, anche seall’inizio avevano una forma diversa; questo a dimostrazione del fattoche il peptidoglicano conferisce la forma alla cellula batterica.
Com’è fatto il peptidoglicano?Il peptidoglicano, anche detto mureina, è una macromolecolatipicamente associata alle pareti cellulari dei procarioti, ma con ledovute eccezioni. La prima eccezione è rappresentata dagli Archea,
chehanno parete cellulare, ma fatta da molecole di natura diversa. Tra ibatteri invece fa eccezione un piccolo gruppo, quello dei mollicuti, i quali hanno una membrana plasmatica diversa che garantisce la sopravvivenza anche in assenza di parete. Il peptidoglicano è un eteropolimero di glucosio sostituito. È costituito da 2 amino zuccheri: la N-acetilglucosamina e l’acido N-acetilmuramico. A quest’ultimo sono legati gli aminoacidi, in ordine: L-alanina, acido D-glutammico, acido meso-diaminopimelico (acido modificato), D-alanina. Contiene D-aminoacidi, mentre quelli che costituiscono le proteine cellulari sono in forma L; una delle ragioni è per renderlo resistente alle proteasi. I 2 aminozuccheri sono tenuti assieme da legame beta 1-4 glicosidico, il legame che viene idrolizzato dal lisozima quando attacca la parete. In figura l’unità di base, ovvero il monomero, anche definito glicano tetrapeptide. L’unità monomerica realmentesintetizzata dallacellula è però un glicano pentapeptide, come vedremo in seguito. Le unità monomeriche vengonopolimerizzate per formare una serie di filamenti, poi tenuti assieme da ponti peptidici tra aminoacidiche si trovano su glicani adiacenti. I ponti peptidici, anche detti legami crociati tetrapeptidici olegami transpeptidici, conferiscono al peptidoglicano una struttura tridimensionale che rivestel’intera cellula e la protegge. Il risultato della formazione di questo legame è che i due filamentiglicanici risultano legati in modo covalente. Questi legami si formano per la maggior partelateralmente ai peptidi; questo fa sì che la struttura complessiva diventi molto stabile e resistente.Nella reazione di transpeptidazione in cui si formano i ponti peptidici, un filamento di glicano fungeda donatore e uno da ricevente. Il donatore è neosintetizzato ed è pentapetide (legato a 5aminoacidi anziché a 4), mentre il riceventeè maturo, rivestegià la cellula, ed è tetrapepti
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