Appunti esame Biologia molecolare delle cellule staminali (BMCS)

Il ruolo di linc-RoR nella regolazione di Oct4 e miR-145 durante il differenziamento

Quindi, le poche molecole di miR-145 che vengono trascritte vengono sequestrate da linc-RoR. Di conseguenza, miR-145 non reprime la trascrizione di Oct4 e Oct4 viene prodotto. A sua volta Oct4 attiverà linc-RoR.

Cosa succede quando parte il differenziamento? I livelli prodotti dalla trascrizione del gene Oct4 cominciano a decrescere. Un iniziale input differenziativo viene amplificato in una risposta netta. Quindi, Oct4 non deve più essere espresso. Infatti, il differenziamento è iniziato e non si deve tornare indietro. Di conseguenza, si comincia a produrre una certa quantità di miR-145. Inoltre, si verifica un iniziale abbassamento dei livelli di linc-RoR dovuto al fatto che la trascrizione di linc-RoR diminuisce. miR-145 non sarà più efficacemente bloccato a livello post-trascrizionale dalla spugna linc-RoR. Quindi, miR-145 inizierà a reprimere post-trascrizionalmente gli mRNA di Oct4.

Per dimostrare il ruolo di linc-RoR dovrei mutare la...

sequenza complementare al seed dimiR-145. In questo modo miR-145 non potrà più legarsi a linc-RoR. A questo punto, se lecellule differenziano allora questo significa che linc-RoR, proprio perché lega miR-145,gioca un ruolo nel mantenimento della pluripotenza.let-7 è un miRNA che viene legato e mantenuto attivo da Oct4, Sox2 e Nanog. let-7 è statoscoperto per la prima volta nei nematodi. Il nematode ha una caratteristica moltointeressante perché l’uovo prima di passare alla fase adulta passa attraverso 4 fasi larvali(L1, L2, L3, L4). Furono quindi scoperti geni che non venivano tradotti in proteina ma lacui mutazione causava dei difetti nello sviluppo temporale del verme. I geni per losviluppo che, quando mutati, provocano o l’arresto in una di queste fasi o il salto in unadi queste fasi, vengono detti geni eterocronici. In particolare, la funzione di let-7 èimportante per la transizione da L4 allo stadio adulto. La mutazione

Per le cellule staminali del cancro. Quando let-7 si attiva i suoi target si spengono. Quindi, let-7 regola questa transizione tra l'auto-rinnovamento e il differenziamento. let-7 è attivato trascrizionalmente da Oct4, Sox2 e Nanog ma gioca un ruolo nel differenziamento. Semisuriamo i livelli di pri-let-7 e di pre-let-7 nelle staminali embrionali osserviamo che questi sono già espressi al giorno zero quando le staminali embrionali stanno auto-rinnovando. Il miRNA maturo let-7 si trova espresso solamente a differenziamento avviato. Ci deve essere qualche fattore che non a livello trascrizionale ma a livello post-trascrizionale tiene spento let-7 prima del differenziamento. Questo fattore si chiama LIN28. LIN28 è una proteina di legame all'RNA. Non è né un fattore trascrizionale né un lncRNA (fai attenzione!). Questa proteina riconosce il pre-let-7 e inibisce il processamento da parte di Dicer. Quando le cellule differenziano allora let-7 si attiva.

let-7 attivato andrà a reprimere lo stesso LIN28 legando il 3'UTR del messaggero di questa proteina LIN28. Quindi, let-7 e LIN28 si reprimono a vicenda. Nelle staminali embrionali non differenziate LIN28 è mantenuto attivo da Oct4, Sox2 e Nanog. Quindi, i fattori core di pluripotenza attivano let-7 e attivano LIN28. In questo modo le cellule sono subito pronte a differenziare. Grazie a esperimenti in cui let-7 veniva fornito a cellule DGCR8 -/- e andando ad analizzare quali erano i geni regolati, si è visto che let-7 agisce reprimendo molti dei target positivamente attivati dai fattori core di pluripotenza e reprimendo c-Myc. Quindi, let-7 ha diversi bersagli all'interno della cellula.

Oggi parleremo delle cellule staminali adulte del tessuto muscolare. Queste cellule vengono dette cellule satelliti. Si tratta di cellule unipotenti che sono in grado di dare origine solo a cellule muscolari. Servono a rigenerare i tessuti danneggiati e servono per il turnover tissutale.

Peculiari di quel tipo di cellula staminale adulta. Un'altra caratteristica di queste cellule è il fatto di essere rare. Le cellule satelliti si trovano in una nicchia in uno stato di quiescenza. Questo stato di quiescenza è caratterizzato da una down-regolazione di tutti quei geni che sono coinvolti nel ciclo cellulare. Anche il metabolismo di queste cellule sarà ridotto al minimo. Esistono poi alcuni fattori che risultano essere up-regolati e si tratta di quei fattori che sono coinvolti nel mantenimento dello stato di quiescenza. Quando queste cellule vengono attivate vengono spinte ad entrare nel ciclo cellulare. Ovviamente queste cellule per riuscire ad entrare nel ciclo cellulare hanno bisogno di un po' di tempo. In realtà, nel tessuto muscolare esiste anche un'altra forma di cellula satellite che è chiamata cellula satellite attivata. Quindi, alcune cellule saranno completamente quiescenti mentre altre potranno trovarsi in uno stato

di allerta. Queste cellule in allerta sono più prone ad entrare nel ciclo cellulare. Per questo, il passaggio di entrata nel ciclo risulterà essere più rapido. Il muscolo rappresenta il 30-40% della nostra massa corporea. Le cellule satelliti sono le cellule staminali adulte del muscolo scheletrico. A partire dal mesoderma si originano i somiti. Il miotomo è la regione dei somiti da cui prende origine il muscolo scheletrico. Il somite subisce delle influenze da tutti i tessuti circostanti. Si formeranno quindi specifici distretti e dal somite prenderà origine il dermomiotomo. Dal dermomiotomo si origineranno poi il dermatomo e il miotomo. Dal miotomo si originerà il muscolo. Dal labbro epiassiale del miotomo si andranno a formare i muscoli del dorso mentre dal labbro ipoassiale del miotomo si formeranno i muscoli degli arti e della parete del corpo. Durante lo sviluppo embrionale, oltre alla formazione del muscolo dobbiamo pensare a preservare delle

cellule che nondovranno andare incontro a differenziamento. Ci sono quindi delle cellule che migrano in quella che sarà la futura nicchia. Nell'individuo adulto i muscoli saranno completamente formati. Nella stessa fibra muscolare avremo più nuclei. Oltre a questi sincizi avremo delle cellule che andranno a posizionarsi tra la fibra muscolare e la lamina basale. Queste cellule hanno un nucleo molto grande e un citoplasma ridotto. Una volta attivata, questa cellula andrà a dividersi. Le 2 cellule figlie potranno avere degli stimoli differenti in base all'orientamento della divisione. Al momento della migrazione è fondamentale Pax3. Nell'individuo adulto le cellule satelliti sono caratterizzate dall'espressione di Pax7. Altre cellule satelliti esprimono sia Pax3 che Pax7. Quindi, Pax3 è fondamentale per lo sviluppo embrionale mentre Pax7 è importante dopo la nascita. Per il differenziamento in senso muscolare sono fondamentali 2

Satelliti vanno a rigenerare la fibra muscolare. Il danno viene quindi riparato. Come hanno fatto a identificare queste cellule satelliti? Nel 1961 Mauro stava analizzando delle sezioni di muscoli di rana al microscopio elettronico. Si accorse che c'erano delle cellule che si trovavano alla periferia delle fibre muscolari. Ipotizzò che i nuclei di queste cellule fossero diversi da quelli dei sincizi. A causa dellaposizione chiamò queste cellule "cellule satelliti". All'epoca non si sapeva nulla della rigenerazione dei muscoli. Mauro ipotizzò che queste cellule dovessero essere coinvolte nella rigenerazione. Nelle fibre mature i nuclei si trovano alla periferia. Le cellule satelliti hanno un nucleo molto grande. Ecco perché queste venivano confuse con le altre cellule muscolari. Oltre alle rane hanno studiato anche i topi. Oggi, grazie all'identificazione di Pax7 è possibile riconoscere queste cellule in maniera rapida ed evidente.