Appunti microbiologia applicata

Introduzione alla microbiologia

La cellula è l’unità fondamentale strutturale e funzionale, in cui è organizzata la materia vivente. Ne esistono di diversi tipi. Tutti gli organismi sono composti da cellule e si dividono in eucarioti e procarioti. Gli eucarioti si dividono a loro volta in base al numero di cellule in pluricellulari (animali, piante…) e unicellulari (funghi, alghe, muffe, protozoi…). I procarioti invece sono unicellulari e includono batteri ed Archea. Si differenziano dagli eucarioti perché:

• Nucleo assente
• Diverso meccanismo riproduttivo, in genere divisione cellulare
• Presenza di parete cellulare, assente negli eucarioti animali, ma presente in quelli vegetali
• Assenza di molti organelli, ma non per questo mancano di certe funzioni. Per esempio, non hanno mitocondri, ma sono comunque in grado di fare la respirazione. Ci sono strutture che prendono il ruolo di organelli presenti negli eucarioti.

Batteri ed Archea non costituiscono un gruppo filogeneticamente omogeneo, cioè hanno avuto un’evoluzione diversa, come si può vedere nell’albero filogenetico universale. Esso è in grado di stabilire le relazioni di parentela tra i diversi organismi viventi. Il punto in basso dove i rami si uniscono è detto radice dell’albero. Gli Archea derivano da una diramazione precoce della linea evolutiva che ha portato agli eucarioti. Per questo Archea e Bacteria sono molto diversi; gli Archea assomigliano più agli eucarioti, dato il periodo di evoluzione in comune. Le differenze tra i batteri e gli Archea sono:

• Gruppo più numeroso (Bacteria) | Meno numerosi (Archea)
• Unici procarioti patogeni, sono i più importanti dal punto di vista medico (Bacteria) | Non conosciamo Archea patogeni
• Pochi vivono in ambienti estremi, cioè ambienti incompatibili con la sopravvivenza della maggior parte degli organismi (Bacteria) | Vivono in ambienti estremi, per esempio con temperature, pressione o salinità elevata (Archea)
• Nessuno produce metano (Bacteria) | Producono metano (Archea)
• Includono tutte le specie procariotiche che fanno la fotosintesi (Bacteria) | Non fanno fotosintesi (Archea)

Altre differenze sono dettagli molecolari come: composizione della membrana citoplasmatica, della parete, apparato trascrizionale e traduzionale. Queste differenze hanno un’importante conseguenza: l’azione antibiotica è efficace solo sui batteri. Sugli Archea gli antibiotici non funzionano, ma per fortuna non ne esistono di patogeni.

Definizione microbiologia

La microbiologia si occupa di microrganismi (organismi microscopici) sia procarioti che eucarioti (es: lievito), ma anche di virus. Questi ultimi non sono organismi cellulari, ma sono parassiti obbligati che utilizzano altre cellule procariote o eucariote per la loro replicazione, con modalità molto diverse. I microrganismi sono esseri piccoli, ma non per questo semplici. Sono così chiamati per le loro dimensioni ridotte. Le dimensioni tipiche della cellula batterica sono attorno a 1 micron (da 1 a 5 micron di lunghezza e larghezza 1 micron). Sono oggetto di studio della microbiologia, una scienza relativamente giovane rispetto ad altre, poiché è nata solo con l’avvento del microscopio. In questa prima parte ci occuperemo del suo sviluppo storico.

Temi fondamentali della microbiologia

• Scienza di base con l’obiettivo di capire i fenomeni della vita
• Scienza applicativa poiché sviluppa applicazioni alle necessità dell’uomo

Storia della microbiologia

La microbiologia “consapevole” nasce dopo l’invenzione del microscopio ottico, perché, date le piccole dimensioni, era impossibile vedere i microrganismi ad occhio nudo. Già prima si sospettava della loro esistenza, infatti alcune malattie infettive erano già note. Si parlava di “aria contaminata”, pur non sapendo contaminata da cosa, che era in grado di diffondere certe malattie. L’invenzione del microscopio si deve ad un mercante di stoffe islandese e risale ai primi del 700. Il suo obiettivo era solo quello di guardare le trame delle sue stoffe, invece questo microscopio rudimentale gli ha permesso di vedere i microrganismi, che descrisse come “numerosissimi come numero di individui e come numero di specie che stanno praticamente ovunque” e li disegnò.

I microrganismi però entrarono a far parte delle specie viventi anni e anni dopo, solo dopo aver smantellato la teoria della generazione spontanea, in voga tra gli scienziati del tempo. Essa sosteneva che la vita può essere generata da materia organica: lasciando all’aria aperta cibo o materiale organico per molto tempo, questo risultava brulicante di batteri e anche di organismi superiori come larve e vermi (avviene per la putrefazione). Si domandavano: da dove derivano, dato che non sono presenti nel cibo fresco?

Francesco Redi smantellò questa teoria dimostrando che le larve di insetto si originano dalla carne solo se le mosche depositano le uova. Definitivamente fu smantellata da Pasteur con l’esperimento delle fiasche a collo di cigno, a metà dell’800. Prese un brodo organico, ricco di nutrienti per i microrganismi e lo versò in una fiasca, con collo modellato alla fiamma per avere una forma particolare, detta appunto “a collo di cigno”. Pasteur scaldò il liquido fino alla bollitura (metodo usato ancora oggi per sterilizzare, ovvero eliminare ogni tipo di forma vivente, tra cui i microrganismi). La bollitura forzava il vapore ad uscire, sterilizzando anche la parte immediatamente adiacente del collo di cigno. Lasciò poi raffreddare il liquido e dimostrò che rimaneva sterile (limpido) per molto tempo. Se però il recipiente veniva piegato e il liquido finiva a contatto con la parte finale del tubo non sterilizzata, allora in poco tempo il liquido veniva contaminato e i microrganismi crescevano, fenomeno accompagnato da torbidità. Questo esperimento dimostrò che non poteva esistere la generazione spontanea.

Si giunse alla conclusione che i microrganismi non sono presenti nella sostanza organica, ma altrove, come nella polvere che si era depositata all’estremità del collo di cigno. Pasteur è stato fortunato in questo esperimento perché non aveva usato un liquido contaminato da spore, altrimenti queste sarebbero resistite alla bollitura e prima poi sarebbero germinate causando la proliferazione dei microrganismi. Solo quando si sono scoperte le spore hanno capito che non bastava la bollitura e nemmeno gli UV per eliminarle: serve uno strumento chiamato autoclave.

Un’altra importante scoperta di Pasteur è che le fermentazioni sono opera dei microrganismi, che quindi possono risultare utili all’uomo. Le fermentazioni erano usate sin dall’antichità, ad esempio per la produzione di bevande alcoliche nell’antico Egitto. Si credeva fosse una semplice reazione chimica, in cui il calore utilizzato per la preparazione di queste bevande, determinava la trasformazione dello zucchero in alcol. In realtà Pasteur dimostrò che questo processo, chiamato da lui fermentazione, avviene ad opera di microrganismi, in particolare grazie ad alcuni specifici ceppi di lievito. Come lo scoprì? Pasteur fu contatto da un’importante azienda vinicola francese le cui vendite erano crollate a causa dell’acidità del vino. Capì che il vino era stato contaminato da altri microrganismi procarioti che convertivano lo zucchero in acido lattico anziché in etanolo, dando quel sapore acido e rendendo il vino imbevibile. Scoperta la causa, trovò la soluzione: scaldare il vino per uccidere i contaminanti, essendo particolarmente sensibili al calore. Questo processo ha preso da lui il nome di pastorizzazione ed è usato ancora oggi per il trattamento di alcuni prodotti, tra cui il latte.

Pasteur studiò anche i microrganismi patogeni, isolando alcuni batteri patogeni. Fu il primo a riconoscere il concetto di microrganismi “attenuati”, ovvero patogeni che hanno perso parte della loro patogenicità e quindi possono essere usati per vaccinare, stimolando un’opportuna risposta immunitaria, utile se poi si incontra davvero il patogeno.

Un altro importante microbiologo medico tedesco è Koch, vincitore del premio Nobel per la medicina nei primi del 900. Ha individuato il patogeno Bacillus anthracis, agente eziologico del carbonchio (o antrace) e particolarmente pericoloso perché sporigeno. Ha sviluppato tecniche per la coltivazione dei microrganismi usate ancora oggi e il concetto di coltura pura (originata da un solo tipo di batterio) e come ottenerla. Inoltre, ha isolato l’agente responsabile della tubercolosi: il Mycobacterium tubercolosis. A fine 800 ha sviluppato i postulati di Koch, che hanno permesso di trovare il nesso causa-effetto, tra agente patogeno (causa) e malattia (effetto):

• L’agente responsabile è presente negli individui malati e assente nei sani.
• L’agente deve essere isolato dall’individuo infetto e, posto in coltura, dare origine ad una popolazione cellulare omogenea.
• L’inoculo di una coltura pura dell’agente causale in individui sani deve dar luogo alla comparsa della malattia di cui è ritenuto responsabile.
• L’agente causale può essere re-isolato dall’organismo infettato sperimentalmente.

Altri importanti microbiologi sono Winogradsky (russo) e Beijerinck (islandese) che hanno studiato i microrganismi dell’ambiente (non più i patogeni) e come siano importanti agenti di cambiamenti ambientali. Sono infatti fondamentali per il riciclo di elementi nell’ambiente, quindi per mantenere e consentire la crescita di tutti gli altri organismi animali e vegetali, permettendo loro di recuperare i nutrienti di cui hanno bisogno. I due microbiologi hanno scoperto: l’esistenza dei cicli biogeochimici, che i microrganismi vivono in comunità e che soprattutto interagiscono con altri organismi sia animali che vegetali. Hanno anche sviluppato dei terreni di arricchimento, ovvero terreni che consentono la crescita soltanto di particolari tipi di microrganismi, mediante i quali hanno isolato batteri azotofissatori, autotrofi e chemiolitotrofi.

I microrganismi sono stati strumenti indispensabili per passare dalla biologia di base a quella molecolare. Un esperimento di Griffith ha suggerito che il DNA è il materiale ereditario ed è stato dimostrato definitivamente da un suo studente. Un altro passo importante è quello dei due scienziati Beadle e Tatum che hanno sviluppato la teoria un gene – un enzima, l'idea cioè che un gene è specifico per un singolo enzima, usando come organismo test la Neurospora crassa. Mettono le basi per la biologia molecolare moderna.

L’organismo modello per eccellenza è però Escherichia coli; è stato fondamentale per studi che hanno portato alla scoperta della natura di DNA, RNA e proteine. Questi esperimenti ci hanno fatto capire come l’informazione sia conservata nel DNA della cellula e convertita in proteine.

Altre tappe fondamentali della storia della microbiologia

• Fine anni 20: Alexander Fleming scopre gli antibiotici dal fungo Penicillium notatum, che produceva con il suo metabolismo secondario l’antibiotico penicillina. Questo, così come molti altri antibiotici, era quindi un prodotto naturale. Fino agli anni 50 si ha il periodo d’oro per le scoperte degli antibiotici, tra cui molti usati ancora oggi.
• Anni 40: Luria e Delbruck cominciano ad isolare mutanti batterici. Si inizia a fare genetica sui microrganismi e si ha l’ingresso del Darwinismo nel mondo dei batteri. Non si pensava che valessero le stesse regole genetiche degli organismi superiori, ma un esperimento di questi due scienziati dimostra che valgono anche per i procarioti, che infatti si comportano allo stesso modo a livello genetico.
• 1944: un batterio è “trasformato” con DNA puro. Nasce la biologia molecolare moderna.
• Anni 70: costruzione in vitro di una molecola di DNA funzionante, ovvero l’informazione contenuta poteva essere espressa nell’organismo in cui veniva introdotta. Avviene grazie agli enzimi di restrizione, enzimi tipicamente presenti nei batteri. Essi sono in grado di tagliare il DNA in specifici punti. Sono meccanismi di difesa poiché rompono il DNA di organismi esterni impedendone l’ingresso, poiché potrebbe essere dannoso per il batterio. Nasce così l’ingegneria genetica.
• 1978: si riesce a sequenziare il DNA. Il primo organismo sequenziato è ovviamente molto piccolo, un batteriofago.
• Anni 80: viene introdotta la PCR, strumento per amplificare qualsiasi sequenza di DNA più di un milione di volte. Ha infinite applicazioni. La sua nascita è legata allo studio di microrganismi termofili. La prima polimerasi termostabile era infatti chiamata tacpolimerasi, dal nome dell’organismo termofilo Thermus acquaticus.
• 1995: fondazione del TIGR. Viene interamente sequenziato il genoma di un organismo, il batterio Haemophilus influenzae, quindi ancora relativamente piccolo. Nasce così l’era genomica. Ora siamo in grado di sequenziare genomi molto più grandi e di annotarli, ovvero comprendere per quali proteine ed enzimi codificano.
• Dal 2000 in poi si ha l’era post-genomica. Oggi siamo in grado di analizzare non solo l’informazione, ma anche le risposte che un organismo è in grado di attivare in funzione di diversi stimoli. Oltre alle analisi genomiche, vengono fatte analisi trascrittomiche (insieme dei mRNA) e proteomiche (di tutte le proteine). Tutte queste analisi hanno dato nel loro insieme il via alla biologia dei sistemi, descrizione globale dei fenomeni biologici.

Batteri

Dimensioni media tra 1 e 2 micron. Possono avere forme diverse, ma la forma, in genere, ci dice poco o niente sulle loro caratteristiche, tranne in alcuni casi. I batteri sono suddivisi in base alla forma in:

• Cocchi: forma sferica.
• Bastoncelli: forma allungata.
• Spirilli: forma a spirale, con una o più curvature, un po’ meno frequente.
• Spirochete: forma allungata. Possiedono una sorta di flagello interno, una struttura proteica che occupa parte del citoplasma e conferisce loro questa forma “ondulata”.
• Prostecati: batteri con prolungamenti costituiti da citoplasma e avvolti da membrana. Tipicamente sono acquatici ed usano i prolungamenti per aderire a materiale biotico o abiotico.
• Filamentosi: Le cellule crescono attaccate tra di loro. Ognuna ha la propria identità, ma nell’insieme hanno una forma anastro.

I batteri possono trovarsi isolati o in aggregati multicellulari (colonie, miceli, biofilm…). Tra questi, le colonie sono le principali. Hanno il vantaggio di essere visibili ad occhio nudo e sono utili per ottenere colture pure. Molto importante è anche il biofilm: non può essere creato da tutti, ma dipende dalla capacità dei batteri di produrre e poi secernere dei polisaccaridi chiamati esopolisaccaridi, che una volta secreti avvolgono i batteri in strutture molto ben organizzate. Ha funzione protettiva: li difende da agenti tossici esterni, compresi gli antibiotici. I biofilm hanno anche proprietà adesive, quindi consentono di aderire strettamente a superfici sia biotiche che abiotiche. Gli organismi che formano biofilm sono particolarmente pericolosi proprio per questo, perché possono attaccarsi ai nostri tessuti in modo saldo e resistere agli antibiotici. I miceli invece sono formati tipicamente da organismi eucariotici (funghi), ma tra i batteri che li formano ci sono gli streptomiceti. Sono importanti produttori di antibiotici, che usano per difendersi da altri batteri.

I batteri possono infine trovarsi in aggregati caratteristici di poche cellule: le sarcine formano strutture a cubo tipicamente di 8 cellule e gli streptococchi, come Streptococcus pneumoniae che cresce a coppie di cellule.

Elenchiamo ora una serie di microrganismi per mostrare la loro grande variabilità. Sono per la maggior parte immagini di microscopio elettronico a scansione (SEM). I nomi sono composti dal genere scritto con la lettera maiuscola, seguiti dalla specie scritta tutta minuscola, entrambi in corsivo (o italico). Il nome può richiamare qualche caratteristica o funzione del microrganismo.

• Brucella abortus: patogeno degli animali da allevamento. Così chiamato perché se colpisce le femmine incinte spesso causa un aborto.
• Anabaena sp: cianobatterio filamentoso che fissa l’azoto. Ci sono delle eterocisti, ovvero cellule specializzate che compiono la fissazione dell’azoto.
• Enterococcus faecium: cocco gram positivo. È un commensale, ovvero vive nel nostro intestino e generalmente non ci danneggia, ma in alcune condizioni può diventare patogeno e quindi viene definito patogeno opportunista.
• Staphylococcus aureus: batterio gram positivo patogeno. Causa diversi tipi di patologie, da infezioni della pelle fino ad endocarditi e infezioni delle ossa. Si chiama aureus perché quando viene seminato su piastre di terreno solido forma aggregati multicellulari che hanno un aspetto dorato, perché produce un pigmento di questo colore. È un patogeno opportunista perché si può trovare come abitante della normale microflora del naso faringe (non in tutti gli individui) ed è in questo caso innocuo, ma se le difese immunitarie sono indebolite il batterio può cambiare distretto e diventare patogeno.
• Streptococcus pyogenes: batterio patogeno spesso associato a faringiti nei bambini. Può provare anche infezioni della pelle.
• Bacillus cereus: è un bastoncello gram positivo. È poco pericoloso ma può contaminare i cibi. Sporigeno.
• Bacillus anthracis: stesso genere del precedente, ma diversa specie. Sempre gram positivo e bastoncello, ma molto più pericoloso ed essendo sporigeno aumenta la pericolosità. Le spore possono arrivare fino ai polmoni e causare l’antrace, che se non curata tempestivamente porta alla morte dell’individuo.
• Bradyrhizobium sp: non è pericoloso. Può vivere sia in forma libera che in simbiosi con le piante.