Appunti esame biologia dello sviluppo

In base alla formazione del celoma distinguiamo i metazoi in protostomi e deuterostomi.

I protostomi si riproducono per schizocelia mentre i deuterostomi si riproducono per

enterocelia. Un’altra caratteristica dei deuterostomi è quella di possedere le cavità

amniotica. In base alla presenza o meno della cavità amniotica si distinguono organismi

anamni e organismi amnioti. La cavità amniotica ha reso possibile lo svincolo della

riproduzione dall’ambiente acquatico. Le caratteristiche principali dello sviluppo sono 1)

ordine e diversità e 2) continuità della vita. Ordine perché lo sviluppo è caratterizzato da

una serie di eventi che rispettano tempi precisi; la diversità è data ad esempio da tutte le

diverse cellule che si trovano all’interno dello stesso embrione; tutte queste

caratteristiche permettono la continuità della vita.

Nella vita di un organismo si distinguono 2 fasi principali: nella prima fase si assiste al

differenziamento dei tipi cellullari e quindi alla morfogenesi e all’accrescimento ossia

l’aumento in dimensioni (raggiunta una certa taglia si raggiunge la maturità sessuale);

nella seconda fase si ha invece la riproduzione. La riproduzione sessuale o gametica ha 3

fasi fondamentali: 1) la riproduzione che riguarda la formazione dei gameti, 2) la

sessualità e quindi l’unione dei gameti; 3) lo sviluppo ossia l’accrescimento dello zigote.

La sessualità non è un processo riproduttivo ma è un processo di adattamento che

garantisce una maggiore variabilità di DNA. Due batteri ad esempio possono comunicare

tra loro mediante un ponte citoplasmatico e quindi attraverso pili, ma alla fine di questo

processo non si osserverà un aumento del numero di individui. Parliamo quindi di

sessualità e non di riproduzione. Esistono poi anche altri modelli. Due parameci formano

un ponte citoplasmatico. I micronuclei vanno incontro a meiosi formando 8 micronuclei

aploidi. I macronuclei e tutti i micronuclei eccetto uno degenerano. Il micronucleo

rimasto si divide formando un micronucleo stazionario e un micronucleo migrante. I

micronuclei migranti attraversano il ponte citoplasmatico e fecondano i micronuclei

stazionari dei partner. Si forma un nucleo diploide che andrà incontro a mitosi e genererà

un nuovo macronucleo e 2 micronuclei. Un altro modello è dato dalla riproduzione

sessuata di Chlamydomonas: quando due ceppi si uniscono possono generare una cellula

diploide che può compiere meiosi formando 4 nuovi organismi aploidi. Nei batteri e nei

parameci parliamo di sessualità mentre in Chlamydomonas parliamo di riproduzione in

quanto il numero di individui aumenta. L’uovo del riccio di mare è

particolarmente complesso.

Presenta un involucro gelatinoso

che attira lo spermatozoo e offre

protezione. Subito sotto c’è

un’altra membrana chiamata

membrana vitellina a livello della

quale si fermano gli spermatozoi.

Osserviamo poi la membrana

plasmatica al di sotto della quale

si trovano i granuli corticali. Nel

citoplasma ci sono i soliti

organelli e il nucleo è centrale.

Anche nei mammiferi gli

spermatozoi si legano a livello

della zona pellucida.

Lo spermatozoo si muove grazie al flagello. Se si effettua una sezione trasversale del

flagello di spermatozoo di mammifero si osservano l’assonema centrale con le fibre

esterne. L’assonema presenta la struttura 9+2 ed è formato da 9 coppie di microtubuli

periferici e da 2 coppie di microtubuli centrali. Le 9 coppie periferiche sono costituite da

2 microtubuli uniti tra loro: un tubulo A (con 2 bracci di dineina che si protendono verso

i tubuli B) completo e un tubulo B che si associa al tubulo A per completarsi. La

fecondazione avviene ad opera di un solo spermatozoo mentre gli altri verranno

allontanati.

La riproduzione sessuale è estremamente complicata eppure è la modalità di

riproduzione che caratterizza gli organismi più evoluti. Il problema del sesso è quindi

comprendere quali benefici esso comporti a fronte dei suoi costi, in modo da poterne

giustificare la comparsa e la diffusione per selezione naturale nel corso dell’evoluzione.

L’ipotesi del Red Queen è un’ipotesi evolutiva che spiega il vantaggio della riproduzione

sessuale. Il sesso è necessario per rimanere in gara coevolutiva contro i propri parassiti. I

genomi dei microparassiti (virus, batteri) evolvono rapidamente. Un clone per la sua

omogeneità genetica e superiore potenzialità riproduttiva è un bersaglio più vulnerabile

per i microparassiti rispetto ad una popolazione sessuale rappresentata da molti genomi

diversi in quanto ricombinati, per cui quest’ultima potrebbe recuperare il costo della

sessualità in termini di fitness. Il principale beneficio del sesso sarebbe che esso consente

di contrapporre alla roulette genetica dei microparassiti, in grado di produrre sempre

nuovi genomi per mutazione, la roulette genetica della sessualità in grado di produrre

sempre nuovi genomi attraverso i meccanismi della segregazione cromosomica,

ricombinazione allelica e cariogamia. Di fronte all’attacco di un microparassita molto

aggressivo, l’estinzione di un clone può essere scongiurata solo da una nuova mutazione

efficace. In una popolazione sessuale, invece la diversificazione ricombinativa dei genomi

è già una difesa efficace contro l’estinzione, anche in assenza di nuove mutazioni.

Nella storia si sono avute 2 linee di pensiero: la linea di pensiero dell’epigenetica e la

linea di pensiero del preformismo. L’epigenetica è una branca della genetica che studia le

proprietà delle cellule che vengono modificate dall’ambiente nel quale vivono. Il

preformismo afferma che nello spermatozoo si trova già precostituito in miniatura, con

tutte le sue parti, l’animale adulto.

Nel citoplasma della cellula uovo oltre al nucleo si trovano mRNA materni. Questi sono

estremamente labili ma sono presenti fino a circa i 50 anni d’età. Ciò è possibile in

quanto questi mRNA sono protetti grazie a proteine dalle RNasi. Anche a livello dello

spermatozoo sono presenti mRNA e RNA non codificanti che intervengono nei processi

epigenetici.

L’analisi sintetica dello sviluppo tiene conto del fatto che gli eventi molecolari, le risposte

e le interazioni cellulari e lo sviluppo dell’embrione si controllano l’un l’altro in modo

ciclico.

Tra i vertebrati il principe dei modelli è il modello di Zebrafish. La fecondazione è esterna

e i gameti vengono rilasciati in acqua. Lo sviluppo embrionale avviene a carico delle

riserve presenti nella cellula uovo. La segmentazione porta lo zigote da una forma

unicellulare a una forma pluricellulare. Le cellule si formano sopra il tuorlo. La

segmentazione prosegue, inizia la gastrulazione e quindi il differenziamento dei foglietti

embrionali e infine si ha l’organogenesi. La fase embrionale termina nel momento della

schiusa e si ottiene la larva. Dalla larva si passa poi allo stato adulto e, raggiunta la

maturità sessuale, verranno di nuovo prodotti i gameti. Altro modello è quello degli

anfibi come Xenopus. In questo caso la segmentazione è totale. La fase larvale ossia il

girino è una forma di vita acquatica. Con la metamorfosi si avrà lo sviluppo degli arti e

quindi il passaggio alla terra ferma. La metamorfosi avviene grazie a dei segnali. Ultimo

modello è quello mammifero del topo. In questo caso sia la fecondazione sia lo sviluppo

dell’embrione avvengono all’interno delle vie genitali femminili. Viene

definito neotenia il fenomeno evolutivo per cui negli individui adulti di una specie

permangono caratteristiche morfologiche e fisiologiche tipiche delle forme giovanili. Tra i

caratteri neotenici nell’adulto vi sono teste proporzionalmente grandi e gambe

proporzionalmente corte.

Vediamo quali sono le tecniche classiche per lo studio della biologia dello sviluppo.

L’analisi dei frammenti di DNA è stata resa molto più veloce e potente dall’applicazione

della tecnologia dei microarray o biochip, che è stata sviluppata negli anni ‘90 del secolo

scorso. Si tratta di sottili supporti di materiale plastico o vetro su cui si trovano molte

migliaia di pozzetti, ciascuno contenente pochi picogrammi di una diversa sonda di DNA

a singola elica. I biochip vengono sfruttati per identificare la presenza e l’espressione di

un gene in un dato tipo cellulare o, più in generale, per tracciare il profilo di espressione

di quel tipo cellulare in un dato momento. Sfruttando il gran numero di pozzetti, infatti,

è possibile effettuare in un solo test la ricerca contemporanea di moltissimi geni,

realizzando in poche ore quel che un tempo avrebbe richiesto anni di lavoro di

laboratorio. Questa tecnica è stata scavalcata dalla tecnica RNA-seq. Nella tecnica Whole-

mout in situ hybridisation l’embrione viene fissato e reso permeabile alla sonda

d’interesse marcata. In questo modo si può verificare dove si trova e quanto è presente

quel gene o quella proteina.

Segnali cellulari

La membrana è un doppio strato fosfolipidico. La maggior parte delle proteine

transmembrana presentano un dominio extracellulare, uno o più domini transmembrana

e un dominio citoplasmatico. Altre proteine sono ancorate al doppio strato lipidico

mediante un lipide legato covalentemente alla proteina o direttamente o mediante uno

zucchero. Altre proteine sono legate alla membrana mediante adsorbimento a proteine

transmembrana. Molte delle proteine di membrana sono glicoproteine dal momento che il

loro dominio extracellulare è caratterizzato dalla presenza di carboidrati. Le cellule

possono ricevere un segnale detto ligando (che verrà inglobato tramite meccanismi di

endocitosi, fagocitosi ecc.) o possono esse stesse segnalare producendo delle molecole

che verranno trasportate all’esterno con diversi meccanismi (es. esocitosi). Tra le proteine

transmembrana ci sono per esempio le caderine. Le caderine, una volta organizzatesi in

dimeri, prendono connessione tramite il loro dominio extracellulare con le caderine

presenti su cellule adiacenti. A livello citoplasmatico le caderine prendono contatto con

altre proteine che regolano il citoscheletro della cellula. Le proteine di membrana

implicate nel trasporto attraverso la membrana possono agire come canali o come

proteine trasportatrici o carriers. I canali si aprono in presenza di segnali specifici e sono

responsabili di un trasporto passivo (diffusione). I carriers sono responsabili di un

trasporto attivo che invece richiede energia.

Una cellula segnale può secernere molecole segnale che si andranno a legare a livello di

un recettore presente su un’altra cellula. Si parla in questo caso di segnalazione tramite

molecole secrete e non è richiesta vicinanza tra la cellula che segnala e la cellula

bersaglio. Una cellula segnale può presentare sulla superficie molecole segnale che

verranno poi riconosciute da un recettore su un’altra cellula. Si parla in questo caso di

segnalazione tramite molecole di membrana plasmatica ed è richiesta vicinanza tra le due

cellule coinvolte. Se le cellule sono lontane tra loro il segnale entra nel torrente

circolatorio e raggiunge il target attraverso un meccanismo d’azione endocrino (ormoni).

Se le cellule sono vicine tra loro si parla di segnalazione locale che avviene mediante un

meccanismo d’azione paracrino. Se invece le cellule si autoregolano si parla di

comunicazione autocrina: è la cellula stessa che libera e risponde al segnale da essa

stessa emesso. Altra segnalazione importante ed estremamente rapida è la segnalazione

sinaptica che avviene grazie a neurotrasmettitori. Esiste anche una segnalazione

mediante giunzioni GAP. Le cellule connesse dalle giunzioni GAP condividono piccole

molecole, comprese le piccole molecole segnale intracellulari, e possono perciò

rispondere a segnali extracellulari in modo coordinato.

Le cellule che non ricevono segnali vanno incontro a morte cellulare programmata. Le

cellule sono in grado di sopravvivere se sono presenti segnali di base per le funzioni

essenziali. Se sono presenti anche segnali aggiuntivi allora le cellule sono in grado di

proliferare.

Uno stesso segnale non dà necessariamente sempre una stessa risposta. Il tipo di risposta

cellulare dipende dal bersaglio e dal recettore presente sul bersaglio. Consideriamo per

esempio l’acetilcolina. A livello del muscolo scheletrico l’acetilcolina induce l’apertura dei

canali ionici con conseguente contrazione. A livello del muscolo cardiaco l’acetilcolina ha

un effetto completamente opposto in quanto determina un rilassamento della cellula. A

livello delle cellule secretorie l’acetilcolina stimola la secrezione.

I recettori sul bersaglio possono essere recettori superficiali in caso di molecola segnale

idrofilica (proteina) o recettori intracellulari in caso di molecola segnale idrofobica

(ormoni steroidei, cortisolo). Quindi i recettori superficiali legano molecole polari che non

sono in grado di attraversare il doppio strato fosfolipidico della membrana cellulare. Per

quanto riguarda i recettori superficiali questi si possono trovare a livello del nucleo

(segnali genotropici) o a livello del citoplasma (il recettore trasloca solo successivamente

nel nucleo).

I recettori intracellulari per i segnali idrofobici sono formati da un domino che lega il

DNA, da un sito di legame dell’ormone a livello dell’estremità COOH e da un complesso

che attiva la trascrizione a livello dell’estremità NH . In assenza di segnale questo

2

recettore è legato a un complesso proteico inibitorio e non lega il DNA. Il legame del

segnale al recettore porta a una modifica conformazionale del recettore causando il

distacco del complesso proteico inibitorio. A questo punto il recettore può legarsi al DNA

a livello di sequenze specifiche che sono note. Il legame porterà alla trascrizione dei geni

target.

Le molecole segnale hanno tutte una base composta da colesterolo. Gli ormoni steroidei

inducono una risposta primaria che porta alla produzione di proteine specifiche che sono

a loro volta responsabili di una risposta secondaria. A volte affinché ci sia una risposta

sono necessari 2 segnali diversi che hanno come bersaglio la stessa proteina. La proteina

verrà fosforilata in 2 punti diversi. I 2 segnali possono anche agire su 2 proteine diverse.

Queste, una volta fosforilate, si complesseranno e si attiveranno.

Il recettore può essere legato a un canale ionico, a una proteina G o a un enzima. I

recettori che si legano a proteine G sono molto frequenti e sono definiti recettori 7-TM (7

pass transmembrane protein).

Il cAMP è un secondo messaggero molto importante. Esempi di risposte cellulari indotte

da ormoni mediate da cAMP sono: sintesi e secrezione dell’ormone tiroideo, secrezione di

cortisolo, secrezione di progesterone, demolizione del glicogeno, riassorbimento

dell’osso ecc.

La chinasi A inattiva presenta 4 subunità di cui 2 catalitiche e 2 regolatrici. Le chinasi

fosforilano proteine citoplasmatiche inducendo la risposta cellulare.

Un altro secondo messaggero molto importante è lo ione calcio. Il calcio è sempre

presente a livello cellulare. All’interno della cellula la concentrazione di calcio è di 10 M

-7

mentre all’esterno è di 10 M. Nel citoplasma il calcio è compartimentalizzato (si trova a

-3

livello dei mitocondri e del reticolo endoplasmatico). Alcune molecole sono in grado di

sequestrare il calcio (calmodulina).

Alcuni componenti della membrana, grazie a dei segnali, possono andare incontro a

modificazioni. Un esempio è dato dalle catene degli acidi grassi dei fosfolipidi. In seguito

a un segnale si attiva una specifica chinasi PI che va a fosforilare il fosfatidilinositolo (PI)

e si forma fosfatidilinositolo 4-fosfato (PIP). Un’altra specifica chinasi PIP va a fosforilare

il fosfatidilinositolo 4-fosfato e si forma fosfatidilinositolo 4,5-bisfosfato (PIP ). A questo

2

punto la fosfolipasi C-β taglia il PIP in due molecole ossia il diacilglicerolo (attiva la

2

proteina chinasi C determinando risposte cellulari) e l’inositolo1,4,5-trifosfato (IP ) (attiva

3

la via del calcio).

Esistono diverse proteine G (G , G ecc) ognuna con funzioni diverse.

s olf

Altra classe di recettori è rappresentata dai recettori dotati di attività enzimatica. Un

esempio è dato dai recettori delle efrine. Le efrine sono segnali coinvolti nella migrazione

delle cellule della cresta neurale. Il legame con le efrine media la dimerizzazione dei

recettori. Anche il recettore del GH dimerizza.

Fecondazione

Ci occuperemo di 2 modelli sperimentali: studieremo infatti la fecondazione esterna nel

riccio di mare e la fecondazione interna nei mammiferi. In generale c’è una grande

difficoltà di incontro tra i gameti maschili (spermatozoi) e i gameti femminili (cellula

uovo). Il movimento dello spermatozoo verso la cellula uovo è guidato da molecole

prodotte dall’uovo o da altre componenti della gonade, un processo noto come

chemiotassi.

Riccio di mare

Occupiamoci in primis del riccio di mare. I gameti vengono rilasciati all’esterno e si

possono trovare anche molto distanti tra loro. Inoltre non è detto che l’incontro fra i

gameti venga sempre facilitato dalle correnti d’acqua. Sono dunque necessari dei

meccanismi che facilitino l’incontro in acqua dei gameti. Dai gameti di riccio di mare sono

state isolate diverse molecole attraenti una, chiamata “resact”, un piccolo peptide

formato da 14 amminoacidi, si trova nell’involucro gelatinoso più esterno della cellula

uovo. A basse concentrazioni, resact attrae gli spermatozoi in modo specie-specifico, ad

alte concentrazioni invece gli spermatozoi perdono la capacità di rispondere alla sua

azione perché la risposta è dovuta a recetto