Appunti domande di esame e risposte svolte

Microbiologia

Fermentazione omolattica ed alcolica

La fermentazione è un metabolismo in cui il donatore e l'accettore di elettroni sono entrambi composti organici. Pasteur la definì come "vita in assenza di ossigeno" ed infatti i moo che fanno fermentazione sono chemiorganotrofi anaerobi o anaerobi facoltativi. Questo metabolismo non è in grado di produrre potere riducente, in quanto il substrato ed il prodotto hanno lo stesso livello di ossidazione, mentre la produzione di ATP avviene a livello di substrato, con una bassa resa energetica (il composto non è completamente ossidato). Tutti i moo sono in grado di utilizzare come fonte di energia il glucosio, il quale subisce numerose trasformazioni distinguibili in due parti.

Il glucosio può seguire 5 vie diverse durante la parte ossidativa: glicolisi, warburg/dickens, entner/dourdorof, via dei bifidobatteri e via dei pentoso fosfati. Durante la parte riduttiva, in cui il carbonio ripristina il livello d'ossidazione, va incontro a 5 diversi tipi di fermentazioni: omolattica, alcolica, propionica, butirrica, aceton­butirrica, acido­mista.

La fermentazione omolattica è un tipo di fermentazione sfruttata dai batteri lattici in cui le due molecole di piruvato, derivate dalla glicolisi del glucosio, vengono ridotte a lattato grazie alla lattato deidrogenasi e al consumo di NADH. La resa in termini di ATP è di 2, ossia quelli prodotti durante la parte ossidativa del glucosio. Il lattato può essere usato come sostituto della plastica, in quanto capace di generare polimeri resistenti, ma biodegradabili. Per poter realizzare la polimerizzazione del composto è necessario spostare l'equilibrio verso il prodotto, aggiungendo acidi forti. Tuttavia gli acidi non sono ben tollerati dai batteri lattici. Si può invece manipolare funghi e lieviti, che sono acidotolleranti/acidofili per la produzione del polimero lattico.

La fermentazione alcolica è un tipico metabolismo di funghi e lieviti, in cui due moli di piruvato vengono dapprima decarbossilate ad acetaldeide, con liberazione di CO₂, poi ridotta dalla alcol deidrogenasi e NADH ad etanolo. La resa anche in questo caso è di soli due ATP.

Fasi di sviluppo dell’endospora batterica

L’endospora batterica è una forma di resistenza realizzata quasi esclusivamente dai gram+, a fronte di condizioni sfavorevoli per la crescita, come nutrienti limitanti o presenza di sostanze potenzialmente tossiche (antibiotici). Questa forma di quiescenza viene detta criptobiosi. L’habitat tipico dei batteri sporigeni è il suolo e sono tipicamente non patogeni o, in caso contrario, lo sono per produzione di tossine. Dato che la parete dei gram+ sporigeni cambia già nella fase stazionaria è stato difficile identificarli tramite colorazione di gram, per tale motivo la colorazione si fa in fase esponenziale.

Il ciclo vitale di uno sporigeno è suddiviso in 3 parti: crescita vegetativa, in cui la cellula cresce normalmente; sporulazione, la cellula si prepara alla produzione e rilascio della spora e dura generalmente 8h; germinazione, in cui l’attività metabolica riprende e la spora ritorna ad essere una cellula vegetativa, quando le condizioni ritornano favorevoli.

La resistenza della spora è unica, infatti resiste alle alte temperature, alla disidratazione, ai raggi UV, agli agenti chimici. È tale che alcune spore resistono anche per milioni di anni. Questa capacità ha costretto a rivedere le tecniche di sterilizzazione, poiché servono tempi più lunghi e temperature maggiori per eliminare le spore, ex. Clostridium botulinum 330min a 100°C. La resistenza è dovuta ai vari accorgimenti presi per proteggere il DNA e ai vari strati che costituiscono la spora.

• Core: è ciò che rimane della cellula vegetativa. Ha perso molta acqua, per rallentare l’attività metabolica ed al suo interno troviamo il dipicolinato di calcio, un polimero che serve per resistenza al calore e agli agenti ossidanti. Il pH è inferiore di una unità per la presenza delle proteine SAPS, le proteine acide deputate alla protezione del materiale genetico da parte di UV e calore, nonché come fonte di carbonio.
• Corteccia: un derivato del peptidoglicano in cui il NAM è in forma lattamica. Diminuiscono i legami B 1­4 in modo da dare maggior resistenza ad enzimi litici come lisozima e una struttura più elastica.
• Tuniche: costituiscono circa il 50% del volume della spora e sono fatte di diversi strati proteici lamellari o fibrillari. Troviamo molti ponti disolfuro ed hanno una struttura simile alla cheratina, resistenza meccanica e chimica.
• Esosporio: infine, non è sempre presente ed è lo strato più esterno e sottile. È composto da proteine, lipidi e zuccheri similmente ad una membrana plasmatica.

Sostanzialmente sono 8 le tappe dello sviluppo della spora ed è regolato da più di 200 geni.

1. Viene in primo luogo duplicato il DNA.
2. La cromatina si dispone assialmente all’interno della cellula.
3. La membrana si ripiega a formare un setto che separerà la prespora dalla cellula madre, la cellula si chiama ora sporangio.
4. La terza fase è irreversibile e prevede l’inglobamento della prespora da parte della cellula madre. La seconda membrana fungerà da esosporio, mentre tra le due membrane si formeranno corteccia e tuniche.
5. Inizia la fase di disidratazione (la spora ha circa il 30% di H₂O rispetto alla cellula vegetativa), inoltre accumula il calcio. Si predispone la corteccia, una struttura simile alla parete di peptidoglicano, ma presenta NAM in forma lattamica, ossia ha meno legami beta 1­4 rendendo la struttura più resistenza a enzimi idrolitici e conferisce maggior elasticità.
6. Inizia la produzione delle SAPS, e di dipicolinato di calcio che costituirà il 10% del peso secco della spora.
7. Si completa la maturazione della spora aggiungendo man mano le tuniche proteiche.
8. La cellula ora è pronta alla lisi e a rilasciare la spora.

La germinazione

La germinazione è il processo opposto alla sporulazione ed è suddiviso in 3 parti:

1. Attivazione: è una fase indispensabile, ma reversibile. Viene innescata da alanina, glucosio e temperatura. Non si osservano cambiamenti morfologici, ma solo un riarrangiamento molecolare all’interno.
2. Germinazione: rapido cambiamento morfo­fisiologico in seguito a stimolo chimico o meccanico. Si ha perdita di rifrangenza, resistenza e i coloranti diventano permeabili. Permangono le tuniche ed è una fase prettamente catabolica.
3. Esocrescita: assorbimento di acqua e fase di biosintesi, in primo luogo di molecole di RNA, poi di proteine e infine di DNA.

Antibiotici dello stadio citoplasmatico

La stragrande maggioranza dei batteri presenta una struttura essenziale detta parete cellulare, che è costituita tra l’altro da peptidoglicano, in misura differente a seconda se il batterio sia gram+ o gram­. Pertanto questi moo saranno sensibili agli antibiotici che inibiscono la biosintesi della parete. Gli antibiotici che inibiscono la biosintesi allo stadio citoplasmatico sono due:

• Fosfomicina: ossia un analogo strutturale del PEP. Impedisce la reazione tra NAG 1p, PEP e 2H a dare NAM, uno zucchero presente nel glicano, l’unità che costituisce il peptidoglicano nella parete. È prodotta dagli streptomiceti ed è un antibiotico ad ampio spettro.
• D­ciclo serina: un analogo strutturale della D­alanina. È un inibitore competitivo per due enzimi: la racemasi che converte la D­alanina in L­alanina, un AA che fa parte del nucleotide di Park (la parte peptidica del PG), e della sintetasi, l’enzima che catalizza la dimerizzazione della D­ala, essenziale per la formazione di legami diretti tra i residui peptidici dei glicani. Anch’esso è un antibiotico ad ampio spettro d’azione.

Tempo di duplicazione e velocità di crescita

Il tempo di duplicazione indica quanto tempo impiegano le cellule a sintetizzare tutte le componenti necessarie a dar origine ad una nuova generazione di cellule. La velocità di crescita invece indica quante generazioni si formano nell’unità di tempo. Per conoscere sia Td che V è necessario sapere quante generazioni si sono formate (n) nel tempo (t) partendo da un numero noto di cellule (No).

N= n. cellule N=No x 2ⁿ logN = nlog Nox2 logN=logNo+ nlog2 n= logN­logNo / log2 n=3.3 (logN­logNo) Td= T/n V = n/T.

La velocità di crescita ed il tempo di duplicazione vengono calcolati sempre durante la fase esponenziale di crescita del moo ed è fortemente influenzata dalle condizioni accessorie di crescita come T, nutrienti, O₂, pH ecc…

Fotosintesi anossigenica

La fotosintesi è un metabolismo che sfrutta una fonte potenzialmente inesauribile quale la luce solare. La fotosintesi percorre trasversalmente tutti gli organismi e tutta l’evoluzione, in quanto un sistema molto conservato ed efficiente per ricavare energia. I fototrofi sono gli organi che ricavano energia chimica dalla energia luminosa, mentre al buio l’energia chimica prodotta viene sfruttata per fissare la CO₂ (se fotoautotrofi) o sintetizzare composti organici da altri composti organici (se fotoeterotrofi). La produzione di ATP con la fotosintesi può avvenire in presenza o meno dell’ossigeno, infatti si distingue la fotosintesi anossigenica dalla fotosintesi ossigenica. Comunque sia la fotosintesi si sviluppa su 3 elementi essenziali: i pigmenti fotosintetici antenna, i centri di reazione e il sistema di trasporto degli è.

I pigmenti fotosintetici sono particolari molecole che riescono ad intercettare l’energia luminosa del fotone. Si suddividono generalmente in tre tipi: clorofille, carotenoidi e ficobiline.

• Clorofille: molecole la cui struttura prevede uno ione magnesio al centro di un 4 anelli pirrolici disposti in una struttura macrociclica, con una lunga catena idrofobica per permettere l’immissione nella membrana plasmatica dove avviene l’evento fotosintetico. La diversa composizione delle catene laterali determina lo spettro di assorbimento della molecola e il tipo d’appartenenza (da a a g).
• Carotenoidi: molecole a base idrocarburica che contribuiscono non solo alla cattura del fotone, ma anche alla protezione. Tra essi troviamo il beta­carotene e il licopene.
• Ficobiline: proteine coniugate a molecole pirroliche a struttura lineare dette ficoeritrine o ficocianine, presenti solo per la fotosintesi ossigenica. Formano strutture dette ficobilisomi che si posizionano nei tilacoidi, membrane a forma lamellare deputati alla fotosintesi.

Per rendere la reazione più veloce ed efficiente i pigmenti fotosintetici si dispongono in gruppi da 50­300 molecole, con lo scopo di trasferire rapidamente l’energia luminosa a particolari clorofille dette centri di reazione. L`energia luminosa viene trasferita dai pigmenti antenna al centro di reazione in pacchetti detti eccitoni, uno stato elettronico a singoletto che migra dai pigmenti antenna al centro di reazione con alta efficienza. Il processo fotosintetico ha inizio quando l'energia degli eccitoni colpisce le molecole di clorofilla. L’assorbimento di energia eccita queste molecole di clorofilla convertendole in forti riducenti, in grado di ridurre una molecola accettrice con un potenziale molto basso. L`eccitazione della clorofilla rappresenta quindi l'effetto dell'energia luminosa sul sistema.

Gli elettroni eccitati riducono una molecola di feofitina del centro di reazione. Una volta ridotta, la feofitina riduce una molecola di chinone che, pur facendo parte del centro di reazione, è più vicina alla superficie esterna della membrana fotosintetica. Il chinone è l'accettore primario di elettroni. Dal chinone, gli elettroni vengono trasportati nelle membrane attraverso una serie di proteine ferro­zolfo e citocromi e ritornano alla fine al centro di reazione. Le proteine chiave per il trasporto degli elettroni includono il citocromo bc, e il citocromo c. Il citocromo c è localizzato nello spazio periplasmico e funziona da collegamento tra il citocromo bc legato alla membrana e il centro di reazione. La sintesi di ATP durante il flusso fotosintetico di elettroni è il risultato della formazione di un gradiente protonico generato dall'estrusione di protoni che si verifica durante il trasporto di elettroni ed all'attività dell'ATPasi accoppiata alla dissipazione del gradiente protonico. La serie di reazioni si completa quando il citocromo c2 trasferisce gli elettroni alle clorofille riportando queste molecole al loro potenziale originale. Il centro di reazione è quindi in grado di assorbire nuova energia e ripetere il processo.