Appunti Diagnostica metabolica in vivo

Diagnostica metabolica in vivo e la biochimica clinica

La biochimica clinica è la branca della medicina di laboratorio che studia le variazioni dei diversi parametri biochimici nel singolo individuo in condizioni fisiologiche, in caso di patologia o in seguito all’assunzione di farmaci all’interno di opportuni campioni biologici. Questo avviene al fine di prevenire, diagnosticare o curare uno stato di malattia. La biochimica clinica di base rappresenta le nozioni necessarie per comprendere il processo di produzione di un risultato di laboratorio e i criteri per valutare il valore e i limiti metodologici e interpretativi del risultato medesimo, mentre la biochimica clinica specialistica comprende l’analisi di diversi analiti, considerati singolarmente o in gruppi omogenei dal punto di vista biochimico e/o fisiopatologico.

Tipologie di campioni biologici

I campioni biologici possono essere diversi, ma la maggior parte degli esami sono svolti su campioni di sangue venoso oppure urine (in misura minore sulle feci) in quanto sono facilmente accessibili e necessitano di metodiche di prelievo non invasive (raccolta feci e urine) o scarsamente invasive (prelievo ematico). È importante sapere che esistono indagini laboratoristiche invasive su altri campioni biologici, come l’analisi del liquido pleurico, del liquido gastro-intestinale (attraverso un sondino naso-gastrico) e del liquido cefalorachidiano (contenuto all’interno dei ventricoli, del canale centrale midollare e dello spazio subaracnoideo).

Metodiche diagnostiche

Le metodiche diagnostiche possono essere distinte in metodiche in vivo che sono eseguite su un tessuto vivente all’interno dell’organismo (come l’ecografia o la spettroscopia di risonanza magnetica) e in metodiche ex vivo che sono eseguite su un tessuto vivente all’esterno dell’organismo (come gli esami ematici e le biopsie). L’esame di laboratorio è il procedimento volto ad evidenziare la presenza o a misurare la quantità di un costituente biochimico in un campione biologico e può essere qualitativo, semiquantitativo (misure relative) o quantitativo (misure assolute).

N.B. Solitamente, si tende ad utilizzare metodiche di indagine quantitative in modo da rendere confrontabili i diversi esami eseguiti su uno stesso paziente nel tempo e rendere possibile il confronto fra pazienti diversi.

Il processo diagnostico prevede l’analisi dei sintomi, della storia clinica e dei segni obiettivi del paziente per giungere ad un’ipotesi diagnostica che è confermata o smentita grazie all’utilizzo di indagini strumentali mirate che possono portare ad una diagnosi finale.

I biomarcatori

I biomarcatori sono delle caratteristiche che possono essere misurate in maniera oggettiva e fungono da indicatori di un normale processo biologico, di un processo patologico o della risposta ad una terapia. Essi sono utilizzati per la diagnosi precoce, per la prevenzione di una malattia o per monitorare l’efficacia di una terapia.

È possibile distinguere una classe di biomarcatori pre-clinici che sono ricercati in soggetti privi di sintomi ed una classe di biomarcatori clinici che sono ricercati nei soggetti che presentano determinati sintomi. Inoltre, è possibile distinguere fra biomarcatori in vivo ed ex vivo, molecolari o di imaging. I biomarcatori possono essere classificati anche in base alla modalità con cui sono raccolte le informazioni in marcatori biochimici, biofisici, radiologici, fisiologici, genetici, immunologici, patologici, clinici e morfologici.

[Un esempio di biomarcatore fisiologico sono i livelli di ormone luteinizzante LH durante la fase luteinica del ciclo ovarico e degli esempi di biomarcatori patologici sono la presenza di glucosio nelle urine o la presenza delle transaminasi nel sangue]

I biomarcatori possono essere distinti anche in biomarcatori di tratto quando indicano una suscettibilità ad una patologia (sono misurati in soggetti sani), biomarcatori di stato quando hanno un indice diagnostico per una malattia specifica e biomarcatori di progressione quando permettono di monitorare la progressione di una patologia e la risposta terapeutica.

Caratteristiche dei biomarcatori ideali

• Facile reperibilità e scarsa invasività.
• Basso costo.
• Specificità e sensibilità.
• Riproducibilità (errore della misura deve essere minore possibile).
• Correlazione fisiopatologica alla malattia in esame.

N.B. Non è possibile avere contemporaneamente una sensibilità ed una specificità massime, quindi quando è necessario individuare tutti gli individui malati si preferisce avere una sensibilità più alta possibile, mentre quando è necessario individuare tutti i soggetti sani si preferisce avere una specificità più alta possibile.

Metodi di determinazione di un biomarcatore

1. Biased quando si ricerca uno specifico biomarcatore che è conosciuto essere correlato patogeneticamente alla malattia in esame (come ad esempio l’utilizzo di anticorpi specifici nelle malattie infettive).
2. Unbiased quando sono esaminati contemporaneamente un alto numero di possibili biomarcatori e solo pochi di essi sono candidati sulla base della potenza del segnale e/o della plausibilità biologica.

Proteomica.
Metabolomica.
Gene expression profiling.

I test diagnostici

I test diagnostici sono delle analisi di laboratorio che permettono di individuare dei biomarcatori come indice di una malattia. È necessario confrontare i valori ottenuti nel contesto clinico di un paziente con quelli di una popolazione uniforme sana di controllo, da cui il paziente stesso è tratto, in modo da individuare un intervallo di valori di riferimento al di fuori del quale si presume possa sussistere un’anomalia con un limite di errore accettabile (i valori limite sono detti cut-off).

I valori di riferimento sono scelti in base alla finalità del test in quanto essi sono espressione di grandezze continue che presentano una distribuzione normale gaussiana e variano in funzione di numerosi fattori quali la fascia di età, il sesso, l’etnia, il gruppo sanguigno, le abitudini di vita, l’alimentazione, le condizioni fisiologiche (come il ciclo mestruale e la gravidanza) e l’ambiente di vita.

[Alcuni criteri di esclusione per lo studio dei valori di riferimento associati ad uno stato di salute sono lo stato di gravidanza, un intenso esercizio fisico, la presenza di malattie, la presenza di fattori di rischio come l’obesità, l’ipertensione, i fattori di rischio lavorativi e genetici e l’assunzione di farmaci, di alcool, di tabacco e di droghe]

[Le principali fasce di età utilizzate nello studio dei valori di riferimento sono la fascia pre-puberale, la fascia adulta post-puberale e pre-menopausale e la fascia anziana delle donne post-menopausa e degli uomini dopo la sesta decade]

N.B. Generalmente, l’intervallo dei valori normali comprende l’intorno del valore medio con un’ampiezza di 2 deviazioni standard (valore medio ± 2 deviazioni standard) in modo da contenere circa il 95% della popolazione normale. Quando si effettua un test di laboratorio, la situazione più frequente è che i valori molto alti di un analita indichino la presenza di una malattia, che i valori molto bassi indichino l’assenza della malattia e che i valori intermedi siano compatibili sia con la presenza che con l’assenza di malattia a causa della sovrapposizione parziale della curva di distribuzione della popolazione sana e della popolazione malata. In questi casi, è possibile variare il valore di cut-off o valore soglia per cercare di separare al meglio le due popolazioni.

N.B. Si definisce positivo un risultato che supera il valore soglia e negativo un valore che è inferiore al valore soglia. I veri positivi (VP) sono i soggetti malati che risultano positivi al test, i falsi positivi (FP) sono i soggetti sani che risultano positivi al test, i veri negativi (VN) sono i soggetti sani che risultano negativi al test ed i falsi negativi (FN) sono i soggetti malati che risultano negativi al test.

La sensibilità di un test è la capacità di identificare correttamente i soggetti malati ed indica la proporzione dei soggetti malati che risultano positivi al test.

La specificità di un test è la capacità di identificare correttamente i soggetti sani ed indica la proporzione dei soggetti sani che risultano negativi al test.

N.B. Una sensibilità ed una specificità del 50% corrispondono alla casualità.

Il valore predittivo positivo (VPP) di un test è la probabilità che un individuo positivo al test sia davvero malato e rappresenta la proporzione dei soggetti positivi al test effettivamente ammalati.

Il valore predittivo negativo (VPN) di un test è la probabilità che un individuo negativo al test sia davvero sano ed indica la proporzione dei soggetti negativi al test effettivamente sani.

Ad esempio, in Italia la prevalenza dell’infezione da HIV nelle persone non tossico-dipendenti che non hanno comportamenti sessuali a rischio è di 0,01%. La probabilità che una persona affetta risulti positiva al test è del 99,99% e la probabilità che una persona sana risulti negativa è del 99,99% (quindi la percentuale di falsi positivi si assesta intorno allo 0,01%). Prendendo in esame 10.000 persone non tossico-dipendenti e senza comportamenti sessuali a rischio, una persona sarà affetta da HIV e 9.999 saranno sane di cui una persona sarà falsamente positiva per cui in tutto due persone risulteranno positive al test quindi la probabilità che un individuo positivo al test sia affetto da HIV è del 50%.

Ad esempio, se nel test della glicemia utilizziamo un valore cut-off basso, come ad esempio 90 mg/dl, saranno presenti pochissimi pazienti diabetici con glicemia inferiore a 90 mg/dl ed il test avrà una sensibilità molto alta, tuttavia saranno presenti numerosi falsi positivi (soggetti normali con glicemia superiore a 90 mg/dl) e la specificità sarà molto scarsa. Se, invece, utilizziamo un valore cut-off molto alto, come ad esempio 140 mg/dl, si ottiene una specificità molto elevata in quanto non saranno presenti falsi positivi, ma in questo intervallo di normalità sono compresi dei soggetti diabetici negativi (falsi negativi) quindi la sensibilità del test è molto scarsa. Quindi, per evitare di utilizzare test costosi di accertamento della diagnosi come un dosaggio ormonale o una curva da carico per il glucosio il valore normoglicemico è compreso fra 90 e 110 mg/dl.

Le analisi di laboratorio

Le caratteristiche da valutare quando è prescritto un esame di laboratorio sono l’appropriatezza, il costo, il grado di invasività, la presenza di controindicazioni, la presenza di possibili effetti collaterali o complicanze, la possibilità di ottenere un consenso informato e la collaboratività del paziente. Inoltre, è importante preparare in maniera adeguata il paziente al test in quanto alcuni comportamenti possono alterare i risultati di un test. Ad esempio, in caso di esame del sangue è necessario sottoporsi ad un digiuno per evitare risultati errati nei valori di glicemia ed assetto lipidico. In caso di sospetto di patologia muscolare e dosaggio degli enzimi di danno muscolare è necessario non praticare attività fisica nei giorni precedenti al test oppure per i dosaggi ormonali è necessario effettuare i prelievi a specifici orari.

Quando si effettua un test di laboratorio è necessario considerare:

• Indicazioni cliniche e finalità diagnostiche: esistono numerose condizioni per la richiesta dei test di laboratorio. In particolare, i test di screening sono utilizzati per la valutazione delle alterazioni biochimiche in fase pre-clinica su soggetti sani a rischio (ad esempio i test prenatali o neonatali per malattie genetiche), i test diagnostici permettono l’inquadramento della malattia, i test di stadiazione permettono di classificare lo stadio di una malattia neoplastica, i test di follow-up permettono di controllare l’evoluzione della malattia e gli effetti della terapia (ad esempio l’enzima carcino-embrionario o CEA è prodotto durante lo sviluppo embrionale e da alcune tipologie di tumori) e i test di dosaggio farmacologico permettono l’ottimizzazione del trattamento terapeutico e l’individuazione della posologia ottimale (utilizzato soprattutto nella terapia con antiepilettici ed anticoagulanti).
• Controindicazioni e rischi per il paziente: ad esempio, i pazienti affetti da coagulopatie possono subire dei forti problemi in caso di prelievo venoso.
• Modalità di prelievo (standardizzate).
• Tipologie di analisi.

Quindi, le principali finalità di un test di laboratorio sono la formulazione diagnostica che permette di confermare o escludere un sospetto diagnostico da parte del medico clinico, il monitoraggio terapeutico o del decorso di una malattia e la diagnosi precoce nei soggetti a rischio prima della comparsa dei sintomi (screening). Ne sono esempio la valutazione su sangue venoso dei livelli di transaminasi in corso di epatite (le transaminasi possono aumentare anche in caso di infarto miocardico o patologia muscolare), i livelli di CEA in corso di carcinoma, il tempo di protrombina per monitorare la terapia anticoagulante in seguito ad infarto, i livelli di emoglobina glicosilata per il monitoraggio del paziente diabetico in terapia (in quanto è indice del livello di glicemia nelle settimane precedenti all’esame) e l’esame emocromocitometrico per valutare la tossicità dei farmaci antitumorali e la diagnosi delle anemie (in quanto fornisce informazioni sulla porzione corpuscolata del sangue).

Le analisi di laboratorio a disposizione del medico sono di diversa complessità, di diverso costo e di diverso significato e possono essere classificate in:

1. Analisi singole o test mirati: permettono di fornire una risposta ad una domanda clinica specifica; ne è esempio il dosaggio del glucosio. Questa tipologia di analisi può fornire gli elementi necessari per confermare o escludere una determinata diagnosi oppure per modificare un trattamento in atto e può essere effettuata su un campione singolo anche se frequentemente presenta una scarsa sensibilità e specificità diagnostica.
2. Profili metabolici/biochimici generali: in cui sono effettuati più esami contemporaneamente sullo stesso campione per misurare parametri fra loro correlati per ottenere un maggior numero di informazioni circa la funzionalità di un organo o di un tessuto; ne sono esempio il dosaggio delle transaminasi, della bilirubina e dell’albumina per la valutazione della funzionalità epatica. Questa tipologia di analisi è molto utile e di costo inferiore rispetto alle singole analisi in quanto richiede un singolo prelievo e può fornire tutti i dati per formulare una diagnosi preliminare.
3. Prove di funzionalità dinamica: in cui si valuta la risposta ad uno stimolo standardizzato; ne è esempio la curva da carico del glucosio e gli studi endocrinologici (sono utilizzati quando i valori plasmatici o urinari di un ormone sono ai limiti della norma per valutare la capacità di una ghiandola di rispondere agli stimoli e per fornire informazioni circa la sua funzionalità). Questa tipologia di analisi richiede una standardizzazione molto accurata e l’esecuzione solitamente è più difficile, costosa e fastidiosa rispetto alle singole analisi o al profilo biochimico.

Ad esempio, in caso di sospetto di una disfunzione tiroidea è necessario prescrivere il dosaggio degli ormoni tiroidei, principalmente del T₄ in quanto T₃ è la sua forma attivata nel sangue, e del TSH in quanto la secrezione di ormoni tiroidei da parte della ghiandola tiroide è subordinata alla secrezione da parte dell’adenoipofisi di ormone tireostimolante TSH. In caso di ipertiroidismo dovuto ad un adenoma, cioè ad un tumore dell’adenoipofisi, i valori di TSH risultano elevati, mentre in caso di ipertiroidismo dovuto ad una malattia immunitaria o ad un tumore a livello tiroideo il valore di T₄ risulta essere molto elevato e quelli del TSH risultano bassi a causa di un meccanismo a feedback negativo sulla secrezione di TSH. Molto spesso, a fronte dei sintomi che possono far sospettare una disfunzione tiroidea, il dosaggio di ormoni non è sufficiente e quindi bisogna optare per prove di funzionalità dinamica. Ad esempio, in caso di ipotiroidismo è necessario sottoporre il paziente alla somministrazione dell’ormone ipotalamico TRH che stimola la produzione di TSH e misurare la concentrazione ematica di TSH nelle successive tre ore: in un paziente sano il TSH aumenta rapidamente fino a raggiungere un picco dopo 30 minuti e nelle successive due ore e mezzo i livelli tornano nella norma, in caso di un ipotiroidismo tiroideo si verifica un aumento enorme oltre il limite della norma con un andamento simile a quello dei soggetti sani, in caso di ipotiroidismo ipotalamico (condizione genetica rara dovuta all’iposecrezione di TRH da parte dell’ipotalamo) i livelli di TSH aumentano lentamente.